星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)選苦參總生物堿水提醇沉工藝

覃輝

湖北省荊州市中心醫(yī)院 藥學(xué)部，湖北 荊州 434020

苦參為豆科植物苦參SophoraflavescensAit.的干燥根，具有清熱燥濕、殺蟲(chóng)、利尿的功效。臨床多用于熱痢、便血、黃疸尿閉、赤白帶下、陰腫陰癢、濕疹、濕瘡、皮膚瘙癢、疥癬麻風(fēng)；外治滴蟲(chóng)性陰道炎等[1]。苦參主要含苦參堿、槐定堿、氧化苦參堿、羥基苦參堿等多種生物堿類(lèi)成分[2]，而以上各種藥理活性的發(fā)揮很大程度上依賴(lài)于苦參中所含的總生物堿類(lèi)成分[3-4]。故采取較好的工藝參數(shù)條件，將苦參中總生物堿類(lèi)成分盡可能地從苦參飲片中提取出來(lái)，對(duì)于苦參藥用資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用有著積極的意義。仝燕等[5]的研究表明，水煎煮提取法對(duì)苦參總生物堿提取效率相對(duì)更高，但經(jīng)水提取后的提取液包含了大部分水溶性雜質(zhì)，如多糖類(lèi)。結(jié)合涂瑤生等[6]的研究結(jié)果可知，65%左右的乙醇對(duì)苦參總生物堿具有較好的選擇性。故本研究充分結(jié)合上述二者各自的優(yōu)點(diǎn)采用水煎煮法提取苦參總生物堿，結(jié)合醇沉法對(duì)提取物進(jìn)行純化，獲取其最佳提取工藝，以總生物堿得率和干膏得率的加權(quán)評(píng)分值為響應(yīng)，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化苦參總生物堿的提取工藝，通過(guò)液料比、提取時(shí)間、醇沉濃度等因素水平考察及多因素間的重疊交互作用考察，綜合評(píng)判苦參總生物堿提取率和干膏得率，為苦參中總生物堿提取工藝的優(yōu)化及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

水浴鍋(天津泰斯特，XMTD-2M)；電熱套(天津泰斯特-IB)；分光光度計(jì)(北京通用儀器，TU-1221)；電子秤(上海萬(wàn)寶，ACS-30)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮，RE-52A)。

1.2 試藥

苦參堿對(duì)照品(上海融禾醫(yī)藥科技有限公司，批號(hào)：10035，純度大于98%)；所用試劑均為分析純；水為純化水。

苦參購(gòu)于武漢天濟(jì)中藥材有限公司，批號(hào)為171025，藥材經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室劉安平教授鑒定為豆科植物苦參SophoraflavescensAit的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 苦參提取物中總生物堿含量測(cè)定

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取經(jīng)120 ℃干燥至恒質(zhì)量的苦參堿對(duì)照品適量，以無(wú)水乙醇溶解，配制成每1 mL含10 mg的溶液作為對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取苦參飲片適量，精密稱(chēng)定，加提取用量的水回流，按規(guī)定的時(shí)間提取(提取所用液料比、所需時(shí)間和乙醇沉淀濃度，分別按照表4進(jìn)行)，提取液趁熱濾過(guò)，合并濾液，濃縮至相對(duì)密度為1.15～1.20后，加入95%工業(yè)乙醇攪拌調(diào)節(jié)至醇沉所需濃度，靜止24 h，取上清液，濾渣再加95%工業(yè)乙醇醇沉12 h，合并兩次上清液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中回收乙醇，得苦參流浸膏，流浸膏轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，以少量乙醇潤(rùn)洗燒瓶，洗液轉(zhuǎn)入蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于105 ℃烘3 h，干燥器中放冷即得干膏。取苦參干膏0.2 g，精密稱(chēng)定，置于燒杯中，加入10 mL 2%鹽酸溶液，調(diào)pH 3～4[7-8]，濾過(guò)，液中加入5%NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 10～11[7]，以三氯甲烷萃取3次，分段萃取(依次為濾液體積的1倍、1/2倍、1/2倍)，合并三氯甲烷層，水浴蒸干，殘?jiān)訜o(wú)水乙醇溶解，定容至10 mL，搖勻，作為供試液備用。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批苦參干膏粉(批號(hào)：1606001)5份，照2.1.2項(xiàng)下，自“取苦參干膏0.2 g，精密稱(chēng)定，置于燒杯中”起依法操作，制備供試品溶液，按2.1.5項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 加樣回收試驗(yàn) 各取6份已知含量的同一批次(批號(hào)：1606001)苦參干膏粉，每份供試樣品約0.15 g，精密稱(chēng)定。分別向各供試樣品中準(zhǔn)確加入近等質(zhì)量的苦參堿對(duì)照品，照2.1.5項(xiàng)下條件逐一進(jìn)行測(cè)定。加樣回收率計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.1.5 總生物堿含量測(cè)定 取上述供試品5 mL，精密加硫酸滴定液20 mL，搖勻置水浴上加熱，使殘?jiān)耆芙獠⒊M乙醇，放冷加蒸餾水30 mL，甲基紅指示液4滴，用氫氧化鈉滴定液滴定至溶液顯微黃色，30 s不褪色即達(dá)到滴定終點(diǎn)，按下式計(jì)算苦參堿總生物堿含量。

(1)

(2)

其中：V總為樣品溶液的總體積，mL；V取樣為滴定時(shí)供試品的取樣體積，mL；VNaoH為氫氧化鈉滴定液的消耗體積，mL；T為氫氧化鈉滴定液相對(duì)總生物堿的滴定度，5.529 mg·mL-1。

2.2 干膏得率

取干燥至恒重的蒸發(fā)皿，精密加入流浸膏100 mL，水浴蒸干，于105 ℃烘3 h，干燥器中放冷，精密稱(chēng)質(zhì)量，計(jì)算即得。

2.3 苦參中總生物堿的優(yōu)選提取工藝設(shè)計(jì)

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 通過(guò)對(duì)多個(gè)影響綜合評(píng)分因素全面考察之后，本研究最終選取液料比(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)和醇沉濃度(C)等4個(gè)關(guān)鍵影響因素作為本次實(shí)驗(yàn)研究的自變量，鑒于提取次數(shù)為非連續(xù)型變量，試驗(yàn)設(shè)計(jì)過(guò)程中可不考慮該因素的回歸分析[8]，結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)及有關(guān)文獻(xiàn)[7]，暫定提取次數(shù)為2次。依據(jù)Box-Behnken中心組合的設(shè)計(jì)基本原理，取液料比A(倍)、提取時(shí)間B(h)、醇沉濃度C(%)3個(gè)因素，每個(gè)因素下各設(shè)定低、中、高3個(gè)水平，依次賦值為-1、0、+1。實(shí)驗(yàn)組中心組合設(shè)計(jì)因素和各自水平見(jiàn)表3，采用加權(quán)評(píng)分法計(jì)算苦參浸膏得率和總生物堿的得率兩者總權(quán)重評(píng)分，以總評(píng)分值為評(píng)價(jià)指標(biāo)，按Box-Behnken中心設(shè)計(jì)方案進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表4。

表3 Box-Behnken設(shè)計(jì)中心組合因素水平

表4 Box-Behnken試驗(yàn)方案結(jié)果

注：總權(quán)重評(píng)分值=苦參干膏得率評(píng)分值+苦參總生物堿得率評(píng)分值；苦參干膏率評(píng)分值=(苦參干膏率測(cè)得值/苦參干膏率測(cè)得平均值)×40；苦參總生物堿提取率評(píng)分值=(苦參總生物堿提取率/苦參總生物堿提取率平均值)×60。

2.3.2 模型擬合與方差分析 運(yùn)用Design-Expert設(shè)計(jì)軟件對(duì)表4中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，計(jì)算3個(gè)自變量提取液料比(A)、提取時(shí)間(B)和乙醇濃度(C)同應(yīng)變量總權(quán)重評(píng)分值(Y)之間的線性擬合回歸方程：Y=109.44+6.64A+2.93B-3.76 C+2.07B-2.15AC-0.58BC-6.92A2-3.65B2-9.52C2。從軟件系統(tǒng)方差分析給出的結(jié)果可知：本實(shí)驗(yàn)擬合度極為顯著(P=0.000 3<0.01)，表明本次建立的試驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谶x定的因素范圍內(nèi)具有較好的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；設(shè)計(jì)模型的平方和為F=1 273.31，表明該模型具有顯著性?；貧w方程中自變量以A、C、A2、C2等對(duì)總權(quán)重評(píng)分(Y)的線性效應(yīng)最為突出(P<0.01)，一次項(xiàng)即單因素中，以液料比(A)對(duì)因變量的總權(quán)重評(píng)分影響最為突出，醇沉濃度(C)次之；其中液料比(A)對(duì)總權(quán)重評(píng)分的影響為正相關(guān)，醇沉濃度(C)對(duì)總權(quán)重評(píng)分的影響為負(fù)相關(guān)；而提取時(shí)間(B)對(duì)總權(quán)重評(píng)分的影響差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；回歸方程二次項(xiàng)中以A2、C2對(duì)總權(quán)重評(píng)分的線性效應(yīng)最為突出(P<0.01)，其中以乙醇濃度(C)的影響最為突出，液料比(A)影響次之；響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 響應(yīng)面模型方差分析結(jié)果

本試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛿M合極顯著(P=0.000 3<0.01)、R2=0.963 5、失擬項(xiàng)P=42.41值>0.05表明，回歸方程擬合度高，試驗(yàn)測(cè)定值與模型的預(yù)測(cè)值二者較為接近，模型不存在顯著失擬，故能夠應(yīng)用該模型對(duì)該提取工藝進(jìn)行響應(yīng)面分析。將數(shù)據(jù)代入Design-Expert軟件運(yùn)算，系統(tǒng)生成液料比、提取時(shí)間和乙醇濃度因素對(duì)于響應(yīng)值的三維曲面，見(jiàn)圖1～3，響應(yīng)值的等高線分別見(jiàn)圖4～6。

圖3 醇沉濃度、提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值三維圖

圖4 提取時(shí)間、液料比對(duì)響應(yīng)值等高線圖

圖5 乙醇濃度、液料比對(duì)響應(yīng)值等高線圖

圖6 醇沉濃度、提取時(shí)間對(duì)響應(yīng)值等高線圖

直觀對(duì)比以上3組曲面響應(yīng)圖可知，自變量A(液料比)與自變量B(提取時(shí)間)的響應(yīng)曲面三維圖像呈一個(gè)陡峭的曲面，故液料比與提取時(shí)間的交互作用對(duì)應(yīng)變量Y(總權(quán)重評(píng)分的影響較大)；提取液料比(A)醇沉濃度(C)兩個(gè)交互作用對(duì)總權(quán)重評(píng)分的影響較小，圖1～3的均是向下開(kāi)口的凸面，結(jié)合回歸方程可知，本次實(shí)驗(yàn)所考察的范圍內(nèi)存在響應(yīng)值的最大值；等高線圖為圓形至橢圓形，響應(yīng)面為高度卷曲而規(guī)則的曲面，表明自變量與因變量之間的函數(shù)關(guān)系不能完全采用一元線性方程描述，而采用多元線性方程則能夠更全面地表述液料比(A)、提取時(shí)間(B)、醇沉濃度(C)與總權(quán)重評(píng)分值(Y)之間的線性關(guān)系。

經(jīng)過(guò)Design-Expert軟件統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)分析，系統(tǒng)預(yù)測(cè)和推薦的最佳參考工藝為：液料比9.23倍、提取時(shí)間2.60 h，醇沉濃度70.72%，該工藝條件下理論最優(yōu)評(píng)分可達(dá)112.89分，總生物堿提取率可達(dá)1.63%、干膏率達(dá)22.51%。為貼近工業(yè)實(shí)際操作，將該工藝參數(shù)調(diào)整為：液料比9倍量、提取時(shí)間為3 h、乙醇濃度為70%進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。

2.3.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱(chēng)取苦參飲片3份，每份100.0 g，按優(yōu)選的工藝條件進(jìn)行總生物堿提取，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果 %

由表5中數(shù)據(jù)可知，結(jié)果與回歸方程的預(yù)測(cè)值基本接近，從而更加證實(shí)了該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，故采用中心組合星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化苦參中總生物堿提取工藝是具有實(shí)踐和理論可行性的。

3 討論

本次研究采用了星點(diǎn)-設(shè)計(jì)響應(yīng)面中心組合法優(yōu)化苦參中總生物堿提取工藝，對(duì)液料比、提取時(shí)間和醇沉濃度等自變量及自變量之間的交互作用進(jìn)行考察。將響應(yīng)面三維圖結(jié)合系統(tǒng)給出多元線性回歸方程發(fā)現(xiàn)，一次項(xiàng)中對(duì)苦參中總生物堿提取有極顯著性影響的主要是液料比和醇沉濃度，其中以液料比(A)對(duì)總權(quán)重評(píng)分的影響最大，醇沉濃度(C)次之；液料比(A)對(duì)總權(quán)重評(píng)分的影響為正相關(guān)，而醇沉濃度(C)對(duì)總權(quán)重評(píng)分的影響為負(fù)相關(guān)，從而提示醇沉濃度并不是越大越好，乙醇濃度在達(dá)到78%以后，總評(píng)分顯著下降；而提取時(shí)間(B)為不顯著的影響因素(P>0.01)，在一定范圍內(nèi)可以適當(dāng)調(diào)整以滿(mǎn)足生產(chǎn)需求即可。二次項(xiàng)中，以A2、C2對(duì)總權(quán)重評(píng)分的線性效應(yīng)最為顯著(P<0.01)，其中以醇沉濃度(C)的影響最大、液料比(A)影響次之，從而提示醇沉濃度對(duì)浸膏的收率及浸膏中生物堿的含量有較大影響，是生產(chǎn)中應(yīng)該監(jiān)控的重要因素；響應(yīng)面三維曲面圖提示，交互項(xiàng)中液料比(A)和提取時(shí)間(B)的交互作用對(duì)苦參總生物堿提取率有較大影響。

綜合本次實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果可知，提取液料比控制在8倍以上、提取時(shí)間2 h以上、乙醇濃度范圍在66%～78%時(shí)，總權(quán)重評(píng)分值均大于110分，說(shuō)明66%～78%乙醇對(duì)苦參總生物堿具有良好的選擇性，實(shí)際操作時(shí)可根據(jù)生產(chǎn)需求進(jìn)行合理選擇；考慮到工業(yè)上提取液料比大于10倍后，提取液的濃縮體積較大對(duì)提取、濃縮所需設(shè)備及耗能提出更高的要求；雖然單因素中醇沉濃度對(duì)總生物堿提取率影響雖占其次，但醇沉不需要額外耗能(乙醇可回收利用)，并且能夠沉淀大部分雜質(zhì)成分，故在保障干膏率的基礎(chǔ)上可采取適當(dāng)延長(zhǎng)醇沉?xí)r間以提高苦參總生物堿提取率。提取時(shí)間為不顯著因素，同時(shí)考慮到工業(yè)上提取2次基本上滿(mǎn)足生產(chǎn)效益的需要，結(jié)合本次所優(yōu)化的工藝參數(shù)，得苦參總生物提取的最優(yōu)工藝條件為：液料比9倍量，提取2次、3 h/次，醇沉淀濃度為70%。