刺齒報春苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因的鑒定及序列分析

覃信梅　盧永彬　江祈貴　黃章平　黃夕洋

摘要：肌醇半乳糖苷合成酶基因與植物光合產(chǎn)物運輸、種子耐脫水性、抵御生物與非生物脅迫和自我保護等生理生化過程密切相關(guān)?；诖听X報春苣苔（Primulina spinulosa）轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，獲得（鑒定）1個肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析結(jié)果表明，該基因全長1 347 bp（GenBank登錄號為MG521418），開放閱讀框（ORF）為1 008 bp，共編碼335個氨基酸。進一步基于氨基酸序列的分析表明，該基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.05 ku，理論等電點為5.09，為親水性蛋白，含有1個與糖基轉(zhuǎn)移酶家族蛋白相同的保守結(jié)構(gòu)域;刺齒報春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因與同科的旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，F(xiàn)J222452）的相似性高達90%，兩者在系統(tǒng)進化樹上聚為1支。研究結(jié)果為進一步研究刺齒報春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子結(jié)構(gòu)和功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：刺齒報春苣苔;肌醇半乳糖苷合成酶基因;基因序列分析;信號肽

中圖分類號： S184文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0056-04

肌醇半乳糖苷合成酶（galactinol synthase，簡稱GolS）是糖基轉(zhuǎn)移酶家族的一個亞家族，能催化半乳糖和肌醇反應(yīng)合成肌醇半乳糖苷，為棉子糖系列寡糖的合成提供半乳糖基。棉子糖系列寡糖（raffinose family oligosaccharides，簡稱RFOs）主要包括棉子糖、水蘇糖、毛蕊草糖等，是高等植物中重要的可溶性小分子滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[1]。當植物受到環(huán)境脅迫時，可以快速合成并積累不同種類的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)來維持植物細胞內(nèi)正常的生理機能，調(diào)節(jié)植物以適應(yīng)環(huán)境脅迫，使植物免受脅迫傷害。一些體內(nèi)不含棉子糖系列寡糖或其含量極低的植物，在受到干旱、高鹽和低溫等逆境脅迫后，棉子糖系列寡糖會迅速積累，植株的抗逆性也隨之增強。

肌醇半乳糖苷合成酶是植物體內(nèi)棉子糖系列寡糖合成起始的關(guān)鍵酶，調(diào)控著植物體內(nèi)棉子糖系列寡糖的積累[2]。目前已有研究表明，GolS基因在一些植物受到逆境脅迫后表達量上升，從而參與響應(yīng)逆境脅迫，如水稻（Oryza sativa）2個GolS基因在干旱、鹽處理下的表達量大幅度上調(diào)，其中1個還可以積極響應(yīng)冷脅迫[3]。目前研究者已經(jīng)從擬南芥（Arabidopsis thaliana）中分離出7個GolS基因，其中AtGolS1、AtGolS2由干旱、鹽脅迫誘導，AtGolS2基因在擬南芥中的超表達提高了肌醇半乳糖苷、棉子糖的含量，并增強了植物的抗旱能力，而AtGolS3受到低溫脅迫誘導[4-5]?？Х龋–offea arabica）中有3個GolS類基因，CaGolS2的表達量在干旱、鹽脅迫下上調(diào)，CaGolS3的表達量在干旱脅迫下上調(diào)，而CaGolS1能夠參與調(diào)控植物響應(yīng)干旱、低溫及鹽脅迫[6]。在楊樹（Populus）的9個GolS基因中，PtrGolS2、PtrGolS8受到低溫脅迫的誘導，PtrGolS3、PtrGolS4和PtrGolS6受到鹽脅迫的誘導，而所有PtrGolS基因都參與到楊樹植株對干旱脅迫的應(yīng)答中[7-8]。木薯（Manihot esculenta）中有7個GolS類基因，其中MeGolS1、MeGolS5受到干旱誘導，表達量明顯上調(diào)，能更迅速地積極響應(yīng)干旱脅迫[9]。在甘藍型油菜[10-11]、小鹽芥[12]和日本黃連[13]等植物中也存在類似的生理現(xiàn)象?？梢奊olS基因在植物抵抗干旱、寒冷等逆境脅迫中起到重要作用。

刺齒報春苣苔（Primulina spinulosa）是苦苣苔科（Gesneriaceae）報春苣苔屬多年生草本植物，其葉肉質(zhì)多汁，為我國廣西西南部所特有。目前，關(guān)于刺齒報春苣苔的報道甚少，主要研究集中在其離體快速繁殖方面[14]，而對其功能基因的研究未見報道。報春苣苔屬植物一般生長于陰濕的石灰?guī)r巖壁上或洞穴中，而刺齒報春苣苔則生長在陽光直射、光禿裸露的石灰?guī)r縫隙中，屬于極端的耐旱種類。為了探討刺齒報春苣苔的耐旱機制，筆者對刺齒報春苣苔進行了轉(zhuǎn)錄組測序，通過同源序列搜索（BLAST）篩選獲得了刺齒報春苣苔的GolS基因序列，并對該基因序列及其編碼的蛋白質(zhì)進行了分析，旨在為刺齒報春苣苔耐旱分子機制的研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

刺齒報春苣苔試驗材料采自廣西扶綏縣渠黎鎮(zhèn)。采集同一居群的3～5個個體的頂端嫩葉（長度<1 cm），采后迅速將其放入液氮中速凍保存。

1.2方法

1.2.1RNA的提取、建庫和測序用改良的TRIzol法對總RNA進行提取[15]，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司對檢測合格的RNA進行建庫和測序。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，隨后加入fragmentation buffer（片斷化緩沖液）將mRNA打斷成短片段，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物（randomhexamers）合成一鏈cDNA，然后加入緩沖液、dNTPs和DNA polymerase Ⅰ（DNA聚合酶Ⅰ）、RNase H（核糖核酸酶H）合成二鏈cDNA，再用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA。將純化的雙鏈cDNA先進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，再用AMPure XP beads進行片段大小的選擇，最后進行PCR擴增，并用AMPure XP beads純化PCR產(chǎn)物，得到最終的文庫。文庫構(gòu)建完成后，先用Qubit 2.0進行初步定量，稀釋文庫至1.5 ng/μL，隨后使用Agilent 2100對文庫的insert size（插入片段大?。┻M行檢測，insert size符合預期后，使用Q-PCR（定量PCR）方法對文庫的有效濃度進行準確定量（文庫的有效濃度應(yīng)>2 nmol/L），以保證文庫質(zhì)量。最后用IlluminaHiSeqTM 2500對制備好的文庫進行測序。

1.2.2序列分析和系統(tǒng)樹構(gòu)建在GenBank公共數(shù)據(jù)庫中下載苦苣苔科旋蒴苣苔（Boea hygrometrica）的GolS基因（登錄號：FJ222452），使用Bioedit中的local BLAST功能，以測序獲得的刺齒報春苣苔轉(zhuǎn)錄組為搜索庫，找出刺齒報春苣苔的GolS類基因。用DNAman、Finder、TMPRED、SWISS-MODEL、NetPhos 2.0、SignaIP 4.1等軟件進行序列的開放閱讀框（ORF）、編碼氨基酸、編碼蛋白的理化性質(zhì)分析。將篩選到的刺齒報春苣苔GolS基因序列在GenBank中進行BLAST搜索，找到與之高度相似的同源序列，并下載11種植物的同源序列，基于該基因翻譯的氨基酸序列，用DNAman軟件進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，構(gòu)建方法參考文獻[16]。

2結(jié)果與分析

2.1基因的生物信息學分析

在本研究測序獲得的P. spinulosa轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中（測序深度約為6G），筆者只篩選到1個GolS基因，該基因序列全長1 347 bp（GenBank登錄號為MG521418），使用美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站上的NCBI ORF Finder和生物信息學軟件DNAman對該基因序列進行分析，結(jié)果表明，該序列包含1個1 008 bp的開放閱讀框，編碼335個氨基酸。

2.2編碼蛋白質(zhì)的分析和疏水性預測

通過DNAman軟件分析得出，本研究中GolS基因編碼的蛋白質(zhì)分子量為38.05 ku， 等電點（pI）為5.09。從蛋白質(zhì)序列的疏水性分析結(jié)果可以看出，GolS基因編碼的肽鏈中疏水值最大約為3.66，最小值約為-2.86，平均值是-0.18，屬于親水性蛋白。

用在線分析軟件（http：//www.expasy.org/tools/protparam.html）進行分析可知，該蛋白質(zhì)帶負電荷的氨基酸[天冬氨酸（Asp）+谷氨酸（Glu）]總數(shù)為41個，帶正電荷的氨基酸[精氨酸（Arg）+賴氨酸（Lys）]總數(shù)為29個，分子式為C1 733H2 618N434O498S17，不穩(wěn)定系數(shù)為 36.65，屬于穩(wěn)定性蛋白質(zhì)。

2.3功能結(jié)構(gòu)域的分析

將編碼的氨基酸序列用NCBI的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool進行分析，發(fā)現(xiàn)該蛋白質(zhì)具有1個與糖基轉(zhuǎn)移酶家族（glycosyltransferases superfamily）蛋白相同的保守活性位點[JP3]（conserved active sites，簡稱CAS）結(jié)構(gòu)域。

2.4跨膜預測

用跨膜蛋白數(shù)據(jù)庫TMbase（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED_form. html）預測GolS蛋白的跨膜區(qū)域。從可以看出，該蛋白不存在跨膜結(jié)構(gòu)蛋白，為膜內(nèi)蛋白。

2.5蛋白質(zhì)的磷酸化預測

通過在線蛋白磷酸化位點分析軟件NetPhos 2.0 Server對GolS基因編碼的蛋白進行預測，結(jié)果表明，該多肽鏈中預測分值在0.5以上的可能的磷酸化位點共有13個。其中，絲氨酸（Ser）可能的磷酸化位點共有3個，分別位于肽鏈的18、22、203位;蘇氨酸（Thr）可能的磷酸化位點共有3個，分別位于肽鏈的218、276、335位;酪氨酸（Tyr）可能的磷酸化位點共有7個，分別位于肽鏈的42、105、125、190、205、234、298位。

2.6糖基化位點和信號肽的分析

采用NetNGlyc 1.0對GolS基因編碼的氨基酸序列進行分析，發(fā)現(xiàn)有2個潛在的N-糖基化位點，但是糖基化一般發(fā)生在信號受體蛋白分子上，而用SignaIP 4.1軟件預測結(jié)果顯示其沒有信號肽，說明在體內(nèi)這些預測的潛在的N-糖基化位點可能不能真正地被糖基化。

2.7蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)預測

用SOPMA軟件對GolS蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，如圖6所示，α-螺旋約占37.91%，延伸直鏈約占23.58%，β-轉(zhuǎn)角約占10.15%，無規(guī)則卷曲約占28.36%，其中α-螺旋為主要結(jié)構(gòu)。

利用SWISS-Model對刺齒報春苣苔GolS蛋白的三級結(jié)構(gòu)進行預測，結(jié)果表明，GolS蛋白的三級結(jié)構(gòu)含有8個α-螺旋，6個β-折疊，其間由無規(guī)則卷曲連接。

2.8系統(tǒng)發(fā)育分析

刺齒報春苣苔GolS基因編碼的氨基酸與旋蒴苣苔（Boea hygrometrica，登錄號：FJ222452）GolS基因編碼的氨基酸序列的相似性為90%，在系統(tǒng)樹上聚為1支。

3討論

已有報道顯示，旋蒴苣苔中的GolS基因響應(yīng)干旱脅迫，旋蒴苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因BhGolS1的啟動子上含有4個與WRKY轉(zhuǎn)錄因子特異結(jié)合的順式作用元件W-box，已證實該元件是旋蒴苣苔響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵因子[17]。在對旋蒴苣苔的研究中發(fā)現(xiàn)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子是通過ABA（脫落酸）信號轉(zhuǎn)導途徑來調(diào)控BhGolS1的表達以響應(yīng)干旱脅迫的，而[CM（25]且擬南芥中的AtGolS1、AtGolS2[4]和毛果楊中的PtrGolS2、PtrGolS5-7[8]均被證明是受ABA誘導的。本研究通過轉(zhuǎn)錄組測序獲得的刺齒報春苣苔GolS基因和已知的與抗旱相關(guān)的旋蒴苣苔GolS基因的相似性很高，推測其可能在刺齒報春苣苔耐旱過程中起重要作用，但是其作用機制是否與旋蒴苣苔相似，也受到轉(zhuǎn)錄因子WRKY的調(diào)控，因此可見參與ABA依賴的信號轉(zhuǎn)導途徑需要深入研究。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的GolS基因受到了2類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，熱激因子（HSFs）可以激活AtGolS1的表達[18]，DREB1A/CBF3可以激活AtGolS3的表達和增強抗旱耐凍性[4]。至于刺齒報春苣苔的GolS基因否也受到不同轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其具體機制還有待進一步研究。

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