丹蔞片對(duì)大鼠H9c2心肌細(xì)胞缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及凋亡信號(hào)通路的影響*

譚亞芳， 祁建勇， 梁瑋婷， 張敏州△

1廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)中醫(yī)藥應(yīng)用研究團(tuán)隊(duì)(廣東廣州 510120)； 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院(廣東廣州 510006)

近年來心血管疾病成為危害人類健康的頭號(hào)殺手。據(jù)報(bào)道，我國(guó)每年約有 350 萬人死于心血管疾病。缺血性心臟病是常見的心血管疾病,可誘發(fā)心絞痛及心肌梗死等疾病。當(dāng)前治療缺血性心臟病的主要手段有藥物治療、生活方式干預(yù)、外科手術(shù)治療以及經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)等。然而，目前的臨床治療效果仍有待提高，因此，深入研究如何預(yù)防和治療缺血性心臟病成為研究的熱點(diǎn)。中醫(yī)理論認(rèn)為，“氣虛血瘀”是心肌缺血重要的中醫(yī)病機(jī)。丹萎片秉承中醫(yī)幾千年的痰瘀同治法，具有通陽(yáng)散結(jié)、行氣祛痰的功效，被廣泛應(yīng)用于治療胸痹、心絞痛等心血管系統(tǒng)疾病，對(duì)急性心肌梗死、心律失常、心功能不全、心肌炎等均取得良好的臨床療效。臨床研究表明，丹蔞片可用于改善冠心病心絞痛痰瘀互結(jié)型患者臨床癥狀[1]；能減少心肌細(xì)胞凋亡[2]，改善心室重構(gòu)[3]，對(duì)心肌缺血具有保護(hù)作用；調(diào)節(jié)心律失常[4]；改善血脂紊亂[5]等一系列作用。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究[6]提示，丹蔞片能夠顯著改善小鼠心肌缺血再灌注損傷的梗死面積及再灌注心律失常，減輕心肌組織和心肌細(xì)胞病理?yè)p傷，對(duì)心肌缺血具有明顯的保護(hù)作用。然而丹蔞片抑制心肌缺血再灌注損傷作用機(jī)制仍不甚清楚。因此2017年9月至2018年6月，我們建立心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型以模擬心肌缺血再灌注損傷，并基于MAPK信號(hào)通路探討丹蔞片對(duì)心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的保護(hù)作用的機(jī)制，對(duì)于闡明丹蔞片改善心肌缺血的優(yōu)勢(shì)和作用靶點(diǎn)具有重要意義，并為防治心肌梗死和再灌注損傷提供新方法和新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 藥物 丹蔞片超微粉(吉林康乃爾)，連二亞硫酸鈉(sigma)，MAPK、Bcl-2、Bax抗體均購(gòu)自美國(guó)CST公司。

1.2 儀器 垂直電泳槽(Bio-rad)，酶標(biāo)儀(Biotek)，凝膠成像系統(tǒng)(Bio-rad)，高速冷凍離心機(jī)(Bio-rad)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SD雄性大鼠，體重220～260 g，20只，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 丹蔞片含藥血清的制備 選取雄性健康SD大鼠20只，隨機(jī)分為丹蔞片給藥5 g/kg組10只，生理鹽水(control)組10只。取丹蔞片超微粉150 g溶解于100 mL生理鹽水，攪拌均勻，充分溶解，配制成5 g/kg的丹蔞片混懸液。將SD大鼠稱重，丹蔞片給藥組按體重給予5 g/kg丹蔞片混懸液灌胃處理，生理鹽水(control)組為空白對(duì)照組，不給藥液，只根據(jù)體重給予生理鹽水，連續(xù)灌胃10 d后取材，以7%水合氯醛于SD大鼠左下腹進(jìn)行腹腔注射，麻醉大鼠，稱量大鼠體重，腹主動(dòng)脈取血，將血液于常溫靜置2 h后，2 500 r/min離心5 min取上層血清，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 心肌細(xì)胞缺氧模型的構(gòu)建 取連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)粉末溶解于DMEM培養(yǎng)基中，充分溶解，配制成100 mmol/L的Na2S2O4溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。分別設(shè)置7個(gè)不同的連二亞硫酸鈉(Na2S2O4)終濃度(0、0.625、1.25、2.5、5、10、20、40 mmol/L)，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞均勻種至60 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，并設(shè)空白對(duì)照組正常培養(yǎng)，2 h后去掉培養(yǎng)基，收集細(xì)胞及其上清液，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)及研究，確定濃度后按照實(shí)驗(yàn)分組方法設(shè)置空白對(duì)照(control，正常培養(yǎng)，無處理)組、模型(Na2S2O4)5 mmol/L組、抑制劑(對(duì)應(yīng)通路抑制劑+Na2S2O4)組和給藥(丹萎片+Na2S2O4)組，其中給藥組用含10%丹蔞片含藥血清的高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h、抑制劑組用對(duì)應(yīng)通路抑制劑處理2 h后，分別加入100 mmol/L Na2S2O4缺氧2 h造模，每組設(shè)置平行3組，缺氧結(jié)束后去掉培養(yǎng)基，收集細(xì)胞及上清液，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)及研究。

1.4.3 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長(zhǎng)及細(xì)胞病變情況。

1.4.4 生化試劑盒檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)活性 按照操作說明書，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測(cè)定孔、對(duì)照孔4組，分別按照說明書的劃分加入雙蒸水、標(biāo)準(zhǔn)液、待測(cè)樣本、基質(zhì)緩沖液、輔酶I后混勻，37℃溫浴15 min，再加入2，4-二硝基苯肼混勻，37℃溫浴15 min，加入0.4 mol/L NaOH溶液混勻，室溫放置5 min，波長(zhǎng)450 nm，酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度。

1.4.5 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的H9c2細(xì)胞均勻種至6孔板中，藥物作用后，棄培養(yǎng)基，用含蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞蛋白。BCA法測(cè)定細(xì)胞裂解液中蛋白濃度，計(jì)算上樣體積。蛋白上樣，用10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用含5%脫脂奶粉的封閉液封閉1.5 h，加入相應(yīng)稀釋比例的第一抗體，4℃搖床孵育過夜。TBST洗膜后，更換二抗，室溫?fù)u床孵育1 h，TBST洗膜，ECL發(fā)光液處理，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)，以GAPDH為內(nèi)參,分析相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察法 倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，正常H9c2心肌細(xì)胞培養(yǎng)2～3 d后，胞體飽滿富有立體感，呈長(zhǎng)梭形，邊界清晰，折光性好，細(xì)胞單層貼壁，互不重疊。加入Na2S2O4損傷后引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，在2 h Na2S2O4(40 mmol/L)作用下尤其明顯，表現(xiàn)為模型組細(xì)胞膜皺縮，細(xì)胞體積縮小變圓，細(xì)胞無法正常貼壁，大面積脫落，成片漂浮于上清液中，胞體折光性下降, 呈碎裂崩解壞死表現(xiàn)。其余給藥濃度細(xì)胞形態(tài)變化不明顯。見圖1。

2.2 生化試劑盒檢測(cè)細(xì)胞LDH活性 分別加入0.625～40 mmol/L Na2S2O4作用H9c2細(xì)胞2 h后，與對(duì)照組相比，模型組Na2S2O4(1.25～40 mmol/L)LDH活性均顯著上升(P<0.05)，并在濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系。其中5、40 mmol/L的Na2S2O4可使模型組LDH活性分別提高156.45±34.11、280.45±55.56(P<0.001)，見表1、圖2。結(jié)果表明，1.25～40 mmol/L Na2S2O4可顯著提高細(xì)胞上清液中LDH活性，其中5、40 mmol/L劑量下效果較明顯。

2.3 Western blot 檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá) 分別加入0.625～40 mmol/L Na2S2O4作用H9c2細(xì)胞2 h后，與對(duì)照組相比，模型組Bax的表達(dá)整體呈上升趨勢(shì)，但在5～40 mmol/L濃度范圍內(nèi)變化不明顯；Bcl-2 在10～40 mmol/L的表達(dá)明顯比在0.625～5 mmol/L濃度范圍內(nèi)低；同時(shí)，Bcl-2/Bax的比率在1.25～40 mmol/L范圍內(nèi)呈濃度依賴性降低(P<0.05)。cleaved Caspase 3在0.625～2.5 mmol/L濃度范圍內(nèi)表達(dá)較低且變化不明顯，但在5 mmol/L濃度處可見陡升，隨后又逐漸下降。見圖3、4。

2.4 丹萎片對(duì)凋亡相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組相比，模型組能降低Bcl-2的表達(dá)，升高Bax、cleaved Caspase 3的表達(dá)，同時(shí)顯著下調(diào)Bcl-2/Bax的比率(P<0.01)，而與模型組相比，給藥組能升高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax、cleaved Caspase 3的表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的比率(P<0.001)，與模型組相比，抑制劑組并無明顯差異(P>0.05)。與抑制劑組相比，給藥組能升高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax、cleaved Caspase 3的表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的比率(P<0.05)。見圖5、6。

2.5 丹萎片對(duì)MAPK通路相關(guān)蛋白的影響 與對(duì)照組相比，模型組能顯著升高H9c2細(xì)胞中p-ERK、p-JNK和p-p38的蛋白水平(P<0.01),而與模型組相比，給藥組能顯著降低p-ERK、p-JNK和p-p38的蛋白水平(P<0.01)，與模型組相比，抑制劑組能顯著降低p-ERK和p-JNK的蛋白水平(P<0.01)，而p-p38無明顯差異(P>0.05)。與抑制劑組相比，給藥組能顯著降低p-ERK和p-JNK的蛋白水平(P<0.01)，而p-p38無明顯差異(P>0.05)。由此可知，通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK和MAPK/JNK信號(hào)通路，丹蔞片能夠顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡(P<0.001)，減少心肌細(xì)胞損傷。見圖7、8。

圖1 濃度梯度Na2S2O4造模2 h后

組別劑量(mmol/L)LDH活性(U/L)對(duì)照組00Na2S2O40.6250Na2S2O41.2562.29±9.27**Na2S2O42.580.15±29.61**Na2S2O45156.45±34.11***Na2S2O410186.99±55.00**Na2S2O420222.31±8.48*Na2S2O440280.45±55.56***

與對(duì)照組相比*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖2 濃度梯度Na2S2O4對(duì)LDH活性的影響

圖3 各組心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase 3蛋白電泳

與對(duì)照組相比*P<0.05， **P<0.001

圖4 濃度梯度Na2S2O4干預(yù)對(duì)心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase 3相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 各組心肌細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase 3蛋白電泳

與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖6 丹蔞片含藥血清預(yù)處理對(duì)Na2S2O4誘導(dǎo)心肌細(xì)胞缺氧損傷凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

本研究通過構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧模型，在細(xì)胞水平模擬心肌缺血損傷，確定丹蔞片對(duì)連二亞硫酸鈉誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷的影響，探討丹蔞片對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。心肌細(xì)胞凋亡程度與心肌細(xì)胞表達(dá)Bcl-2/Bax的比率有關(guān)，Bcl-2/Bax的比率升高可以抑制心肌細(xì)胞凋亡，而Bcl-2/Bax的比率下降則促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在1.25～40 mmol/L濃度范圍內(nèi)，Na2S2O4能夠顯著促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡(P<0.05)，且促凋亡作用呈濃度依賴性增強(qiáng)。cleaved Caspase 3在0.625～2.5 mmol/L濃度范圍內(nèi)表達(dá)較低且變化不明顯，但在5 mmol/L濃度處可見陡升，隨后又逐漸下降。Caspase 3被認(rèn)為是caspsaes家族中的關(guān)鍵蛋白酶，其活化是細(xì)胞凋亡酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)的必經(jīng)之路。5 mmol/L Na2S2O4可以明顯促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，給藥組能升高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax、cleaved Caspase 3的表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的比率(P<0.001)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，給藥組能顯著降低p-ERK、p-JNK和p-p38的蛋白水平(P<0.01)。

圖7 各組心肌細(xì)胞MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白電泳

心肌缺血是多種心臟疾患的初始階段。中醫(yī)理論認(rèn)為，“氣虛血瘀”是心肌缺血再灌注損傷重要的中醫(yī)病機(jī)。近年來，中藥在心血管疾病的預(yù)防及治療中占據(jù)重要地位，目前研究發(fā)現(xiàn)，中藥對(duì)抗心肌缺血機(jī)制的研究角度主要有: 抑制細(xì)胞凋亡、清除自由基、抑制鈣超載、促進(jìn)血管新生、抑制炎癥損傷等[7]。心肌細(xì)胞凋亡是心肌缺血損傷的重要表現(xiàn)。過去人們對(duì)凋亡研究的注意力主要集中在凋亡過程中DNA被酶切降解為寡核苷酸片段，并視其為凋亡最重要和唯一的生化指標(biāo)。近年來，對(duì)凋亡研究的焦點(diǎn)已轉(zhuǎn)移到凋亡過程中更早的一個(gè)過程，即一系列細(xì)胞內(nèi)起關(guān)鍵作用的蛋白質(zhì)被特異性酶解，而負(fù)責(zé)特異性酶切這些蛋白的半胱氨酸蛋白酶家族統(tǒng)稱為半胱天冬酶類(Caspases)[8-9]。Caspase 3是目前公認(rèn)的凋亡關(guān)鍵性蛋白(又稱死亡蛋白)，Caspase 3的激活是細(xì)胞凋亡不可逆轉(zhuǎn)的標(biāo)志[10]。Bcl-2是一種原癌基因，是目前公認(rèn)的促進(jìn)細(xì)胞生存、抑制細(xì)胞凋亡的長(zhǎng)壽基因[11]。心肌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)的上調(diào)可以抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生[12]。Bax是Bcl-2家族的促凋亡蛋白，當(dāng)細(xì)胞受到損傷時(shí)，位于胞質(zhì)中的Bax通過感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放的鈣離子，轉(zhuǎn)位到線粒體形成孔道，增加線粒體通透性，幫助Cyto C釋放到胞質(zhì)中，激活線粒體細(xì)胞凋亡途徑。Bcl-2通過與Bax形成異源二聚體，阻止Bax向線粒體移位，拮抗Bax的促凋亡作用[13]。Zhao等[14]研究發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞凋亡程度與心肌細(xì)胞表達(dá)Bcl-2/Bax的比率有關(guān),Bcl-2/Bax的比率升高可以抑制心肌細(xì)胞凋亡,而Bcl-2/Bax的比率下降則促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡。

與對(duì)照組比較*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

圖8 丹蔞片含藥血清預(yù)處理對(duì)心肌細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

丹蔞片是在痰瘀同治理論指導(dǎo)下的代表藥物，組方獨(dú)特，即“活血化瘀”，又“化痰散結(jié)”，其中君藥瓜蔞、薤白通陽(yáng)散結(jié)，行氣祛痰；臣藥丹參、赤芍、川芎、葛根活血化瘀，通絡(luò)止痛。佐藥黃芪、澤瀉益氣利濕，補(bǔ)而不滯。使藥郁金、骨碎補(bǔ)取從腎治心之意；諸藥合用，共奏燥濕化痰、活血化瘀之功。研究發(fā)現(xiàn)，丹蔞片不僅可改善冠心病心絞痛痰瘀證患者的心肌缺血癥狀，而且具有不同程度的降低炎癥反應(yīng)，穩(wěn)定斑塊及抑制頸部動(dòng)脈粥樣硬化斑塊進(jìn)展的作用，具有良好的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。丹蔞片可調(diào)整動(dòng)脈粥樣硬化大鼠血漿內(nèi)皮素、血管緊張素Ⅱ、一氧化氮合酶的濃度，降低高血脂癥大鼠血脂水平，改善血管內(nèi)皮功能。我們前期研究顯示，丹蔞片能夠抑制動(dòng)脈粥樣硬化模型大鼠斑塊進(jìn)展和炎癥反應(yīng)，抑制斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞表達(dá)。有研究報(bào)道丹蔞片對(duì)心肌缺血具有明顯的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善冠心病痰瘀互結(jié)證時(shí)血液高黏滯狀態(tài)、血脂代謝紊亂以及抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)[15]。

本研究通過前期預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定采用5 mmol/L Na2S2O4缺氧處理2 h以建立穩(wěn)定的心肌細(xì)胞缺氧損傷模型。在現(xiàn)象實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，給藥組能升高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax、cleaved Caspase 3的表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的比率(P<0.001)；而與抑制劑組相比，給藥組能升高Bcl-2的表達(dá)，降低Bax、cleaved Caspase 3的表達(dá)，同時(shí)顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的比率(P<0.05)，提示通過調(diào)節(jié)線粒體通路，丹蔞片能夠顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡(P<0.001)，減少心肌細(xì)胞損傷。此外，在機(jī)制實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，給藥組能顯著降低p-ERK、p-JNK和p-p38的蛋白水平(P<0.01)；與抑制劑組相比，給藥組能顯著降低p-ERK和p-JNK的蛋白水平(P<0.01)，而p-p38則無明顯差異(P>0.05)，提示通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK和MAPK/JNK信號(hào)通路，丹蔞片能夠顯著抑制心肌細(xì)胞凋亡(P<0.001)，減少心肌細(xì)胞損傷。本研究表明，丹蔞片對(duì)心肌缺血損傷的保護(hù)作用可通過調(diào)節(jié)線粒體通路抑制細(xì)胞凋亡，并與激活MAPK信號(hào)通路有關(guān)。細(xì)胞凋亡是一個(gè)高度調(diào)控的過程，基因敲除、藥物抑制劑等均可以抑制心肌細(xì)胞的凋亡，但是目前臨床上并沒有抑制凋亡的藥物。細(xì)胞凋亡在缺血性心臟病的發(fā)生發(fā)展過程中意義重大，丹蔞片作為中醫(yī)經(jīng)典明方為基礎(chǔ)的純植物藥制劑，已有的研究表明丹蔞片是能夠減少心肌細(xì)胞凋亡，改善心室重構(gòu)，對(duì)心肌缺血發(fā)揮保護(hù)作用的，但目前的研究尚不夠深入，接下來將我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究方法結(jié)合起來，繼續(xù)研究缺血性心臟病的發(fā)病機(jī)制及可能作用靶點(diǎn)，并深入探究丹蔞片改善缺血性心臟病的機(jī)制，為缺血性心臟病藥物的研發(fā)提供更多的理論依據(jù)。