有氧聯(lián)合抗阻訓練激活激素敏感性脂肪酶與交感神經(jīng)途徑顯著減少脂肪積累

劉陽 張賽 何玉秀 李朋

1 河北師范大學體育學院人體運動生物信息測評省重點實驗室（石家莊050021）

2 河北師范大學體育學博士后科研流動站（石家莊050021）

肥胖嚴重威脅人類健康。過多的脂肪，尤其是腹部內(nèi)臟脂肪積累，是心血管及代謝類疾病的獨立危險因素[1]。有氧耐力訓練（aerobic endurance training，AT）和抗阻訓練（resistance training，RT）是運動減肥最常用的訓練方式。然而大量臨床證據(jù)顯示，單純進行抗阻訓練并無減肥效果[2]，而單純進行有氧訓練時，減肥效果不如聯(lián)合使用有氧與抗阻訓練時明顯[3-5]。目前，美國運動醫(yī)學會、美國心臟病協(xié)會和美國糖尿病協(xié)會都推薦有氧聯(lián)合抗阻訓練（combination of aerobic and resistance training，ART）為最佳的減肥與代謝性疾病改善運動處方[6-7]。ART可更有效地減少內(nèi)臟與皮下脂肪積累，同時也能夠更顯著地改善糖脂代謝[8]，已有研究者從炎癥、Adropin激素和腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等角度對其減肥效果更明顯的內(nèi)在機制進行了初步探討[9-11]。但ART對脂肪組織分解途徑的直接作用如何，由何種信號進行調(diào)節(jié)，很少見到相關報道。

有氧訓練由于運動持續(xù)時間長，在運動中能消耗較多能量。而抗阻訓練的間歇較多，總時間內(nèi)的平均代謝當量只有3～4 Mets[12]。所以當訓練時間相同時，ART較單純有氧訓練消耗的能量更少?？棺栌柧気^有氧訓練對機體的神經(jīng)、內(nèi)分泌和免疫功能的刺激更劇烈[13]。研究顯示，即使在對外做功相同時，不同的訓練強度由于對機體的刺激不同，也會產(chǎn)生不同的減肥效果[14]。由于ART 使用了有氧與抗阻訓練，可在消耗較多能量的同時對機體帶來較大的刺激，可能會更明顯地激活神經(jīng)、免疫、內(nèi)分泌和肌肉因子等促脂解途徑，進而促進脂肪分解。

機體分泌的兒茶酚胺、生長激素等脂解類激素在強烈刺激下可激活激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase，HSL），促進脂肪水解。骨骼肌分泌的鳶尾素（irisin）則能在運動后通過提高脂肪細胞合成解耦聯(lián)蛋白1（uncoupling protein 1，UCP-1）的表達促進脂肪氧化產(chǎn)熱。2017年新發(fā)現(xiàn)，脂肪組織炎癥狀態(tài)的改變，能驅(qū)動巨噬細胞分泌兒茶酚胺進而促進脂解[15]，而交感神經(jīng)同樣可通過兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)促進脂解[16]。本研究選取以上途徑作為ART 可能激活的靶點，給予肥胖小鼠總時間相同的單純有氧訓練和有氧聯(lián)合抗阻訓練。在對比兩種訓練減肥效果的同時，觀察不同訓練方法對水解酶HSL、氧化蛋白UCP-1、交感神經(jīng)特異性標志物酪氨酸羥化酶（tyrosine hydroxylase，TH）、炎癥因子白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）的激活差異，探討ART究竟通過何種內(nèi)在機制達到了更顯著的減肥效果，為科學制定運動處方提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗分組與肥胖動物模型的建立

3 周齡雌性C57bl/6 小鼠（購自北京維通利華實驗動物公司）隨機分為普通膳食組（C組，10只）與高脂膳食建模組（H組，100只），自由飲水、攝食。C組給予標準飼料，H 組給予高脂飼料（60%標準飼料+16%白砂糖+5%豬油+18%蛋黃粉+1%膽酸鈉）。15 周后，從H組中體重大于C組平均體重10%以上的個體中隨機選取18只作為肥胖模型，隨機分為高脂膳食對照組（HFD組）、單純有氧訓練組（AT 組）和有氧聯(lián)合抗阻訓練組（ART 組），每組各6只。AT 與ART 組在高脂飼養(yǎng)的同時進行12 周訓練，HFD 組在此期間只進行高脂飼養(yǎng)、不訓練。實驗動物單籠飼養(yǎng)，并在建模及訓練全程的每周最后一天，稱量個體體重及飼料消耗。

1.2 實驗動物訓練方案

肥胖模型建立后，分別對AT和ART組進行總時間相同的單純有氧訓練和有氧聯(lián)合抗阻訓練干預，每周5次，共12 周。AT 組每次在25°上坡跑臺上訓練45 min，初始跑速13 m/min，并在第5周逐步提高至17 m/min，維持至12 周結(jié)束。依據(jù)H?ydal 對發(fā)育中小鼠運動能力變化的研究，此強度始終約為60%最大攝氧量[17]。ART 組進行36 min 相同強度的跑臺訓練，結(jié)束后立即再進行9 min抗阻爬梯訓練。梯寬0.2 m，有效高度1.0 m，85°斜置。初始負荷為10%體重，并在3 周內(nèi)遞增至150%。每次完成2組訓練，每組包含3次爬梯，單次爬梯時間約20～30 s，每次間隔1 min，組間間隔2 min，保證小鼠在9 min 內(nèi)完成全部6 次爬梯。由于抗阻爬梯訓練實際運動時間只有約2～3 min，間歇時間較長，約6～7 min，能量消耗的絕對值并不高。有研究顯示，相同時間內(nèi)中等強度的抗阻訓練，代謝當量約3～4 METs[12]，只相當于較低強度的有氧運動。故本研究的小鼠在完成一次訓練時，ART 組運動中的能量消耗應與AT組相當或略低。

1.3 動物取材與稱重

在12 周的末次訓練結(jié)束后48 小時取材。待小鼠排尿排便后測量體重。0.4%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，摘眼球取血并分離血清。打開胸腹腔，生理鹽水由右心耳進行動脈灌流。仔細剝離完整的子宮周圍脂肪（代表內(nèi)臟脂肪）和腹股溝皮下脂肪（代表皮下脂肪）并稱取重量。剝離雙腿腓腸肌，保留合適大小的肌腹部分。血清、脂肪和肌肉組織分裝后-80°凍存。

1.4 血脂四項測試

采用比色法測試血清甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）四項血液指標。試劑盒購自南京建成，貨號TG：A110-2，TC：A111-2，LDL-C：A112-2，HDLC：A113-2，嚴格按照說明書操作。

1.5 組織蛋白表達和磷酸化水平測試

采用蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）法測試肌肉組織過氧化物增殖物活化受體γ輔激活因子1α（PGC-1α）、纖維連結(jié)蛋白Ⅲ型域包含蛋白5（FNDC5），脂肪組織UCP-1、TH、白細胞介素6（IL-6）、HSL 總蛋白及ser563、ser660 磷酸化表達。RIPA 對勻漿后組織進行裂解，離心取上清，BCA 試劑盒（購自Solarbio）測試總蛋白濃度，并依據(jù)濃度向樣品內(nèi)加入適量Loading Buffer，煮沸后凍存?zhèn)溆谩DS-PAGE 體系電泳選用4%濃縮膠，12%分離膠，每孔上樣30 μg。電泳完成后將目的條帶濕轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，一抗孵育過夜，二抗孵育2 小時后發(fā)光。ImageJ 1.51 計算灰度值。PGC-1α、FNDC5、UCP-1、TH、一抗購自Abcam；HSL 及HSL-ser563、HSL-ser660一抗購自CST，IL-6一抗購自GeneTex。

1.6 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)使用平均數(shù)±標準差（）表示。由于動物飼養(yǎng)時自由攝食，不同個體的進食量差異可能對體重、不同部位脂肪重量產(chǎn)生影響，故采用協(xié)方差分析，將攝食量作為協(xié)變量以消除其對結(jié)局變量的干擾，分析不同訓練方案運動后體重與脂肪重量的差異。不同組間攝食量、血脂四項和組織蛋白表達指標采用單因素方差分析，采用LSD 法進行兩兩比較。統(tǒng)計軟件為SPSS 24.0，取P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種訓練方式的減肥效果

以總攝食量作為協(xié)變量，對12周訓練后減肥效果進行協(xié)方差分析，發(fā)現(xiàn)攝食量對腹股溝皮下脂肪（代表皮下脂肪）重量具有顯著的影響（P＜0.01），對體重、子宮周圍脂肪（代表內(nèi)臟脂肪）重量無顯著影響。去除攝食量干擾后，ART組體重、子宮周圍和腹股溝皮下脂肪均低于HFD組（P＜0.05或P＜0.01），且ART 組子宮周圍和腹股溝皮下脂肪也顯著低于AT 組（P＜0.05 或P＜0.01）；單因素方差分析顯示三組攝食量無顯著差異。見圖1。

圖1 各組小鼠體重、脂肪重量與攝食量比較（n=6）

2.2 兩種訓練方式對血脂四項的影響

圖2 各組小鼠血脂四項比較（n=6）

對血脂四項進行單因素方法分析顯示，三組間TG、TC和HDL-C無顯著差異；ART組LDL-C顯著低于HFD 組（P＜0.05），有低于AT 組的趨勢但不顯著（P=0.130），AT組與HFD組無差異。見圖2。

2.3 脂肪水解酶HSL蛋白表達與磷酸化水平

訓練后各組HSL 總蛋白表達均無顯著差異。AT組和ART 組皮下脂肪HSL-ser563 磷酸化表達均低于HFD 組（P＜0.05）。無論皮下或內(nèi)臟脂肪，AT 組與ART組HSL-ser660 磷酸化表達均高于HFD 組（P＜0.05 或P＜0.01），ART 組皮下脂肪ser660 磷酸化表達高于AT組（P＜0.05），但內(nèi)臟脂肪AT 組與ART 組間無顯著差異。見圖3。

圖3 各組小鼠脂肪水解酶HSL蛋白表達與磷酸化水平（n=6）

2.4 脂肪氧化蛋白UCP-1 及上游調(diào)節(jié)信號骨骼肌PGC-1α與FNDC5的變化

12 周訓練后，腓腸肌PGC-1α表達三組間無顯著差異；FNDC5 表達三組間存在差異的趨勢（P=0.107），兩兩比較顯示ART 組有高于AT 組與HFD 組的趨勢（P=0.096與P=0.050），但無統(tǒng)計學意義。AT組與ART組皮下脂肪UCP-1 表達量均高于HFD 組（P＜0.05），但兩組間差異無統(tǒng)計學意義。見圖4。

圖4 各組小鼠脂肪氧化蛋白UCP-1及上游調(diào)節(jié)信號變化（n=6）

2.5 脂肪組織交感神經(jīng)標志物TH 及炎癥因子IL-6 變化

12 周訓練后，皮下脂肪TH 表達三組間無顯著差異；內(nèi)臟脂肪TH 三組間存在顯著差異（P＜0.05），AT 組顯著低于HFD 組與ART 組（P＜0.05）；IL-6 表達各組均無顯著差異。

圖5 各組小鼠脂肪組織交感神經(jīng)標志物TH及炎癥因子IL-6變化（n=6）

3 討論

3.1 ART 減少脂肪積累與改善血脂的效果優(yōu)于單純有氧訓練

傳統(tǒng)觀點認為，中等強度有氧運動的脂肪供能比例較高，且持續(xù)時間長，是最為有效的減肥運動方式。但此觀點并未考慮運動后神經(jīng)體液調(diào)節(jié)下脂肪的進一步代謝。如前言所述，大量研究證明ART 的減肥效果優(yōu)于單純有氧訓練。此外ART 在提高心血管機能、緩解胰島素抵抗、改善心理狀態(tài)等方面也優(yōu)于單純有氧訓練[18-21]。本研究采用運動時間相同的兩種訓練方法對小鼠進行12周運動干預，發(fā)現(xiàn)ART在降低內(nèi)臟與皮下脂肪積累方面，均顯著優(yōu)于單純有氧訓練。Park 的人體研究結(jié)果與本研究類似，他對肥胖中年女性分別進行每周6 天的有氧訓練或每周3 天有氧訓練加3 天抗阻訓練，發(fā)現(xiàn)ART 能夠更有效地降低內(nèi)臟與皮下脂肪重量[22]。但也存在一些不同的結(jié)果，Damaso 對肥胖青少年進行運動干預后發(fā)現(xiàn)，ART 減少內(nèi)臟脂肪的效果優(yōu)于單純有氧訓練，而對皮下脂肪兩種訓練效果無差異[23]。Alberga 的研究中，ART 與單純有氧訓練在減少皮下脂肪上具有相同的效果，但對內(nèi)臟脂肪無作用[24]。各個研究中不同位置脂肪的變化并不一致，提示雖然ART在促進脂肪分解方面較單純有氧訓練具備優(yōu)勢，但具體的效果與運動方案的設計及受試者的差異有關。本研究結(jié)果也顯示，雖然ART 組小鼠脂肪重量低于AT 組，但兩組體重并無差異，這可能是ART 在促進脂肪分解的同時，提高了瘦體重造成的。相關研究與此假說類似，Villareal的研究證實ART能更明顯地提高瘦體重[25]。

已有研究表明，無論是單純有氧、抗阻或聯(lián)合訓練，都具有改善血脂的效果，但ART 提高HDL/LDL 比值的作用更明顯[24]。Mann在一篇系統(tǒng)綜述中總結(jié)了有氧、抗阻和聯(lián)合訓練對血脂的作用，指出HDL與運動量呈線性關系，而LDL、TG則與運動強度密切相關[26]。此觀點解釋了本研究的結(jié)果：由于AT與ART的運動量相似，但ART 對機體的刺激更劇烈，故而出現(xiàn)ART 組LDL-C顯著低于AT組，但兩組間HDL-C無顯著性差異。

本研究中，各組動物的攝食量與不同部位脂肪IL-6 含量均無顯著差異，說明無論單純有氧或者ART 訓練，都不能對能量攝入和安靜時脂肪的炎癥狀態(tài)產(chǎn)生明顯影響。

3.2 ART 通過HSL促進皮下脂肪水解的效果高于單純有氧訓練

研究顯示，由于抗阻訓練運動間隔時間較長，能量消耗只相當于3～4 METs的低強度有氧訓練[12]。本研究的跑臺訓練相當于約60%最大攝氧量，故而ART 組小鼠在完成36 min跑臺訓練和9 min抗阻爬梯訓練所消耗的能量，應略低于AT組45 min跑臺訓練的能量消耗。結(jié)果顯示ART 雖然未消耗更多能量，但能使脂肪積累減少。同時，ART組與AT組的攝食量也無顯著差異，說明ART也未顯著減少能量攝入。這說明，ART的減脂效果，與運動中脂肪消耗或能量攝入改變無關，脂肪積累的降低很可能與運動后脂肪的分解與氧化相關。

脂肪組織內(nèi)甘油三酯的分解，分為水解和氧化兩個階段。在水解階段，甘油三酯首先被脂肪甘油三脂水解酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）和HSL 水解為游離脂肪酸和甘油二酯，之后再被HSL 水解為游離脂肪酸和甘油一酯，最后被單酰甘油脂肪酶（monoacylglycerol lipase，MAGL）水解為甘油和游離脂肪酸，ATGL和HSL是在整個水解過程的關鍵限速酶。ATGL活性由比較基因識別物-58（comparative gene identification-58，CGI-58）與其的結(jié)合調(diào)節(jié)。雖然有研究表明，長期運動時ATGL 的表達增加，且與CGI-58 的結(jié)合也上升[27]，但更多研究顯示脂肪組織ATGL的激活并非由運動直接引發(fā)，而是與機體能量代謝有關。Nielsen 發(fā)現(xiàn)，運動不能直接激活ATGL，禁食卻能顯著升高ATGL mRNA 表達量[28]。Gaidhu 發(fā)現(xiàn)高脂膳食誘導的肥胖大鼠，ATGL不降反升[29]。John發(fā)現(xiàn)，ATGL脂肪組織特異性基因敲除小鼠的耐力性運動能力伴隨著脂肪代謝水平降低出現(xiàn)了顯著下降[30]。這些研究提示，運動對ATGL 的影響主要是通過影響能量供應來間接調(diào)節(jié)的，肥胖小鼠ATGL的激活與脂肪重量的下降并無直接關系。HSL活性的升高與脂解類激素（兒茶酚胺、生長激素、心鈉鈦等）激活cAMP-PKA 信號途徑，進而增加ser563和ser660磷酸化有關，“能量開關”AMPK可通過磷酸化ser565來抑制HSL活性。雖然ART與單純有氧訓練的能量消耗相似，但它對機體的刺激更大，可促進更多的激素分泌。因此，本研究選擇了HSL而非ATGL作為ART 促脂肪水解的靶點，假設ART 可誘發(fā)機體產(chǎn)生更多的脂解類激素，提高HSL磷酸化水平，促進脂肪水解。

本研究的結(jié)果顯示，AT 與ART 組皮下脂肪ser563較基線值均顯著下降，但內(nèi)臟與皮下ser660 都顯著上升。Ser563沒有與ser660同步上升，可能與AMPK的抑制有關。研究顯示，AMPK 對ser563 的抑制作用強于ser660，但ser660 與HSL的水解活性關系更高[31]。AMPK 是細胞內(nèi)的能量開關，而有氧訓練對細胞內(nèi)的能量代謝有著強烈的影響。AT 與ART 的有氧訓練部分可通過激活AMPK 進而抑制ser563 磷酸化，但由于AMPK 對ser660 的抑制較弱，故出現(xiàn)了兩個訓練組ser563降低，但ser660升高，HSL被激活的現(xiàn)象。同時應注意到，ART 組皮下脂肪HSL-ser660 不但高于基線值，也顯著高于AT 組，說明聯(lián)合訓練可更有效促進皮下脂肪水解。此結(jié)果揭示了ART減少皮下脂肪積累的效果優(yōu)于單純有氧訓練的一個重要機制。

3.3 ART與單純有氧訓練通過UCP-1促進皮下脂肪氧化分解的效果相同

脂肪水解產(chǎn)生的游離脂肪酸，除通過血液運輸至全身外，還可在脂肪細胞內(nèi)借助UCP-1 被直接氧化。UCP-1 存在于線粒體內(nèi)膜上，可通過解耦聯(lián)電子傳遞系統(tǒng)阻止ATP 生成，使脂肪酸的化學能直接轉(zhuǎn)化為熱量，參與非顫栗性產(chǎn)熱。研究發(fā)現(xiàn)，骨骼肌在運動后可向血液分泌肌肉因子鳶尾素（Irisin），其到達脂肪細胞后可使UCP-1 高表達，促進脂肪氧化[32]。運動可激活肌細胞PGC-1α，繼而促進纖維連結(jié)蛋白Ⅲ型域包含蛋白5（fibronectin type Ⅲdomain-containing protein 5，F(xiàn)NDC5）表達，F(xiàn)NDC5經(jīng)過剪切修飾后會變?yōu)镮risin，并由肌細胞向循環(huán)血液分泌。ART 相對于單純有氧運動，對骨骼肌的刺激更劇烈，所以本研究假設ART可更強烈地激活骨骼肌PGC-1α—FNDC5—Irisin 途徑，通過UCP-1促進脂肪氧化。但由于Irisin是血液激素，除受FNDC5合成量的控制外，還受血漿容量和機體代謝的影響，Irisin 與FNDC5 的變化并不同步[33]。在某些運動干預中，Irisin 濃度不升反降[34]。所以本研究用FNDC5 作為反映ART 通過肌肉因子促UCP-1 合成的指標。

急性運動可顯著提高骨骼肌PGC-1α，但本研究三組PGC-1α無差異，說明運動后48小時PGC-1α已經(jīng)回落至基線狀態(tài)。ART組FNDC5相對于HFD組和AT組都有升高的趨勢（P=0.05 和P=0.09），提示ART 可能會通過對肌肉的刺激促進FNDC5合成。限于實驗規(guī)模，本研究沒有進行多時間點肌肉采樣，F(xiàn)NDC5 在運動后48小時也已經(jīng)回落，故而其雖有升高趨勢但不具顯著性。

本研究AT 與ART 組皮下脂肪UCP-1 表達均顯著升高，但內(nèi)臟脂肪無變化，這與前人的研究相符。Bostr?m發(fā)現(xiàn)，運動提高皮下脂肪UCP-1表達的效果比內(nèi)臟脂肪明顯[32]，提示運動促脂肪氧化的效果，對皮下脂肪更明顯。但是本研究并未發(fā)現(xiàn)ART 組皮下脂肪UCP-1 表達高于AT 組，說明ART 雖有促FNDC5 合成的趨勢，但不能顯著提高皮下脂肪氧化產(chǎn)熱。

3.4 單純有氧訓練抑制內(nèi)臟脂肪交感神經(jīng)活動，ART可解除此種抑制

本研究假設ART 能夠?qū)C體的神經(jīng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和肌肉產(chǎn)生更高的刺激。當內(nèi)分泌系統(tǒng)受刺激被激活時，會產(chǎn)生更多脂解類激素激活HSL水解；肌肉被激活時則通過Irisin 促脂肪UCP-1 表達與氧化。雖然結(jié)果支持ART 能更顯著地激活皮下脂肪HSL，但ART 組內(nèi)臟脂肪HSL和UCP-1表達與AT組無顯著差異，此結(jié)果不支持ART通過內(nèi)分泌及肌肉因子分泌途徑促進內(nèi)臟脂肪分解的假設。此結(jié)果提示ART更顯著減少內(nèi)臟脂肪的訓練效果，可能與神經(jīng)調(diào)節(jié)有關。

研究顯示，交感神經(jīng)的活動與減少內(nèi)臟脂肪密切相關。Stefanie 發(fā)現(xiàn)，交感神經(jīng)活躍度與內(nèi)臟脂肪重量的相關性高于全身脂肪和皮下脂肪重量[35]。Sipe 發(fā)現(xiàn)節(jié)食小鼠內(nèi)臟脂肪的減少，會伴隨交感神經(jīng)興奮，藥物阻斷交感神經(jīng)后，節(jié)食減少內(nèi)臟脂肪的作用也隨之降低[36]。支配脂肪的交感神經(jīng)可通過多種途徑促進脂肪分解，如Zeng 的研究證實交感神經(jīng)可通過激活HSL 促進脂肪水解[37]，F(xiàn)ischer 和Jiang 的研究也發(fā)現(xiàn)交感神經(jīng)能通過UCP-1 促進脂肪氧化[16，38]。本研究觀察了交感神經(jīng)活動的特異性標志物TH在脂肪組織中的表達，發(fā)現(xiàn)AT組內(nèi)臟脂肪TH表達顯著低于HFD組和ART組，這說明ART 減少內(nèi)臟脂肪的效果較好，此效果與交感神經(jīng)活動關系密切。ART與單純有氧訓練對脂肪交感神經(jīng)的激活作用，值得深入比較研究。需注意的是，ART組HSL和UCP-1表達與AT組相同，交感神經(jīng)是否通過其他途徑促進內(nèi)臟脂肪分解，有待進一步探索。

4 結(jié)論

有氧聯(lián)合抗阻訓練相比單純有氧訓練具有更好地減少皮下與內(nèi)臟脂肪積累、降低LDL-C 的效果。有氧聯(lián)合抗阻訓練能夠更明顯地減少皮下脂肪的機制與HSL 磷酸化調(diào)控有關，而有氧聯(lián)合抗阻訓練更明顯地減少內(nèi)臟脂肪與脂肪組織交感神經(jīng)的活動有關。