基于多成分含量測(cè)定及色譜指紋圖譜技術(shù)提升白術(shù)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)△

劉青，申潔，肖蘇萍，郭凱，何春年*，王繼永*

1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所，北京 100193；2.教育部中草藥物質(zhì)基礎(chǔ)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；3.中國(guó)中藥有限公司，北京 100195

白術(shù)藥材來源于菊科植物白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.的干燥根莖，其味苦、甘，性溫，歸脾、胃經(jīng)，具有健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎的功效，常用于治療脾虛、腹脹、胎動(dòng)不安等病癥[1]。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為上品藥材，是著名的道地藥材“浙八味”之一。在我國(guó)，白術(shù)的主要產(chǎn)區(qū)為浙江、四川、安徽、湖北、湖南等地，以栽培為主，其中浙江於潛所產(chǎn)白術(shù)的品質(zhì)最佳，故又稱其為“於術(shù)”[2]。目前，從白術(shù)中分離出超過79種化學(xué)成分，包含倍半萜類、三萜類、多糖類、黃酮苷類以及多炔類等化合物[3]，其中倍半萜類是白術(shù)最重要的一類化合物，以揮發(fā)性成分白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ以及蒼術(shù)酮為主[4]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，白術(shù)具有多種藥理作用，如改善胃腸功能[5]、利尿、抗炎癥[6-7]、抗抑郁[8]、抗腫瘤[9]、增強(qiáng)免疫功能[10]等活性，其中白術(shù)內(nèi)酯類是其藥理活性作用的重要成分。

白術(shù)為常用中藥材，具有廣泛的應(yīng)用，但迄今其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)尚不完善?！吨腥A人民共和國(guó)藥典》2015版中，僅從顯微鑒別、薄層色譜、色度、水分、總灰分以及二氧化硫等方面對(duì)白術(shù)藥材質(zhì)量進(jìn)行控制[1]，并沒有規(guī)定含量測(cè)定和指紋圖譜兩項(xiàng)。雖然已有白術(shù)含量測(cè)定和指紋圖譜的研究報(bào)道[11-13]，但并沒有明確提出白術(shù)內(nèi)酯等指標(biāo)成分的含量限度和建立特征圖譜。本研究系統(tǒng)地收集主要產(chǎn)區(qū)7個(gè)省市共38批白術(shù)藥材，建立了白術(shù)藥材的含量測(cè)定和化學(xué)色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)方法，提出其主要活性成分白術(shù)內(nèi)酯I～Ⅲ的含量限度以及白術(shù)藥材特征色譜峰，為白術(shù)藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提升和完善提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1200 HPLC(G1322A型在線脫氣機(jī)、G1311A型液相泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G1315B型DAD檢測(cè)器、Agilent色譜工作站)；AL204型梅特勒-托利多萬(wàn)分之一電子天平；超純水儀(Millipore公司)；KQ5200DE型超聲波清洗儀(江蘇省金壇市宏凱儀器廠)。

1.2 試藥

白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ(中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均為99.9%，ID分別為3YQB-LYKQ、XQS8-HYPC、AVAL-RVEQ)；乙醇、甲醇(分析純，北京化工廠)；超純水(Millipore)；乙腈(色譜純，Honeywell)。

38份白術(shù)藥材粉末來源于浙江、湖南、湖北、四川等多個(gè)產(chǎn)地。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備

稱取白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ對(duì)照品各約10 mg，精密稱定，置于10 mL的容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，得白術(shù)內(nèi)酯儲(chǔ)備液，其中白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ質(zhì)量濃度分別為1.02、1.04、1.05 mg·mL-1。分別取上述白術(shù)內(nèi)酯儲(chǔ)備液各1 mL，置于10 mL的容量瓶中，加入乙醇定容，即得白術(shù)內(nèi)酯的混標(biāo)溶液，備用。

2.2 供試品溶液的制備

稱取白術(shù)藥材(批號(hào)：DC7131)粉末約1 g，精密稱定，置于50 mL的容量瓶中，加入40 mL甲醇，搖勻，在35 ℃下，超聲提取30 min，放至室溫，用甲醇定容，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得到供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫，洗脫程序?yàn)?～5 min，5%～60%B；5～20 min，60%～80%B；20～25 min，80%～95%B；25～30 min，95%～100%B；30～35 min，100%B。流速為1 mL·min-1，進(jìn)樣量為20 μL，柱溫為35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為220、280 nm，對(duì)照品及白術(shù)藥材HPLC圖見圖1。

注：A、C.對(duì)照品；B、D.白術(shù)藥材；1.白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ；2.白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ；3.白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ。圖1 白術(shù)內(nèi)酯對(duì)照品及白術(shù)藥材HPLC圖

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性范圍 將白術(shù)內(nèi)酯的混標(biāo)溶液用乙醇按不同的倍數(shù)稀釋，得到6份不同質(zhì)量濃度的混標(biāo)溶液，其中白術(shù)內(nèi)酯I的質(zhì)量濃度分別為4.08、8.16、16.32、26.52、51、81.6 μg·mL-1；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ的質(zhì)量濃度分別為4.16、8.32、16.64、27.04、52、83.2 μg·mL-1；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的質(zhì)量濃度分別為4.2、8.4、16.8、27.3、52.5、84 μg·mL-1。上述6份混標(biāo)溶液按2.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，并以色譜峰面積對(duì)白術(shù)內(nèi)酯的濃度進(jìn)行線性關(guān)系分析。白術(shù)內(nèi)酯 Ⅰ：Y=83.073X+16.271，r=0.999 4；白術(shù)內(nèi)酯 Ⅱ：Y=95.97X-47.587，r=0.999 3；白術(shù)內(nèi)酯 Ⅲ：Y=52.241X+30.499，r=0.999 7。結(jié)果表明，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在4.0～84.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.4.2 檢測(cè)限與定量限 將混標(biāo)溶液用乙醇進(jìn)一步稀釋，按2.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算不同濃度下的信噪比(S/N)。信噪比(S/N)為3時(shí)，用于檢測(cè)限的考察；信噪比(S/N)為10時(shí)，用于定量限的考察。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的檢測(cè)限分別為0.089、0.104、0.168 μg·mL-1；定量限分別為0.163、0.208、0.263 μg·mL-1。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 按2.2項(xiàng)下制備供試品溶液，并按2.3項(xiàng)的色譜條件檢測(cè)，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果顯示，白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD值分別為1.50%、1.51%、1.23%；保留時(shí)間的RSD值分別為0.6%、0.74%、0.62%，可見儀器的精密度良好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按2.2項(xiàng)制備供試品溶液，分別于0、1、5、12、18、24 h，6個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)樣檢測(cè)，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD值分別為1.39%、1.94%、1.39%，可見24 h內(nèi)白術(shù)供試品溶液較為穩(wěn)定。

2.4.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次(批號(hào)：DC7131)的白術(shù)樣品粉末6份，按2.2項(xiàng)制備供試品溶液，并分別按2.3項(xiàng)的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ峰面積的RSD值分別為0.97%、2.08%、1.33%，結(jié)果表明測(cè)定方法具有良好的重復(fù)性。

2.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 稱取白術(shù)樣品粉末(批號(hào)：DC7131)約0.5 g，精密稱定，置于25 mL的容量瓶中，稱取6份；分別精密加入白術(shù)內(nèi)酯I溶液(102 μg·mL-1)1.3 mL；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ溶液(104 μg·mL-1)0.8 mL；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ溶液(105 μg·mL-1)1.6 mL。按上述測(cè)定方法進(jìn)行分析，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均加樣回收率分別為101.9%(RSD=3.34%)、107.55%(RSD=3.95%)、105.3%(RSD=3.50%)，符合《中華人民共和國(guó)藥典》2015版中對(duì)加樣回收率的要求。

2.5 樣品含量測(cè)定

采用2.2項(xiàng)供試品溶液的制備方法與2.3項(xiàng)的色譜檢測(cè)條件對(duì)自不同產(chǎn)地的38份白術(shù)樣品進(jìn)行提取與檢測(cè)，計(jì)算白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的含量，測(cè)定結(jié)果見表1。白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.101±0.044)%，以湖南和四川產(chǎn)較高，安徽產(chǎn)最低；白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.028±0.021)%，以湖南產(chǎn)最高，河北產(chǎn)最低；白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為(0.041±0.045)%，以湖南和四川產(chǎn)較高，安徽、河北和浙江產(chǎn)均較低。其中湖南和四川兩個(gè)產(chǎn)地的3種內(nèi)酯成分含量均較高，而道地產(chǎn)區(qū)浙江白術(shù)的含量居于中等或較低。

表1 白術(shù)藥材含量測(cè)定結(jié)果及方差分析 %

注：a、b、c為Duncan表示值，字母不同表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.5.1 基于3種白術(shù)內(nèi)酯含量的PCA分析 對(duì)浙江、四川等不同產(chǎn)地的38份白術(shù)中3種白術(shù)內(nèi)酯含量數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA分析，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的白術(shù)具有較好的分離趨勢(shì)(R2X=0.858，Q2=0.148)，見圖2A。表明不同產(chǎn)地來源的白術(shù)藥材具有較明顯的分離趨勢(shì)，提示不同產(chǎn)地的白術(shù)質(zhì)量具有一定的差異性，其中傳統(tǒng)道地產(chǎn)區(qū)浙江產(chǎn)白術(shù)較為穩(wěn)定。

注：A.3種白術(shù)內(nèi)酯含量的PCA得分圖；B.系統(tǒng)聚類圖。圖2 3種白術(shù)內(nèi)酯含量的PCA得分圖及系統(tǒng)聚類圖

2.5.2 基于3種白術(shù)內(nèi)酯含量的聚類分析 以3種白術(shù)內(nèi)酯含量為變量，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以平方歐氏距離為測(cè)量方法，獲得38份白術(shù)樣品的聚類分析圖，見圖2B。系統(tǒng)聚類分析結(jié)果與PCA分析較為一致，浙江產(chǎn)地的白術(shù)除S7號(hào)樣品外，其余樣品與河北S16、S18號(hào)，湖南S13號(hào)以及湖北S14、S17號(hào)樣品同時(shí)聚為一類。安徽4份樣品與河北S17號(hào)、湖北S35號(hào)以及廣西S38號(hào)樣品聚為一類。四川與湖南產(chǎn)地的樣品之間交叉聚類，其中四川產(chǎn)地的S28、S32與湖南S11、S12、S23、S24號(hào)樣品聚為一類，而湖南S25號(hào)樣品與其余四川樣品聚為一類。

2.6 指紋圖譜分析

將220 nm下檢測(cè)的數(shù)據(jù)結(jié)果以AIA格式導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A版)，選定S1號(hào)樣品為參照色譜圖，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗為0.1，經(jīng)多點(diǎn)校正、圖譜自動(dòng)匹配，以校正保留時(shí)間，使色譜峰對(duì)齊，生成對(duì)照指紋色譜圖，38份白術(shù)藥材的指紋圖譜疊加圖及對(duì)照指紋圖譜見圖3。從匹配結(jié)果中可以看出有21個(gè)共有峰。對(duì)比38份白術(shù)藥材的HPLC圖可發(fā)現(xiàn)，不同批次藥材的峰容量基本相似；由表2中峰面積RSD值可知，不同批次藥材共有峰的峰面積差異較大。根據(jù)各共有峰的峰形、保留時(shí)間、分離情況以及峰高等信息，本次研究選定以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10號(hào)色譜峰為白術(shù)藥材的特征峰。與對(duì)照品比較可知，1號(hào)色譜峰為白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ，5號(hào)色譜峰為白術(shù)內(nèi)酯I，再根據(jù)出峰時(shí)間、峰高及參考文獻(xiàn)[15]等信息暫可確定9號(hào)峰為蒼術(shù)酮。由于9號(hào)色譜峰的對(duì)稱性好、峰較高，且與相鄰色譜峰達(dá)到基線分離，故選定9號(hào)色譜峰為參照峰(S)，分別計(jì)算對(duì)照指紋色譜圖中各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間以及相對(duì)峰面積，其中，保留時(shí)間與峰面積數(shù)據(jù)均由《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》(2004 A版)導(dǎo)出，結(jié)果見表2。

注：A.HPLC指紋圖譜疊加圖；B.對(duì)照指紋圖譜。圖3 38份白術(shù)樣品HPLC指紋圖譜疊加圖及對(duì)照指紋圖譜

表2 白術(shù)樣品特征圖譜共有峰的保留時(shí)間及峰面積

2.6.1 相似度分析 由中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)(2004 A版)計(jì)算38份樣品的指紋圖譜的相似度，與對(duì)照指紋圖譜相比較，其相似度介于0.677～0.994。浙江白術(shù)的相似度除S4號(hào)樣品外，其余樣品相似度均大于0.95，進(jìn)一步表明浙江產(chǎn)白術(shù)的穩(wěn)定性較高。四川與湖南產(chǎn)地白術(shù)的相似度均低于0.95，四川白術(shù)相似度介于0.667～0.926，表明四川與湖南產(chǎn)地的白術(shù)差異性較大，可能與其白術(shù)內(nèi)酯I、Ⅲ含量偏高有關(guān)，其中，S30號(hào)樣品的相似度最低，僅為0.667，可能是由7、8號(hào)色譜峰較低所引起。

2.6.2 不同產(chǎn)地白術(shù)的PCA分析 以共有峰的峰面積為變量，對(duì)38份不同產(chǎn)地的白術(shù)進(jìn)行PCA分析，多個(gè)產(chǎn)地的白術(shù)大致分為3個(gè)區(qū)域(R2X=0.765，Q2=0.424)，見圖4A。湖南為一個(gè)區(qū)域，浙江與湖北為一個(gè)區(qū)域，四川與安徽為一個(gè)區(qū)域。湖南白術(shù)中S13、S15號(hào)樣品與其他樣品分離，二者相似度分別處于湖南白術(shù)相似度的兩個(gè)極值，S13樣品的相似度為0.942，與浙江樣品相似。湖北樣品除35號(hào)(相似度為0.899)外，其余3份樣品與浙江樣品相近。四川與安徽樣品之間相互交叉，表明兩產(chǎn)地白術(shù)具有較高的相似性。

2.6.3 不同產(chǎn)地白術(shù)的系統(tǒng)聚類分析 以共有峰的峰面積為變量，采用組間聯(lián)接的聚類方法，以平方歐氏距離為測(cè)量方法，獲得38份白術(shù)樣品的聚類分析圖，見圖4B。從聚類分析圖可看出，38份樣品被聚為2大類，一類主要包含四川與安徽產(chǎn)白術(shù)，另一類主要是浙江、湖南產(chǎn)白術(shù)。從系統(tǒng)聚類分析結(jié)果可看出，不同產(chǎn)地的白術(shù)藥材具有一定的地域性差異。整體來看，浙江樣品基本上聚為一類，表明浙江產(chǎn)白術(shù)內(nèi)在質(zhì)量的一致性較好。

注：A.共有峰峰面積的PCA得分圖；B.聚類分析圖。圖4 不同產(chǎn)地白術(shù)共有峰峰面積的PCA得分圖及聚類分析圖

4 討論

本文建立了簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定白術(shù)藥材3種內(nèi)酯類成分的含量測(cè)定方法和指紋圖譜，能夠較好地評(píng)價(jià)和控制白術(shù)藥材的質(zhì)量。本研究對(duì)提取溶劑及用量進(jìn)行考察，比較了不同體積的甲醇、70%乙醇以及乙醇溶劑的提取效果，確定以50 mL甲醇超聲提取一次為樣品提取方法。相比參考文獻(xiàn)[14]使用70%乙醇溶液提取兩次，方便快捷。

指紋圖譜與含量測(cè)定方法是中藥材常用的質(zhì)量控制方法。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了白術(shù)藥材中的3種白術(shù)內(nèi)酯含量，同時(shí)建立了白術(shù)藥材的特征圖譜。38份白術(shù)藥材的指紋圖譜中有21個(gè)共有峰，根據(jù)色譜峰的峰形、分離情況等選定其中10個(gè)峰作為白術(shù)的特征峰，為白術(shù)藥材的鑒別和質(zhì)量穩(wěn)定性提供評(píng)判依據(jù)。從含量測(cè)定結(jié)果中可看出，白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量較低且差異性較大，若以《香港中藥材標(biāo)準(zhǔn)》白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ的含量限度(不低于0.019%)為檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，則本實(shí)驗(yàn)的38份樣品中有20份是不合格的，即便是道地產(chǎn)區(qū)浙江白術(shù)也僅有1份樣品的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ高于0.019%，顯然，以白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ不低于0.019%為標(biāo)準(zhǔn)控制白術(shù)質(zhì)量是值得商榷的，有待進(jìn)一步研究。

為了更充分地反映不同來源白術(shù)內(nèi)在質(zhì)量差異性，本文以38份白術(shù)藥材中3種白術(shù)內(nèi)酯含量和指紋圖譜共有峰數(shù)據(jù)為因子，采用多元統(tǒng)計(jì)分析(聚類分析與PCA分析)進(jìn)一步比較。結(jié)果均顯示，產(chǎn)地是影響白術(shù)藥材內(nèi)在質(zhì)量差異的重要因素，不同來源白術(shù)藥材內(nèi)在質(zhì)量差異較大，所建立的含量測(cè)定方法和指紋圖譜技術(shù)能夠較準(zhǔn)確反映藥材質(zhì)量，且兩者結(jié)果較為一致。從統(tǒng)計(jì)分析可看出浙江產(chǎn)區(qū)的白術(shù)具有較好的一致性，且浙江為白術(shù)的道地產(chǎn)區(qū)，故選用浙江產(chǎn)地的白術(shù)樣品對(duì)3種白術(shù)內(nèi)酯的最低含量限度進(jìn)行探討。以每種成分平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)的80%作為最低含量限度。浙江白術(shù)樣品共12份，其白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.103%、0.017%、0.014%，計(jì)算得出白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的最低質(zhì)量分?jǐn)?shù)限度分別為0.082%、0.014%、0.013%。12份樣品的白術(shù)內(nèi)酯Ⅰ質(zhì)量分?jǐn)?shù)均高于0.082%，10份樣品的白術(shù)內(nèi)酯Ⅱ質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.014%，由于白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異性較大，僅有3份樣品的白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于0.013%，故白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ最低含量限度仍需進(jìn)一步探討，其中0.013%可為進(jìn)一步的研究提供參考。