艾天羊活血止痛按摩乳膏的制備及藥效研究△

許蕊蕊，李越，邱仁杰，王秀麗*，陳培，阮婧華

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 102488；2.北京金億門頭醫(yī)療技術(shù)發(fā)展有限公司，北京 102310；3.貴陽中醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽 550001

風(fēng)濕病是一類侵犯關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉、血管及有關(guān)軟組織或結(jié)締組織的自身免疫性疾病，呈慢性進行性，病情纏綿難愈，晚期易出現(xiàn)關(guān)節(jié)功能障礙，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，且大多具有遺傳傾向[1]。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)多采用非甾體類抗炎藥、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑等治療，但副作用較多，多數(shù)患者難以堅持長期服藥，很難達到令人滿意的療效。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥及民族醫(yī)藥在治療風(fēng)濕這種慢性病時具有不良反應(yīng)少的顯著優(yōu)點。艾天羊活血止痛按摩乳膏的中藥處方來源于民間驗方[2]。該方原本的應(yīng)用是將中藥處方粉碎后，按1∶1的比例與凡士林混合，作為按摩膏，具有油膩、有效成分吸收極其有限等缺點。從制劑應(yīng)用的角度出發(fā)，本文將中藥材進行提取制備乳膏劑，通過單因素篩選和星點設(shè)計-效應(yīng)面法優(yōu)化處方工藝。利用藥輔合一的理念，將處方中花椒單獨提取花椒油，作為油相，既作為輔料，又可以很好地發(fā)揮促進透皮、抑菌以及活血止痛的作用。

1 材料

1.1 儀器

FA1204B型分析天平(上海精密儀器儀表有限公司)；3-18N臺式高速離心機(湖南恒諾儀器設(shè)備有限公司)；電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)；BCD-182KZ50電冰箱(珠海格力電器股份有限公司)；打孔器(上海壘固儀器有限公司)；RB-200智能熱板儀(上海益聯(lián)科教設(shè)備有限公司)。

1.2 試藥

無水乙醇(分析純，北京化工廠)；去離子水(實驗室自制)；辣椒堿油(清遠銘仁生物技術(shù)有限公司，批號：18022821)；尼泊金乙酯、冰醋酸(天津市福晨化學(xué)試劑廠)；硬脂酸(上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10070946)；單硬脂酸甘油酯(北京華威銳科化工有限公司，批號：HW17C0319-2)、二甲苯、丙三醇(北京化學(xué)試劑公司)；十二烷基硫酸鈉(廣東省精細化學(xué)品工程技術(shù)研究開發(fā)中心，批號：20180301)；羧甲基纖維素鈉(江門市高昌科技有限公司，批號：180420)；創(chuàng)傷止痛乳膏(北京航琪醫(yī)藥有限公司，批號：220026668)；消腫止痛酊(廣州壯族自治區(qū)花紅藥業(yè)有限公司，批號：20180103)；復(fù)方醋酸地塞米松乳膏(華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：20180210)；乳香、沒藥、紅花、延胡索、血竭等(廣州市嶺南中藥飲片有限公司佛山分公司，符合2015年版《中華人民共和國藥典》相關(guān)項下的要求)。

2 實驗內(nèi)容

2.1 乳膏制備實驗方法與結(jié)果

2.1.1 藥材提取液的制備

2.1.1.1 藥材鑒定與前處理 沒藥、乳香、紅花、延胡索、血竭等中藥材，購買于安國中藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)廖艷副教授鑒定為真。藥材打粉，過40目篩，干燥，備用。

2.1.1.2 藥材提取 按照處方稱量各藥材(冰片除外)，置適宜容積錐形瓶中，加入適量95%乙醇，以沒過藥材為佳。每隔12 h適當(dāng)振蕩，使乙醇和藥材混合均勻，冷浸放置。第一次冷浸72 h后減壓抽濾，濾液避光保存，濾渣再加入適量95%乙醇冷浸。第二次和第三次均冷浸24 h，其余操作同第一次冷浸，合并所有濾液。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收濾液中的乙醇，濃縮至稠浸膏，用乙醇稀釋稠浸膏至乙醇藥液質(zhì)量濃度約為8.2×10-4g·mL-1，得提取液。

2.1.2 基質(zhì)篩選

2.1.2.1 星點設(shè)計 根據(jù)相關(guān)文獻[3]和預(yù)實驗確定的用量范圍，利用軟件Design-Expert.8.06進行星點設(shè)[4]，選擇硬脂酸、單硬脂酸、十二烷基硫酸鈉用量為考察因素，每因素設(shè)計5個水平，因素水平見表1，設(shè)計結(jié)果與實驗結(jié)果見表2。

表1 乳膏基質(zhì)處方星點實驗因素水平(總質(zhì)量10 g)

2.1.2.2 方程擬合與繪三維圖 以光澤度、均勻度和涂展性的總評分為評價指標(biāo)，利用 Design-Expert 8.0.6 Trial 軟件對各因素進行二項式擬合，得出總評分與各因素的回歸方程為：D(評分)=b0+b1A+b2B+b3C+b4AB+b5AC+b6BC+b7A2+b8B2+b9C2。

將方程根據(jù)R2進行調(diào)整，以P<0.05拒絕假設(shè)，得到二項式方程：D=188.59A+311.08B+3 737.90C-3 157.94C2-2 013.68BC-1 256.41AC(P<0.01，r=0.911 3)。

根據(jù)模型回歸方程繪制總評分D對A、B、C的三維效應(yīng)面圖[5]，具體見圖1。由圖可得，10 g乳膏中A、B、C的最佳含量分別為：0.96～1.1、0.46～0.53、0.17～0.26 g。根據(jù)試驗結(jié)果選擇最佳配方：2%A、11%B、5%C。

表2 乳膏基質(zhì)處方星點試驗設(shè)計與評分結(jié)果

圖1 硬脂酸、單硬脂酸甘油酯對和十二烷基硫酸鈉總評分影響的三維效應(yīng)面圖

2.1.2.3 評分標(biāo)準(zhǔn) 查閱文獻[6]和實際情況，光澤度、均勻度和涂展性采用3人進行評分，每項評分取平均值計算。具體評價標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 乳膏基質(zhì)外觀評價標(biāo)準(zhǔn)(n=3)

離心穩(wěn)定性評價：取少量乳膏于2 mL的EP管中，4000 r·min-1離心15 min；耐熱穩(wěn)定性評價：取少量乳膏于適宜容器中密封，于50 ℃水浴鍋中，恒溫保持6 h。耐寒穩(wěn)定性：密封乳膏置-20 ℃，24 h，取出至室溫。評價標(biāo)準(zhǔn)以是否油水分層為主，具體見表4。

表4 乳膏基質(zhì)穩(wěn)定性評價標(biāo)準(zhǔn)(n=3)

評分處理[6]：根據(jù)表3～4評價標(biāo)準(zhǔn)，采用加權(quán)評分法評分。光澤度、均勻度兩個外觀因素各占10%；涂展性、離心穩(wěn)定性、耐熱穩(wěn)定性、耐寒穩(wěn)定性各占20%；總共100分。

2.1.2.4 驗證實驗 根據(jù)最佳配方平行制備3份，得到基質(zhì)為黃色、表面光澤、均勻、細膩的半固體，評分見表5，評分標(biāo)準(zhǔn)同表3～4。

表5 基質(zhì)驗證實驗結(jié)果(n=3)

2.1.3 載藥量的確定 將硬脂酸、單硬脂酸甘油酯置一蒸發(fā)皿中，水相置另一蒸發(fā)皿中，乳化劑加入水中。置80 ℃恒溫水浴鍋上加熱融化攪拌均勻，加入花椒油攪拌均勻。再向油相中分別加入5%、10%、15%、20%藥材提取物無水乙醇溶液，保溫6 min，再加入對應(yīng)量的冰片，加熱使之溶解。攪勻后，將油相加入水相中，沿同一方向邊加邊攪拌，先快后慢，均勻后停止，冷凝。評分標(biāo)準(zhǔn)見表3～4，結(jié)果見表6。

表6 乳膏不同載藥量綜合評分比較(n=3)

由上表可得，藥液加入量為10%時，乳膏各方面評分達到要求，所以確定藥液加入量為10%。

2.2 藥效學(xué)實驗

2.2.1 方法

2.2.1.1 小鼠醋酸扭體實驗 雄性SPF級KM小鼠30只，體質(zhì)量為18～22 g，合格證號SCXK(京)2016-0002，購于北京斯貝福實驗動物科技有限公司，飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)動物房。根據(jù)體質(zhì)量隨機分為3組：模型(0.5%羧甲基纖維素鈉20 mL·kg-1)、乳膏組和陽性組(扶他林乳膏[7])，每組10只，上雙側(cè)耳廓均勻涂抹給藥[8]，其中乳膏組涂藥后按摩20 min，每天1次。實驗第7天，每只小鼠腹腔注射1%冰醋酸[0.1 mL·(10g)-1]致痛[9]，記錄開始出現(xiàn)扭體(拗體潛伏期)的時間及15 min內(nèi)扭體次數(shù)，以潛伏期、扭體次數(shù)和鎮(zhèn)痛百分率表示乳膏的鎮(zhèn)痛活性，依下列公式算出潛伏期延長率、扭體次數(shù)抑制率和鎮(zhèn)痛百分率。比較組間差異。

扭體潛伏期延長率(%)=(給藥后時間-給藥前時間)/給藥前時間×100

(1)

扭體次數(shù)抑制率(%)=(對照組扭體均數(shù)-受試組扭體鼠均數(shù))/對照組扭體均數(shù)×100

(2)

鎮(zhèn)痛百分率(%)=(對照組扭體鼠數(shù)-受試組扭體鼠數(shù))/對照組扭體鼠數(shù)×100

(3)

2.2.1.2 對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 取小鼠30只，隨機分為3組，每組10只，分別為模型組、乳膏組和陽性藥組(復(fù)方醋酸地塞米松乳膏)，實驗時各組分別取對應(yīng)劑量的乳膏、空白乳膏或0.9%氯化鈉溶液，均勻涂布于小鼠脫毛的皮膚上，按摩20 min。每隔2 h給藥1次，連續(xù)給藥3次。每次給藥前，先用0.9%氯化鈉溶液清洗給藥處，待皮膚干燥后給藥。于末次給藥1 h后，在小鼠左耳前后均勻涂抹二甲苯0.05 mL致炎，右耳不涂作為對照。1 h后將小鼠頸椎脫臼處死，再將其耳朵剪下，用8 mm直徑打孔器直接在小鼠左右兩耳郭同一位置打下圓片，稱質(zhì)量。以兩耳片質(zhì)量差值(左耳-右耳)作為程度指標(biāo)。

2.2.3 藥效實驗結(jié)果

2.2.3.1 對小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛實驗的影響 結(jié)果表明，與對照組比較，艾天羊活血止痛按摩乳膏組和陽性藥(扶他林乳膏)組能夠顯著延長小鼠扭體潛伏期和降低小鼠扭體次數(shù)(P<0.05)，且乳膏組和陽性組小鼠鎮(zhèn)痛百分率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示艾天羊活血止痛按摩乳膏有明顯的鎮(zhèn)痛作用，結(jié)果見表7。

表7 乳膏對小鼠醋酸扭體法鎮(zhèn)痛實驗的影響

注：與對照組比較，P<0.05。

2.2.3.2 對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響 結(jié)果表明，與二甲苯模型組比較，艾天羊活血止痛按摩乳膏組和陽性藥(復(fù)方醋酸地塞米松乳膏)組明顯降低二甲苯引起的小鼠耳廓腫脹(P<0.05)，表明艾天羊活血止痛按摩乳膏有明顯的抗炎作用，結(jié)果見表8。

表8 乳膏對二甲苯所致小鼠耳腫脹的影響

注：與二甲苯模型組比較，P<0.05。

腫脹抑制率(%)=(対照組腫脹度-給藥組腫脹度)/空白組腫脹度×100

(4)

3 結(jié)果

本研究運用“藥輔合一”的理念，在乳膏基質(zhì)的制備過程中花椒油既用作油相又發(fā)揮藥效，不僅簡化了制備工藝還減少了輔料的加入。制備的艾天羊活血止痛乳膏光滑、均勻、易涂抹，穩(wěn)定性符合要求；乳膏對醋酸引起的扭體和疼痛，均有明顯的抑制作用；對二甲苯引起的耳廓腫脹有明顯消腫的效果。

4 討論

風(fēng)濕病屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，臨床多以局部疼痛為表現(xiàn)?；钛雇窗茨θ楦嘣从诿耖g驗方，對風(fēng)濕病的治療效果明確。方中君藥川椒[10]具有溫中止痛的功效?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》載：“逐骨節(jié)皮膚死肌，寒濕痹痛?！薄侗静蒌撃俊酚涊d：“純陽之物，…，治風(fēng)寒濕痹?！睕]藥、乳香、延胡索、血竭作為臣藥合用能夠發(fā)揮氣血兼固、活血祛瘀、通經(jīng)活絡(luò)、消腫止痛的作用[11]。外用乳膏具有避免口服給藥可能發(fā)生肝首過效應(yīng)和胃腸滅活的特點，還可以提高藥物療效、延長有效作用時間、減少給藥次數(shù)和自主給藥等優(yōu)點。結(jié)合按摩的手法進一步促進血液循環(huán)、藥物吸收、提高藥物療效。動物實驗結(jié)果表明，活血止痛按摩乳膏能有效地延長小鼠醋酸扭體潛伏期，減少小鼠醋酸扭體次數(shù)和抑制小鼠耳廓腫脹，具有很好的止痛、消炎作用，與十余年良好的臨床應(yīng)用反饋效果一致，體現(xiàn)了該乳膏的確切療效。

“藥輔合一”通常指制劑處方中部分中藥兼任原料和輔料的雙重角色[12]。方中花椒油既是乳膏中的油相，起到承載脂溶性提取物及構(gòu)建乳膏的作用，還能夠發(fā)揮促進藥物透皮吸收的作用，同時作為川椒的

主要藥效部位，可以很好地發(fā)揮驅(qū)寒止痛的作用。花椒油在發(fā)揮藥效的同時，還代替了乳膏的油相，并與冰片一起起到促透劑的作用，有效減少了其他試劑的加入量，不僅節(jié)約資源，也提高了制劑的安全性。

乳膏制備過程中，為避免氣泡產(chǎn)生，攪拌時應(yīng)同一方向攪拌。攪拌時間適當(dāng)，時間過短易導(dǎo)致混合不均勻；時間過長易影響穩(wěn)定性。乳膏制備完成后，儲存及分裝均需注意及時密封，避免表面水分揮發(fā)而出現(xiàn)“結(jié)殼”現(xiàn)象。為了提高穩(wěn)定性，延長有效時間，乳膏儲存環(huán)境溫度在0～20 ℃。

致謝：感謝北京中醫(yī)藥大學(xué)本科生李龍宇、劉子源、劉悅?cè)煌瑢W(xué)在處方篩選過程中對實驗操作的參與。