土壤宏基因組中芽孢桿菌信號(hào)肽的克隆及分析

唐國(guó)鑫，陳寧

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

土壤宏基因組中芽孢桿菌信號(hào)肽的克隆及分析

唐國(guó)鑫1，2，陳寧1*

（1.天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津300457；2.中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

從土壤宏基因組中篩選獲得在芽孢桿菌中高效分泌重組蛋白的信號(hào)肽。通過(guò)數(shù)據(jù)分析，將預(yù)測(cè)到的信號(hào)肽DNA片段與蛋白酶基因融合，在枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB800和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）DL6中表達(dá)，進(jìn)行胞外蛋白酶酶活測(cè)定。篩選得到25個(gè)可能來(lái)源于G+菌的信號(hào)肽序列，胞外蛋白酶活性分析的結(jié)果顯示，有14個(gè)信號(hào)肽具有較好的分泌蛋白酶的能力，其中引導(dǎo)效果最好的信號(hào)肽（sig20）是蛋白酶自身信號(hào)肽的1.64倍。將高分泌信號(hào)肽轉(zhuǎn)化到地衣芽孢桿菌中，證實(shí)其在地衣芽孢桿菌同樣具有較好的引導(dǎo)效果。應(yīng)用生物信息學(xué)與宏基因組學(xué)相結(jié)合的方法，可有效獲得高效的芽孢桿菌信號(hào)肽序列，為蛋白質(zhì)高效分泌表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建提供豐富的表達(dá)元件。

宏基因組；信號(hào)肽；芽孢桿菌；蛋白酶

眾所周知，芽孢桿菌被作為工業(yè)中外源蛋白表達(dá)的優(yōu)良宿主。它們的發(fā)酵成本相對(duì)低廉［1］。其中的枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌已通過(guò)美國(guó)食品藥物管理局一般認(rèn)為安全（generallyreeonized as safe，GRAS）認(rèn)證［2-3］。同時(shí)，芽孢桿菌可直接將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中［4］，簡(jiǎn)化了目的產(chǎn)物的提取和純化過(guò)程。有相關(guān)報(bào)道，芽孢桿菌分泌外源目標(biāo)蛋白最高可達(dá)到20～25 g/L［5］。

信號(hào)肽是一段通常位于分泌蛋白的新生肽鏈N端的氨基酸序列，并將新生的肽鏈引導(dǎo)到細(xì)胞特定的部位。信號(hào)肽一般含15～45個(gè)氨基酸殘基［6］，一般分為三個(gè)區(qū)域：帶正電的N端，含有堿性氨基酸，可與細(xì)胞膜上的易位蛋白和帶負(fù)電的磷脂相互作用［7-8］；中間為疏水的H區(qū)，含大量疏水氨基酸；C端為加工區(qū)，含小分子的氨基酸，是信號(hào)肽的切割位點(diǎn)［9-10］，信號(hào)肽酶識(shí)別出信號(hào)肽C端的切割位點(diǎn)，將信號(hào)肽從成熟蛋白上切除［11］。

篩選高效信號(hào)肽是提高蛋白質(zhì)分泌量的一個(gè)有效手段。BROCKNEIER U等［12］篩選到了對(duì)角質(zhì)酶分泌引導(dǎo)效率不同的信號(hào)肽；DEGERING C等［13］通過(guò)篩選，獲得了7個(gè)枯草芽孢桿菌蛋白酶（BPN′）的野生型信號(hào)肽引導(dǎo)效率高的信號(hào)肽。范鑫［14］通過(guò)篩選24個(gè)枯草芽孢桿菌信號(hào)肽，其中最好的信號(hào)肽YnfF使木聚糖酶的胞外酶活達(dá)到37.2 U/mL。

宏基因組是由HANDELSMAN J等［15］于1998年首次提出的概念。其定義為自然環(huán)境獲得的樣品中所有微生物基因組的總和。自然環(huán)境中超過(guò)99%的微生物不能通過(guò)傳統(tǒng)的方式培養(yǎng)，這極大的限制了人們認(rèn)識(shí)和了解微生物［16］。宏基因組學(xué)以環(huán)境中全部微生物的脫氧核糖核酸（deoxyribose nucleic acid，DNA）作為研究對(duì)象。相對(duì)于傳統(tǒng)的篩菌方法獲得的微生物基因資源，宏基因組學(xué)避免了微生物分離培養(yǎng)的難題，極大的拓展了對(duì)微生物資源的利用［17-19］。

本研究通過(guò)生物信息學(xué)的方法從宏基因組數(shù)據(jù)中獲得信號(hào)肽，在枯草芽孢桿菌（B.subtilis）WB800得到有效的表達(dá)和分泌，進(jìn)一步對(duì)5條胞外蛋白酶活性較好的信號(hào)肽在地衣芽孢桿菌中進(jìn)行了驗(yàn)證，并對(duì)這些信號(hào)肽進(jìn)行了結(jié)構(gòu)解析，為蛋白高效分泌表達(dá)體系的構(gòu)建奠定了較好的基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1菌株和質(zhì)粒

大腸桿菌（Escherichia coli）DH5α、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）WB800、地衣芽孢桿菌（Bacillus lincheniformis）DL6：本實(shí)驗(yàn)室保存菌種；大腸桿菌-枯草桿菌穿梭質(zhì)粒pHT43：本實(shí)驗(yàn)室保存；重組質(zhì)粒pBE980B-pro（含有由芽孢桿菌組成型啟動(dòng)子P43控制表達(dá)的芽孢桿菌堿性蛋白酶基因（pro，GenBank：AR691047），自身攜帶有一個(gè)野生型Pro309信號(hào)肽）：本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建［20］。

1.1.2試劑及樣品

限制性?xún)?nèi)切酶、T4 DNA連接酶：美國(guó)Thermo公司；高保真DNA聚合酶Cobuddy、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒：北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-riborucleo side triphosphate，dNTP）、三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）和氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素等抗生素：北京Solarbio公司；酪蛋白：美國(guó)Sigma公司。其他化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

宏基因組來(lái)源于天津大港冬季的堿性土壤，土壤宏基因組DNA的提取和純化采用美國(guó)OMEGA土壤DNA提取試劑盒完成，宏基因組DNA序列測(cè)定和拼接由蘇州金維智公司完成。聚合酶鏈?zhǔn)椒词剑╬olymerase chain reaction，PCR）引物合成和DNA測(cè)序均由北京華大基因和蘇州金維智公司完成。

1.1.3培養(yǎng)基和溶液

固體LB培養(yǎng)基：5 g/L酵母粉、10 g/L氯化鈉、10 g/L蛋白胨、15 g/L瓊脂粉，LB牛奶平板添加1%脫脂奶粉用于枯草芽孢桿菌胞外分泌的蛋白酶水解圈分析。

芽孢桿菌電轉(zhuǎn)化復(fù)蘇培養(yǎng)基為包含0.5 mol/L的山梨醇和0.38 mol/L的甘露醇的LB培養(yǎng)基。

2%酪蛋白溶液：酪蛋白溶于pH9.0甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（0.05 mol/L）中，用于測(cè)蛋白酶酶活。0.4 mol/L三氯乙酸用于終止蛋白酶反應(yīng)。

1.2儀器與設(shè)備

SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱、SKY-2111B恒溫?fù)u床：上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；ECM399電擊儀：美國(guó)HarvardApparatus公司；Epoth 2TC酶標(biāo)儀：美國(guó)BioTek公司；紫外酶標(biāo)板：德國(guó)GreinerBio-OneGmbH公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1信號(hào)肽篩選載體的構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物up-promoter（5′-CTCGTCAAACATCACCC TCTT-3′）和down-MC（5′-CTTGGAATTGTGCTGAAG CT-3′），以pBE980B-pro質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增獲得包含pro基因完整表達(dá)盒的片段。PCR程序?yàn)椋侯A(yù)變性98℃，3 min；擴(kuò)增：95℃，20s，52℃，20s，72℃，45s，30個(gè)循環(huán)；補(bǔ)齊：72℃，10min。將PCR產(chǎn)物純化后與經(jīng)過(guò)SmaⅠ-NheⅠ雙酶切并平端化處理的pHT43載體部分連接，獲得了重組質(zhì)粒pHT43-pro，該質(zhì)粒去除了原質(zhì)粒上由異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-d-thiogalactoside，IPTG）誘導(dǎo)的外源基因表達(dá)片段，可組成型表達(dá)芽孢桿菌蛋白酶。

再設(shè)計(jì)引物mPro 5′-GCTAAGGATCCGCTGAAGAA GCAAAAGAAAAATA-3′（下劃線(xiàn)處為BamHⅠ酶切位點(diǎn)），以pHT43-pro質(zhì)粒為模板，down-MC為下游引物，擴(kuò)增出不含信號(hào)肽的蛋白酶成熟肽基因片段，PCR程序與前文一致。用BamHⅠ和PstⅠ切下蛋白酶基因，同樣的酶切下pHT43-pro的pHT43載體部分，連接后得到重組質(zhì)粒，命名為pHT43-mpro（mpro為不含信號(hào)肽的芽孢桿菌蛋白酶成熟肽基因片段），該質(zhì)粒用于不同信號(hào)肽的篩選。土壤宏基因組預(yù)測(cè)獲得的信號(hào)肽DNA序列分別與蛋白酶基因進(jìn)行融合，獲得含有不同信號(hào)肽的重組質(zhì)粒pHT43-SP-mpro。

1.3.2枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化及初篩

枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化均采用相同的電擊轉(zhuǎn)化的方式，取5～10 μL（約500 ng）質(zhì)粒與100 μL B.subtilisWB800感受態(tài)細(xì)孢混合，放入預(yù)冷的2 mm電擊杯中，冰浴2 min后取出，置于電擊儀中，用1 750 V的電壓電擊，電擊后立刻加入1 mL復(fù)蘇培養(yǎng)基，37℃、220 r/min復(fù)蘇培養(yǎng)3 h，涂布于含有10 μg/mL氯霉素和1%脫脂奶粉的LB平板，37℃過(guò)夜培養(yǎng)，觀察菌落和水解圈。通過(guò)測(cè)定蛋白水解圈大小與菌落直徑的比值，進(jìn)行初篩。

1.3.3蛋白酶酶活測(cè)定

配制不同質(zhì)量濃度的酪氨酸溶液，讀取其在波長(zhǎng)280nm下的吸光度值，以酪氨酸質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，以波長(zhǎng)280nm下的吸光度值為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)［21］。結(jié)果顯示酪氨酸質(zhì)量濃度在0～400 μg/mL范圍內(nèi)具有很好的線(xiàn)性關(guān)系，R2為0.999。酶活定義為在50℃、pH 9.0條件下，每分鐘蛋白酶水解酪蛋白產(chǎn)生1 μg的酪氨酸為一個(gè)酶活單位（U）［21］，酶活計(jì)算公式如下：

式中：X—酶活，U；269.8—標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率；Y—OD280nm；2.266—截距；4—稀釋倍數(shù)，即1 mL反應(yīng)體系里實(shí)際只含1/4毫升上清液；10—反應(yīng)時(shí)間，min。

將重組B.subtilisWB800在37℃，220 r/min培養(yǎng)24 h的培養(yǎng)液以12000r/min離心1min沉淀菌體，取250 μL上清液在50℃水浴中溫浴2 min后，加入pH 9.0的2%酪蛋白溶液250 μL，50℃保溫10 min，立刻加入500 μL濃度為0.4 mol/L三氯乙酸終止反應(yīng)，12 000 r/min離心10 min，取200 μL上清液于酶標(biāo)儀中測(cè)定OD280nm。

2　結(jié)果與分析

2.1宏基因組信號(hào)肽數(shù)據(jù)庫(kù)的建立

土壤宏基因組DNA的抽提、純化依照說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行，最終獲得的DNA純度A260nm/A280nm為1.87，質(zhì)量濃度228.8 ng/μL，符合宏基因組DNA測(cè)序的要求，并由蘇州金維智公司進(jìn)行了高通量測(cè)序和初步的拼接注釋。結(jié)果表明該測(cè)序具有較好的質(zhì)量。通過(guò)數(shù)據(jù)拼接，獲得了37 284個(gè)大于500 bp的片段，初步比對(duì)獲得了70 072個(gè)可能的基因。利用在線(xiàn)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/）分析，并結(jié)合在線(xiàn)信號(hào)肽預(yù)測(cè)工具SignalP 4.1 Server（http：//www. cbs.dtu.dk/services/SignalP/），最終獲得了398個(gè)可能含有信號(hào)肽序列的新基因（與Genbank數(shù)據(jù)比對(duì)，全肽序列的同源性≤90%），構(gòu)建了含信號(hào)肽序列的基因數(shù)據(jù)庫(kù)（數(shù)據(jù)未顯示）。再根據(jù)蛋白的同源性關(guān)系，篩選了其中可能來(lái)源于G+菌的含有可能的分泌性信號(hào)肽的新基因34個(gè)，對(duì)這些基因N端編碼的70個(gè)AA用SignalP 4.1 Server進(jìn)行分析，獲得了可能的信號(hào)肽序列和信號(hào)肽酶的切割位點(diǎn)，將這些信號(hào)肽序列在信號(hào)肽數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.signalpeptide.com/）中進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)預(yù)測(cè)的信號(hào)肽均為新的信號(hào)肽序列，其序列被用于在芽孢桿菌中進(jìn)行外源蛋白的分泌表達(dá)分析。

2.2信號(hào)肽的初篩

圖1　不同信號(hào)肽-蛋白酶產(chǎn)生的水解圈Fig.1 Hydrolyzed circles of different signal peptides-protease

將不同的信號(hào)肽插入到信號(hào)肽篩選載體pHT43-mpro的BamHⅠ位點(diǎn)處，與芽孢桿菌堿性蛋白酶基因pro融合，成功構(gòu)建了25個(gè)信號(hào)肽重組質(zhì)粒，獲得的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化到B.subtilisWB800中，進(jìn)行初篩。根據(jù)水解圈與菌落比值大小并與含野生型信號(hào)肽質(zhì)粒pHT43-pro的重組菌株進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)圖1（未完全列出），將不同水平的信號(hào)肽分成了四組：高分泌組包括sig8、sig12、sig13、sig20、sig27、sig34；中等分泌組包括sig18、sig24、sig26、sig28、sig30、sig31、sig37、sig40；低分泌組包括sig15、sig21、sig29、sig32、sig36、sig41，差分泌組包括sig17、sig22、sig35、sig38、sig39。其中高分泌組的水解圈比值高于野生型，中等分泌組的水解圈比值與野生型相當(dāng)，差分泌組的水解圈很小，有的甚至難以測(cè)定。

2.3胞外分泌蛋白酶活性定量分析

挑取出高分泌組和中等分泌組的B.subtilisWB800重組菌株，接種于2 mL含氯霉素10 μg/mL的LB培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min過(guò)夜培養(yǎng)，將該種子液按2%接種量接種于5 mL含氯霉素10 μg/mL的LB培養(yǎng)基的大試管中，37℃，220 r/min繼續(xù)震蕩培養(yǎng)24 h，離心后去除菌體，取上清液測(cè)定蛋白酶的活性。以同樣培養(yǎng)條件的含pHT43-pro質(zhì)粒的B.subtilisWB800為陽(yáng)性對(duì)照，含pHT43-mpro質(zhì)粒的B.subtilisWB800為陰性對(duì)照（該菌株喪失了胞外分泌蛋白酶的能力），測(cè)定其相對(duì)酶活，即扣除陰性對(duì)照后的酶活。對(duì)比分析含不同信號(hào)肽的重組菌株的蛋白酶的胞外分泌能力，將不同信號(hào)肽引導(dǎo)的蛋白酶胞外酶活與Pro309信號(hào)肽進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表1。每個(gè)菌株做5個(gè)平行試驗(yàn)。

同時(shí)，利用SignalP4.1Server信號(hào)肽分析工具對(duì)這25個(gè)預(yù)測(cè)的信號(hào)肽以及Pro309信號(hào)肽進(jìn)行分析，從肽鏈長(zhǎng)度、D值（D值對(duì)區(qū)分是否為分泌蛋白具有重要作用）、N端正電荷數(shù)（根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)N區(qū)的劃分，統(tǒng)計(jì)N區(qū)氨基酸攜帶的凈正電荷數(shù)）和信號(hào)肽的疏水百分比（疏水氨基酸數(shù)量占信號(hào)肽總氨基酸數(shù)量的百分比）這四個(gè)方面進(jìn)行對(duì)比，按胞外酶活排序，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1結(jié)果顯示初篩的14個(gè)信號(hào)肽，可在枯草芽孢桿菌中有效的表達(dá)分泌芽孢桿菌堿性蛋白酶。高分泌組的胞外蛋白酶活性是野生型的1.4倍以上，其中含有信號(hào)肽sig20（氨基酸序列：MKRLISTLLIGILLTASAPSAFAKPD）的重組菌株的胞外蛋白酶的活性是野生型的1.64倍；中等分泌組的胞外蛋白酶活性是野生型的0.8～1.4倍，這一結(jié)果與水解圈法得到的結(jié)果基本一致。

這26個(gè)信號(hào)肽長(zhǎng)度大多在24～36個(gè)氨基酸，平均長(zhǎng)度為28.3，長(zhǎng)度分布比較隨機(jī)。統(tǒng)計(jì)得出引導(dǎo)效率最高的前11個(gè)信號(hào)肽（野生型信號(hào)肽Pro309以及效率高于野生型的信號(hào)肽）平均D值為0.694，最差的后15個(gè)信號(hào)肽（效率低于野生型信號(hào)肽）平均D值為0.552。推測(cè)D值越高，胞外酶活越高，但這并不是絕對(duì)的，如排名第5的sig34的D值只有0.525，而排名第18的sig15的D值卻達(dá)到0.851。從表中可以發(fā)現(xiàn)，N區(qū)正電荷數(shù)在2～4的時(shí)候，信號(hào)肽傾向于效率較好。有的信號(hào)肽，如sig34和sig21卻并不遵循這個(gè)規(guī)律。信號(hào)肽的疏水比例則與信號(hào)肽是否能成功插入細(xì)胞膜有關(guān)，然而，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)這26個(gè)信號(hào)肽的疏水比例大多在50%～70%隨機(jī)分布。

表1　不同信號(hào)肽與野生型信號(hào)肽引導(dǎo)效率的比值Table 1 Guide efficiency ratio of different signal peptides and wild-type signal peptide

2.4高分泌信號(hào)肽在地衣芽孢桿菌中的表達(dá)

圖2　含不同信號(hào)肽的重組菌株的相對(duì)胞外蛋白酶酶活Fig.2 Relative extracellular protease activity in recombinant strain containing different signal peptides

將含高分泌組信號(hào)肽（sig8、sig12、sig13、sig20、sig27）的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到B.lincheniformisDL6中，篩選出陽(yáng)性克隆，用與B.subtilisWB800同樣的方法培養(yǎng)和測(cè)定上清液中的蛋白酶活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在地衣芽孢桿菌中，與野生型信號(hào)肽Pro309相比，除sig27外（sig27在枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌中的蛋白酶分泌量分別是野生型信號(hào)肽的1.52倍和0.98倍），其余幾個(gè)信號(hào)肽的相對(duì)胞外蛋白酶活性與在B.subtilisWB800中相似，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，這些信號(hào)肽在地衣芽孢桿菌中也可以有效地引導(dǎo)分泌蛋白酶。

3　結(jié)論

本研究應(yīng)用生物信息學(xué)和宏基因組學(xué)相結(jié)合的方法，從土壤宏基因組中篩選出25個(gè)信號(hào)肽并成功在枯草芽孢桿菌中得到了分泌表達(dá)，其中最好的信號(hào)肽sig20對(duì)蛋白酶的分泌表達(dá)是蛋白酶野生型信號(hào)肽的1.64倍。此外，將部分信號(hào)肽應(yīng)用于地衣芽孢桿菌，也得到了較好的效果。結(jié)果表明，從宏基因組中獲得信號(hào)肽來(lái)提高蛋白的分泌水平是一種行之有效的辦法。

通過(guò)分析信號(hào)肽的長(zhǎng)度、D值、N端正電荷數(shù)和信號(hào)肽的疏水百分比，試圖找出信號(hào)肽分泌效率的規(guī)律，預(yù)測(cè)影響信號(hào)肽強(qiáng)弱的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)和位點(diǎn)。然而，這些因素與信號(hào)肽的強(qiáng)弱之間并沒(méi)有明顯的或者絕對(duì)的規(guī)律，并不能覆蓋影響信號(hào)肽功能的所有因素，說(shuō)明宿主對(duì)信號(hào)肽的識(shí)別和蛋白的分泌是非常復(fù)雜的。因此，構(gòu)建高效的信號(hào)肽篩選和評(píng)價(jià)體系對(duì)于獲得高效信號(hào)肽的是十分重要的。本研究篩選到的新的信號(hào)肽，為在芽孢桿菌中高效分泌表達(dá)目標(biāo)蛋白提供了新的信號(hào)肽資源和表達(dá)元件。

［1］FU L L，XU Z R，LI W F，et al.Protein secretion pathways in Bacillus subtilis：implication for optimization of heterologous protein secretion［J］.Biotechnol Adv，2007，25：1-12.

［2］陳向東.枯草芽孢桿菌作為生防制劑在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2013，40（7）：1323-1324.

［3］王光強(qiáng).枯草芽孢桿菌中Sec分泌途徑底物特性及非經(jīng)典分泌途徑的研究［D］.無(wú)錫：江南大學(xué)，2013.

［4］王培立，王平，田健，等.芽孢桿菌高效分泌表達(dá)異源蛋白的研究進(jìn)展［J］.生物技術(shù)進(jìn)展，2015（2）：95-102.

［5］SCHALLMEY M，SINGH A，WARD O.Developments in the use of Bacillus species for industrial production［J］.Can J Microbiol，2004，50：1-17.

［6］CHOO K H，RANGANATHAN S.Flanking signal and mature peptide residues influence signal peptide cleavage［J］.BMC Bioinformatics，2008，9（Suppl 12）：S15.

［7］ISMAIL N F，HAMDAN S，MAHADI N M，et al.A mutant L-asparaginase II signal peptide improves the secretion of recombinant cyclodextrin glucanotransferase and the viability ofEscherichia coli［J］.Biotechnol Lett，2011，33：999-1005.

［8］DEUERLING E，MOGK A，RICHTER C，et al.The ftsH gene ofBacillussubtilisis involved in major cellular processes such as sporulation，stress adaptation and secretion［J］.Mol Microbiol，1997，23（5）：921-933.

［9］JONET M A，MAHADI N M，MURAD A M A，et al.Optimization of a heterologous signal peptide by site-directed mutagenesis for improved secretion of recombinant proteins inEscherichia coli［J］.J Mol Microbiol Biotechnol，2012，22：48-58.

［10］SHENG C，BIN L，RUOYU H，et al.The number of signal peptide cleavage site is critical for extracellular production of recombinant Thermobifidafuscacutinase［J］.Process Biochem，2011，46：1867-1870.［11］TJALSMA H，BOLHUIS A，JONGBLOED J，et al.Signal peptide-dependent protein transport inBacillus subtilis：a genome-based survey of the secretome［J］.Microbiol Mol Biol R，2000，64（3）：515-547.

［12］BROCKMEIER U，CASPERS M，F(xiàn)REUDL R，et al.Systematic screening of all signal peptides fromBacillus subtilis：a powerful strategy in optimizing heterologous protein secretion in gram-positive bacteria［J］. J Mol Cell Biol，2006，362（3）：393-402.

［13］DEGERING C，EGGERT T，PULS M，et al.Optimization of protease secretion inBacillus subtilisandBacillus licheniformisby screening of homologous and heterologous signal peptides［J］.Appl Environ Microbiol，2010，76（19）：6370.

［14］范鑫.外源木聚糖酶在枯草芽孢桿菌中信號(hào)肽篩選［D］.楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2011.

［15］HANDELSMAN J，RONDON M R，BRADY S F，et al.Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products［J］.Chemistry and Biology，1998，5（10）：R245-R249.

［16］張冰，崔岱宗，趙敏.宏基因組學(xué)技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用［J］.黑龍江醫(yī)藥，2014，27（2）：267-271.

［17］王光龍.利用功能宏基因組技術(shù)對(duì)北極、大西洋海底沉積物中的新型蛋白酶、酯酶進(jìn)行篩選、鑒定和性質(zhì)研究［D］.濟(jì)南：山東大學(xué)，2014.

［18］斯日古楞，特木侖，明亮，等.宏基因組學(xué)及其應(yīng)用前景［J］.中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2014，41（3）：115-118.

［19］于雷，于麗，張薇，等.宏基因組技術(shù)及其在酶制劑中的應(yīng)用［J］.食品科學(xué)，2013，34（9）：404-407.

［20］甄杰，胡政，李樹(shù)芳，等.一個(gè)新型耐熱普魯蘭酶的結(jié)構(gòu)與功能［J］.生物工程學(xué)報(bào)，2014，30（1）：119-128.

［21］胡政.堿性蛋白酶菌株的選育及其酶學(xué)性質(zhì)的研究與應(yīng)用［D］.天津：中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，2014.

TANG Guoxin1，2，CHEN Ning1*
（1.College of Biotechnology，Tianjin University of Science and Technology，Tianjin 300457，China；2.Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China）

Signal peptide，efficiently secreting recombinant proteins inBacillussp.was obtained from soil metagenome.After database analysis，the predicted signal peptide DNA fragment was fused with a protease gene，and then expressed inBacillus subtilisWB800 andBacillus licheniformis DL6 to measure the extracellular protease activity.Totally 25 signal peptide sequences which may derived from G+bacteria were screened，extracellular protease activity results showed that there were 14 signal peptides had excellent ability of secreting protease.One of the signal peptides，named sig20，was 1.64 times of its own protease signal peptide，which performed the optimal secretion ability.The high secretion signal peptides were transformed intoB.licheniformisand the results confirmed the similar secretion ability inB.subtilis.By combining bioinformatics and metagenomics methods，effectively Bacillus signal peptipe sequence could be obtained，which provided a rich expression elements for expression and secretion of recombinant proteins.

metagenome；signal peptide；Bacillus；protease

0254-5071（2016）06-0138-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.06.029

2016-01-15

國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’項(xiàng)目（2014AA021303，2014AA021302）；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿科學(xué)研究計(jì)劃（13JCYBJC39500）

唐國(guó)鑫（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)檠挎邨U菌信號(hào)肽的篩選與改造。

陳寧（1963-），男，教授，博士，研究方向?yàn)榘被崤c有機(jī)酸發(fā)酵。