• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    煙草野火病菌Pseudomonas syringae pv. tabaci yuexi-1信號肽預(yù)測及分析

    2016-11-16 08:38:19王鐵霖李晶楊玉文趙廷昌
    中國煙草學(xué)報(bào) 2016年1期
    關(guān)鍵詞:信號肽野火病菌

    王鐵霖,李晶,楊玉文,趙廷昌

    中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193

    煙草野火病菌Pseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1信號肽預(yù)測及分析

    王鐵霖,李晶,楊玉文,趙廷昌

    中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所,植物病蟲害生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100193

    利用SignalP 4.0、 LipoP 1.0 及TMHMM v2.0對煙草野火病菌Pseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1菌株基因組中信號肽的數(shù)量、長度和氨基酸組成進(jìn)行了預(yù)測及分類。結(jié)果確定其中432個(gè)ORFs (Open reading frame) 所編碼的N 端有信號肽序列,占全部ORFs的8.81%。其中351條分泌型信號肽 (SPI),81條脂蛋白型信號肽 (SPII)。在分泌型信號肽中,信號肽的長度為11~42個(gè)氨基酸,以長度為22個(gè)氨基酸的信號肽最多。同源性分析結(jié)果顯示,具有相同信號肽序列的不同蛋白序列之間是高度保守的。該研究提供了野火病原菌致病因子的備選基因,提高該病菌致病因子的篩選效率。

    Pseudomonas syringaepv.tabaci;信號肽;SignalP 4.0;LipoP 1. 0;TMHMM v2.0

    煙草野火病是煙草生產(chǎn)上一種重要的葉部細(xì)菌性病害。該病害在苗期、大田期均可發(fā)生,主要危害煙草葉片,也可危害幼莖、蒴果、萼片等器官,給煙草種植業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。大部分病原菌的毒素、細(xì)胞壁降解酶等致病因子為分泌蛋白。而信號肽在分泌蛋白跨膜、 轉(zhuǎn)運(yùn)及識別植物受體蛋白過程中起著非常重要的作用[3-4]。

    信號肽一般由10~40個(gè)氨基酸殘基組成,通常大致分為3個(gè)區(qū)段:其中N端為堿性氨基末端,通常由帶正電荷的氨基酸組成;中間為疏水中心,主要由20個(gè)或以上的中性氨基酸組成;C端為加工區(qū),含有被信號肽酶裂解的部位,其中小分子氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸較多[5,6]。

    本實(shí)驗(yàn)室對分離自四川越西縣煙草病樣上的一株致病力很強(qiáng)的煙草野火病菌株 yuexi-1進(jìn)行了全基因組測序, 結(jié)果顯示其基因組含有 5701個(gè)開放閱讀框(open reading frame,ORFs)。本研究根據(jù)野火病菌株P(guān)seudomonas syringaepv. tabaciyuexi-1的全基因組測序結(jié)果,利用 3 種在線生物信息學(xué)分析工具 SignalP 4.0、LipoP 1. 0 和 TMHMM v2.0 對該病菌的信號肽進(jìn)行預(yù)測和分析,為該菌株致病因子的篩選提供備選基因。

    1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)材料

    從Genbank上獲得Pseudomonas syringaepv. tabaciyuexi-1菌株基因組序列(序列號JWJF00000000) 的fasta 文件和 gb文件。

    1.2 預(yù)測方法

    (1) 使用 SignalP 4.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 在Gram-negative bacteria選項(xiàng)下預(yù)測 yuexi-1菌株基因組所有ORFs的N端氨基酸序列是否存在信號肽。(2) 使用 LipoP 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/LipoP/) 分析N端氨基酸序列,預(yù)測蛋白質(zhì)類型。(3) 使用TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) 驗(yàn)證預(yù)測結(jié)果。預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)執(zhí)行[19~23]。

    2 結(jié)果與分析

    綜合SignalP 4.0、 LipoP 1. 0和TMHMM Server v.2.0的預(yù)測結(jié)果,對P. syringaepv. tabaciyuexi-1編碼蛋白基因的序列分析結(jié)果如下:

    2.1 信號肽的數(shù)量和長度

    經(jīng)預(yù)測,yuexi-1菌株基因組有432個(gè)ORFs具有信號肽,占全部ORFs的8.81%。信號肽所在的ORFs長度最小為41個(gè)氨基酸,最大為1649個(gè)氨基酸,平均長度為340個(gè)氨基酸,ORFs長度分布在101~200個(gè)氨基酸范圍內(nèi)數(shù)量最多(圖1) 。

    圖1 含信號肽的ORFs長度分布Fig. 1 Length distribution of the ORFs containing signals peptides

    信號肽的長度在11~41個(gè)氨基酸之間,以21~24個(gè)氨基酸居多,其中長度為22個(gè)氨基酸的信號肽最多,共66條,占15.30%(圖2)。

    圖2 信號肽長度(氨基酸)分布Fig. 2 Length (amino acids) distribution of signal peptide

    2.2 氨基酸種類分析

    經(jīng)LipoP 1. 0分析,根據(jù)信號肽氨基酸組成及切割位點(diǎn)信號肽識別序列的不同將信號肽分為4種類型:第一類信號肽酶I型 (SPI) 信號肽最為典型[7-9];第二類為信號肽酶II型 (SPII),通常在脂蛋白中出現(xiàn)[10];第三類為IV型菌毛 (Type IV pilin peptidase);第四類通常與細(xì)菌素和信息素的合成有關(guān),由ABC轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)[11-13]。

    對P. syringaepv. tabaciyuexi-1菌株中的432條信號肽分類結(jié)果表明,共有351條SPI型信號肽和81條SPII型信號肽。

    2.2.1 信號肽酶I型( SPI型)

    SPI型信號肽通常在從分泌蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜途中或轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜后,被切割[14,15]。此類信號肽中存在分泌類信號肽 (Sec-type),其典型結(jié)構(gòu): N-端由2~3個(gè)帶正電荷的氨基酸 (K或R) 組成,也有的由5~11個(gè)帶正電荷的氨基酸組成。N-domain 由平均19個(gè)氨基酸構(gòu)成。C-domain (切割位點(diǎn)前3 位的氨基酸) 的典型結(jié)構(gòu)為A-X-A (A 為丙氨酸, X 指任意一種氨基酸)。

    在預(yù)測得到的351條SPI型信號肽中,200條信號肽具有A-X-A的典型結(jié)構(gòu),長度在11~41個(gè)氨基酸之間。另一類信號肽具有典型的雙精氨酸結(jié)構(gòu),引導(dǎo)分泌蛋白參與雙精氨酸 (Tat) 轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,這一類信號肽具有RR-X-## ( X為任意氨基酸,## 指疏水氨基酸) 的保守序列[16-18]。在P. syringepv.tabaciyuexi-1菌株的基因組中, 有 27 條信號肽具有RR-motif 的保守區(qū)段,其長度在17-42個(gè)氨基酸之間。其中17 條信號肽的C-domain 中出現(xiàn)A-X-A 典型結(jié)構(gòu) (表1)。如表 1 所示, 這些信號肽參與ABC蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)途徑等多種不同分泌途徑和相關(guān)酶合成代謝途徑。

    表1 具有典型A-X-A結(jié)構(gòu)的RR-motif型信號肽Tab. 1 RR-motif signal peptides with the typical structure of A-X-A

    2.2.2 脂蛋白型信號肽

    SPII型信號肽也稱為脂蛋白信號肽,其典型結(jié)構(gòu)C-domain為: L-(A /S) -(A /G),在切割位點(diǎn)后+ 1位氨基酸為半胱氨酸(C),這樣就形成了保守的L-(A /S)-(A /G)-C的Li-pobox典型結(jié)構(gòu),該結(jié)構(gòu)使脂蛋白被切割后依然能夠錨定在質(zhì)膜上。該類信號肽通常比分泌型信號肽短。

    在P. syringaepv.tabacistrain yuexi-1中,共有81個(gè)脂蛋白型信號肽,其長度在14~36個(gè)氨基酸之間。其中有 37 (1.32%) 條信號肽具有Li-pobox典型結(jié)構(gòu)(表2)。

    表2 煙草野火病菌yuexi-1菌株基因組脂蛋白類型信號肽Tab. 2 Lipoprotein signal peptide in P. syringaepv.tabaci strain yuexi-1

    續(xù)表2

    續(xù)表2

    在P.pv. tabaciyuexi-1菌株的基因組中,存在不同的分泌蛋白具有相同信號肽序列的現(xiàn)象。據(jù)統(tǒng)計(jì),共30條SPI型信號肽和2條SPII型信號肽(表3)存在這種情況,而這些分泌蛋白具有類似的功能描述并參與相同生物過程。我們對含有相同信號肽序列的氨基酸序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn),其中8 組分泌蛋白,ORF 的編號分別為:peg.886 與peg.2670,peg.3721 與peg.3724, peg.3810、peg.4062與peg.4068, peg.3812、peg.4064 與 peg.4070, peg.4111 與 peg.4113,peg.170 與peg.4165, peg.2692 與 peg.2779, peg.2796 與 peg.2803,核酸序列比對的一致性在 99%~100%,可能為多拷貝基因。其它含有相同信號肽的蛋白序列的長度和同源性的差異很大,但有功能相近,這些分泌蛋白序列呈現(xiàn)很高的同源性并高度保守,因此判斷這一類基因?yàn)槠叫羞M(jìn)化的同源基因。

    表3 相同序列信號肽Tab. 3 Signal peptides with the same sequences

    3 討論

    本研究運(yùn)用 3 種生物信息學(xué)分析軟件對P.syringaepv. tabaci yuexi-1 菌株的全基因組序列進(jìn)行分析。P. syringaepv. tabaciyuexi-1 菌株中共有432條信號肽,其中351條SPI型信號肽和81條SPII型信號肽。通過比較分析,SPII 型信號肽與 SPI 型信號肽存在以下不同:首先,脂蛋白的信號肽,其 C 端包含 Lipobox 共識序列L-(A /S)-(A/G)-C,其結(jié)構(gòu)比分泌信號肽更保守(表 2),說明在脂蛋白的修飾過程中,多肽變化極少。另外,SPI型信號肽平均長度為26 個(gè)氨基酸,SPII 型信號肽的平均長度為 20 個(gè)氨基酸左右,較 SPI 型信號肽短。

    煙草野火病菌 yuexi-1 有較強(qiáng)的致病力,其基因組測序的完成, 使得從全基因組水平分析和研究該菌株的信號肽和分泌蛋白成為可能。本研究中,結(jié)合多種生物信息學(xué)軟件,優(yōu)化預(yù)測方法,對基因組中具有信號肽的分泌蛋白進(jìn)行了預(yù)測分析,使預(yù)測結(jié)果更準(zhǔn)確,為該菌株基因組特征的描述及該病菌致病機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。前期報(bào)道,細(xì)菌的大多數(shù)分泌蛋白中其致病性關(guān)系密切。其中, 參與 Tat 分泌途徑的RR-motif信號肽與植物病原細(xì)菌的致病性關(guān)系尤為密切。Rodríguez等利用生物信息學(xué)軟件對Dickeya dadantii3937的全基因組序列進(jìn)行信號肽預(yù)測分析,并篩選假定 Tat 底物進(jìn)行突變體,結(jié)果發(fā)現(xiàn),TatC 突變體的致病力降低[24]。梨火疫病菌 (Erwinia amylovora) Tat途徑中的分泌蛋白參與病菌的生長速度、 致病力生理特性[25]。本研究中,在 yuexi-1信號肽預(yù)測結(jié)果中, 得到 26 條與Tat 系統(tǒng)相關(guān)的信號肽。同時(shí),在分析分泌蛋白功能時(shí)發(fā)現(xiàn),預(yù)測得到的信號肽中存在參與 III 型分泌系統(tǒng)等與致病力關(guān)系密切的分泌系統(tǒng),以上所得到的這些信號肽所對應(yīng)的基因是否也與其致病力等密切相關(guān)也需要進(jìn)一步證實(shí)。

    盡管本研究利用結(jié)合多種軟件,提高預(yù)測的準(zhǔn)確性,但預(yù)測結(jié)果與實(shí)際分泌到菌體外的蛋白在數(shù)量和種類上有一定的差距,在預(yù)測信號肽蛋白中,哪些是真正的分泌蛋白、分泌狀態(tài)及其功能需進(jìn)一步驗(yàn)證。后期研究工作中,結(jié)合預(yù)測結(jié)果對感興趣的分泌蛋白進(jìn)行功能驗(yàn)證,提高驗(yàn)證分泌蛋白功能效率。

    [1] Gasson M J. Indicator technique for antimetabolic toxin production by phytopathogenic species ofPseudomonas[J].Applied and environmental microbiology, 1980, 39(1): 25-29.

    [2] Thomas M D, Uchytil TF, Durbin RD. et al. Inhibition of glutamine synthetase from pea by tabtoxinine-beta-lactam[J]. Plant physiology, 1983, 71(4): 912-5.

    [3] Emanuelsson O, von Heijne G. Prediction of organellar targeting signals [J]. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Cell Research, 2001, 1541(1): 114-119.

    [4] Baldi P, Brunak S, Chauvin Y, et al. Assessing the accuracy of prediction algorithms for classi fi cation: an overview [J].Bioinformatics, 2000, 16(5): 412-424.

    [5] Heijne G. Patterns of amino acids near signal‐sequence cleavage sites [J]. European journal of biochemistry, 1983,133(1): 17-21.

    [6] Von Heijne G. Signal sequences: the limits of variation [J].Journal of molecular biology, 1985, 184(1): 99-105.

    [7] 王鐵霖,嚴(yán)婉榮,閆莎莎,等. 瓜類果斑病菌 (Acidovorax citrulli) 基因組信號肽預(yù)測分析[J]. 中國瓜菜, 2012,25(1): 1-6.

    [8] Tjalsma H, van den Dolder J, Meijer WJ, et al. The Plasmid-Encoded Signal Peptidase SipP Can Functionally Replace the Major Signal Peptidases SipS and SipT of Bacillus subtilis [J]. Journal of bacteriology, 1999, 181(8):2448-2454 .

    [9] Tjalsma H, Zanen G, Venema G, et al. The potential active site of the lipoprotein-speci fi c (type II) signal peptidase of Bacillus subtilis [J]. Journal of Biological Chemistry, 1999,274(40): 28191-28197.

    [10] Prágai Z, Tjalsma H, Bolhuis A, et al. The signal peptidase II (Isp) gene of Bacillus subtilis [J]. Microbiology, 1997,143(4): 1327-1333.

    [11] Banerjee S, Hansen JN. Structure and expression of a gene encoding the precursor of subtilin, a small protein antibiotic[J]. Journal of Biological Chemistry, 1988, 263(19): 9508-9514.

    [12] Paik S H, Chakicherla A, Hansen J N. Identification and characterization of the structural and transporter genes for,and the chemical and biological properties of, sublancin 168, a novel lantibiotic produced by Bacillus subtilis 168[J]. Journal of Biological Chemistry, 1998, 273(36): 23134-23142.

    [13] Weiner J H, Bilous P T, Shaw G M, et al. A novel and ubiquitous system for membrane targeting and secretion of cofactor-containing proteins [J]. Cell, 1998, 93(1): 93-101.

    [14] Dalbey R E, von Heijne G. Signal peptidases in prokaryotes and eukaryotes-a new protease family [J]. Trends in biochemical sciences, 1992, 17(11): 474-478.

    [15] Dalbey R E, Lively M O, Bron S, et al. The chemistry and enzymology of the type I signal peptidases [J]. Protein Science, 1997, 6(6): 1129-1138.

    [16] Berks B C, Sargent F, Palmer T. The Tat protein export pathway [J]. Molecular microbiology, 2000, 35(2): 260-274.

    [17] Berks B C. A common export pathway for proteins binding complex redox cofactors?[J]. Molecular microbiology,1996, 22(3): 393-404.

    [18] Cristóbal S, de Gier J W, Nielsen H, et al. Competition between Sec‐and TAT - dependent protein translocation inEscherichia coli[J]. The EMBO journal, 1999, 18(11):2982-2990.

    [19] Petersen T N, Brunak S, von Heijne G, et al. SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions[J]. Nature methods, 2011, 8(10): 785-786.

    [20] Dyrl?v Bendtsen J, Nielsen H, von Heijne G, et al.Improved prediction of signal peptides: SignalP 3.0[J].Journal of molecular biology, 2004, 340(4): 783-795.

    [21] Juncker A S, Willenbrock H, Von Heijne G, et al. Prediction of lipoprotein signal peptides in Gram‐negative bacteria[J]. Protein Science, 2003, 12(8): 1652-1662.

    [22] Paetzel M, Dalbey R E, Strynadka NCJ. Crystal structure of a bacterial signal peptidase in complex with a β-lactam inhibitor [J]. Nature, 1998, 396(6707): 186-190.

    [23] K?ll L, Krogh A, Sonnhammer ELL. Advantages of combined transmembrane topology and signal peptide prediction-the Phobius web server [J]. Nucleic acids research, 2007, 35(suppl 2): W429-W432.

    [24] Rodríguez-Sanz M, Antúnez-Lamas M, Rojas C, et al.The Tat pathway of plant pathogen Dickeya dadantii 3937 contributes to virulence and fi tness [J]. Fems Microbiology Letters,2010,302(2):151-158.

    [25] 于洋洋, 劉倩倩, 徐恩麗, 胡白石. 梨火疫病菌(Erwinia amylovora)雙精氨酸運(yùn)輸系統(tǒng)基因(tatC)的功能分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2011,19 (6): 1081-1088.

    Analysis of coding region for proteins containing signal peptides ofPseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1 strain

    WANG Tielin, LI Jing, YANG Yuwen, ZHAO Tingchang
    State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193

    This paper predicted and analyzed the number, length and amino acid components in the genome ofPseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1, a strain of tobacco fi re blight pathogen, by using SignalP 4.0, LipoP 1.0 and TMHMM v2.0. Results showed that 432 ORFs(8.81% of all the ORFs) contained N- terminal signal peptides, of which 351 signal peptides were SPI type and 81 signal peptides were SPII type. Among the SPI peptides, length was between 11 to 42 amino acids and the majority was 22 amino acids in length. In addition,the proteins that share the same signal peptide sequences were highly conserved in the homologue analysis. This study provided candidate genes for virulence factors of the tobacco fi re blight pathogen, and promoted the efficiency for screening the virulence factors.

    Pseudomonas syringaepv.tabaci; signal peptide; SignalP 4.0; LipoP 1. 0; TMHMM v2.0

    王鐵霖,李晶,楊玉文,等. 煙草野火病菌Pseudomonas syringaepv. tabaciyuexi-1信號肽預(yù)測及分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào),2016,22(1)

    煙草病蟲害檢測與綜合治理重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室開放課題經(jīng)費(fèi)(項(xiàng)目號:bc2011 );中國煙草總公司科技重點(diǎn)項(xiàng)目 (項(xiàng)目號 110201202002 )

    王鐵霖,博士,Email:wtl82@163.com

    趙廷昌,研究員,Email:zhaotgcg@163.com

    2015-04-23

    :WANG Tielin, LI Jing, YANG Yuwen, et al. Analysis of coding region for proteins containing signal peptides ofPseudomonas syringaepv.tabaciyuexi-1 strain [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)

    猜你喜歡
    信號肽野火病菌
    野火:道是無情卻有情
    嵌合信號肽提高α-淀粉酶在枯草芽孢桿菌中的分泌
    基于多特征融合的早期野火煙霧檢測
    小病菌影響鴉片戰(zhàn)爭
    特別健康(2018年3期)2018-07-04 00:40:24
    運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件預(yù)測木質(zhì)部寄生屬信號肽
    頭狀莖點(diǎn)霉病菌的新寄主高粱及病菌的檢疫鑒定(內(nèi)文第98~101頁)圖版
    油茶炭疽病菌拮抗木霉菌的分離與篩選
    病菌來了 快穿好防菌衣
    內(nèi)源信號肽DSE4介導(dǎo)頭孢菌素C酰化酶在畢赤酵母中的分泌表達(dá)
    禽類MHCⅡ類分子β鏈信號肽保守性分析
    亚洲精品久久午夜乱码| 国产老妇伦熟女老妇高清| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产成人一区二区在线| 久久精品成人免费网站| av网站在线播放免费| 丰满少妇做爰视频| 波多野结衣av一区二区av| 女人久久www免费人成看片| 超色免费av| 亚洲国产中文字幕在线视频| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲专区中文字幕在线| 女性生殖器流出的白浆| 午夜av观看不卡| av一本久久久久| 五月天丁香电影| 国产亚洲精品第一综合不卡| 女性生殖器流出的白浆| 亚洲伊人久久精品综合| 热re99久久国产66热| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 久久久久精品人妻al黑| 99精品久久久久人妻精品| 黄片播放在线免费| 蜜桃国产av成人99| 久久亚洲国产成人精品v| 男的添女的下面高潮视频| 国产成人欧美在线观看 | 国产精品久久久人人做人人爽| 性色av乱码一区二区三区2| 国产成人一区二区三区免费视频网站 | 看免费av毛片| 18禁观看日本| 波野结衣二区三区在线| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 脱女人内裤的视频| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲精品美女久久av网站| 制服诱惑二区| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲中文字幕日韩| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 日韩大码丰满熟妇| 欧美久久黑人一区二区| 999精品在线视频| 一本一本久久a久久精品综合妖精| 久久免费观看电影| 久久影院123| 又紧又爽又黄一区二区| 99九九在线精品视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 亚洲av美国av| 欧美日韩福利视频一区二区| 欧美日韩国产mv在线观看视频| 18禁观看日本| 国产伦人伦偷精品视频| 爱豆传媒免费全集在线观看| 美女国产高潮福利片在线看| 另类亚洲欧美激情| 免费人妻精品一区二区三区视频| 看免费av毛片| 91成人精品电影| 国产高清不卡午夜福利| 成年女人毛片免费观看观看9 | 亚洲,欧美精品.| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 丰满饥渴人妻一区二区三| 精品一品国产午夜福利视频| 国产精品 国内视频| 久久久精品94久久精品| 少妇 在线观看| 午夜免费男女啪啪视频观看| 午夜av观看不卡| 亚洲色图综合在线观看| 免费在线观看影片大全网站 | 一级毛片电影观看| 婷婷成人精品国产| 美女高潮到喷水免费观看| 亚洲人成电影免费在线| 在线观看免费高清a一片| 91字幕亚洲| 国产免费现黄频在线看| 婷婷丁香在线五月| 亚洲精品第二区| 久久av网站| 日本av免费视频播放| 久久精品久久精品一区二区三区| 男女午夜视频在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 国产精品 欧美亚洲| 国产视频一区二区在线看| 国产不卡av网站在线观看| 十八禁人妻一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 在线观看www视频免费| 深夜精品福利| 麻豆国产av国片精品| 亚洲 欧美一区二区三区| 中文字幕亚洲精品专区| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 大码成人一级视频| 下体分泌物呈黄色| www.999成人在线观看| 波多野结衣一区麻豆| 亚洲色图综合在线观看| 国产在线一区二区三区精| 香蕉丝袜av| 亚洲综合色网址| 亚洲av成人不卡在线观看播放网 | 操美女的视频在线观看| 美国免费a级毛片| 精品一区二区三卡| 中文欧美无线码| 久久青草综合色| 欧美+亚洲+日韩+国产| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 久久这里只有精品19| 欧美乱码精品一区二区三区| 免费看不卡的av| 青草久久国产| 99久久99久久久精品蜜桃| 亚洲伊人色综图| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 国产男人的电影天堂91| 婷婷成人精品国产| 国产成人精品久久久久久| 日韩av免费高清视频| 国产亚洲av高清不卡| 午夜福利,免费看| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 精品亚洲成a人片在线观看| 免费观看av网站的网址| 搡老乐熟女国产| 欧美亚洲日本最大视频资源| 国产亚洲精品久久久久5区| 欧美日韩亚洲国产一区二区在线观看 | 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美日韩一级在线毛片| 老司机深夜福利视频在线观看 | 免费人妻精品一区二区三区视频| 一级毛片我不卡| 精品一区二区三卡| 精品熟女少妇八av免费久了| a 毛片基地| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| av不卡在线播放| 国产主播在线观看一区二区 | 精品亚洲乱码少妇综合久久| 色精品久久人妻99蜜桃| 天堂8中文在线网| 亚洲 国产 在线| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 婷婷丁香在线五月| 亚洲国产成人一精品久久久| 香蕉丝袜av| 国产片内射在线| 婷婷成人精品国产| 精品福利永久在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 亚洲精品在线美女| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 国产成人系列免费观看| 成年人黄色毛片网站| 精品少妇内射三级| 久久久欧美国产精品| 99热国产这里只有精品6| 99国产精品一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品一区二区三区四区五区乱码 | videosex国产| 欧美精品av麻豆av| 国产亚洲精品第一综合不卡| 男人操女人黄网站| 国产精品一区二区精品视频观看| 老汉色av国产亚洲站长工具| 美女扒开内裤让男人捅视频| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 十八禁人妻一区二区| 亚洲成人手机| 亚洲成人国产一区在线观看 | 精品视频人人做人人爽| 人人妻人人澡人人看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 捣出白浆h1v1| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 在线观看www视频免费| 大陆偷拍与自拍| 国产精品免费大片| 欧美日韩黄片免| 中文字幕人妻丝袜制服| 久久精品久久精品一区二区三区| 欧美变态另类bdsm刘玥| 少妇的丰满在线观看| 一边摸一边做爽爽视频免费| 免费观看av网站的网址| 国产免费视频播放在线视频| 欧美激情 高清一区二区三区| 午夜老司机福利片| 777久久人妻少妇嫩草av网站| 国产三级黄色录像| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 韩国高清视频一区二区三区| 精品福利永久在线观看| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产午夜精品一二区理论片| xxx大片免费视频| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久女婷五月综合色啪小说| 久久久久久久久免费视频了| 久热这里只有精品99| 精品熟女少妇八av免费久了| 日韩中文字幕欧美一区二区 | 亚洲专区国产一区二区| 国产精品.久久久| 啦啦啦在线观看免费高清www| 亚洲中文字幕日韩| 久久精品国产亚洲av高清一级| 日本av手机在线免费观看| 亚洲欧美色中文字幕在线| 后天国语完整版免费观看| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲 | 90打野战视频偷拍视频| 高潮久久久久久久久久久不卡| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲美女黄色视频免费看| 最近手机中文字幕大全| 深夜精品福利| av一本久久久久| 精品亚洲成a人片在线观看| 91国产中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 亚洲精品一二三| 亚洲av男天堂| 午夜视频精品福利| 一区二区三区精品91| 午夜福利影视在线免费观看| 岛国毛片在线播放| 国产精品免费大片| 天天影视国产精品| 免费在线观看黄色视频的| 一级a爱视频在线免费观看| 90打野战视频偷拍视频| 看免费av毛片| 国产成人一区二区在线| 国产视频首页在线观看| h视频一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 亚洲精品成人av观看孕妇| 免费观看a级毛片全部| 99九九在线精品视频| 久久人人爽人人片av| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 黄色a级毛片大全视频| 日韩电影二区| 国产精品人妻久久久影院| 悠悠久久av| 交换朋友夫妻互换小说| av不卡在线播放| 成人免费观看视频高清| 我的亚洲天堂| 久久亚洲国产成人精品v| 91麻豆av在线| 少妇精品久久久久久久| 婷婷色综合大香蕉| 一区二区三区激情视频| a级毛片在线看网站| 一本综合久久免费| 视频区欧美日本亚洲| 国产一区二区 视频在线| 欧美av亚洲av综合av国产av| 免费不卡黄色视频| 午夜精品国产一区二区电影| 国产一区二区三区av在线| 女性被躁到高潮视频| av有码第一页| 精品少妇久久久久久888优播| 精品视频人人做人人爽| 国产男人的电影天堂91| 韩国精品一区二区三区| 亚洲一卡2卡3卡4卡5卡精品中文| 亚洲熟女毛片儿| cao死你这个sao货| 国产精品久久久久成人av| videosex国产| 91精品伊人久久大香线蕉| 午夜福利,免费看| 午夜久久久在线观看| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 天天躁夜夜躁狠狠躁躁| 在线观看免费午夜福利视频| 女人被躁到高潮嗷嗷叫费观| 日本av免费视频播放| 久久久久国产精品人妻一区二区| 国产成人精品久久二区二区91| av国产久精品久网站免费入址| 亚洲成av片中文字幕在线观看| 欧美少妇被猛烈插入视频| 搡老岳熟女国产| 午夜老司机福利片| 韩国精品一区二区三区| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 自线自在国产av| 成人手机av| 一级黄色大片毛片| 国产精品 国内视频| av不卡在线播放| 欧美日韩综合久久久久久| 免费在线观看日本一区| 日本黄色日本黄色录像| 天堂8中文在线网| 国产欧美日韩一区二区三 | 搡老乐熟女国产| 精品一区二区三卡| 熟女少妇亚洲综合色aaa.| 天天躁狠狠躁夜夜躁狠狠躁| 可以免费在线观看a视频的电影网站| 人人妻,人人澡人人爽秒播 | 午夜视频精品福利| 欧美日韩一级在线毛片| 999久久久国产精品视频| 后天国语完整版免费观看| 99热全是精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 欧美成人午夜精品| 又大又爽又粗| 一区二区三区激情视频| 亚洲美女黄色视频免费看| 日韩一区二区三区影片| 最新的欧美精品一区二区| 在现免费观看毛片| 久久精品国产亚洲av高清一级| 精品高清国产在线一区| 老司机影院毛片| 亚洲精品av麻豆狂野| 老汉色av国产亚洲站长工具| 亚洲精品av麻豆狂野| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 国产片内射在线| 久热这里只有精品99| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 亚洲伊人久久精品综合| 日本91视频免费播放| 精品国产一区二区久久| www.自偷自拍.com| 99热网站在线观看| 国产野战对白在线观看| 日韩大片免费观看网站| 日本欧美视频一区| 久久久久视频综合| 男女无遮挡免费网站观看| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 日本91视频免费播放| 免费在线观看黄色视频的| 性色av一级| 国产成人影院久久av| 国产精品一区二区精品视频观看| 婷婷色麻豆天堂久久| 九色亚洲精品在线播放| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 色婷婷久久久亚洲欧美| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜91福利影院| 国产三级黄色录像| 国产99久久九九免费精品| 国产在线视频一区二区| 丁香六月欧美| 国产av精品麻豆| 亚洲av片天天在线观看| 人体艺术视频欧美日本| 又黄又粗又硬又大视频| 黄频高清免费视频| www日本在线高清视频| 久久中文字幕一级| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 亚洲一码二码三码区别大吗| 黄色视频在线播放观看不卡| 丝袜人妻中文字幕| 日韩一区二区三区影片| 一区在线观看完整版| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 成人手机av| 老汉色∧v一级毛片| 欧美精品一区二区免费开放| 黄色 视频免费看| 精品熟女少妇八av免费久了| 日本五十路高清| 在线av久久热| 美女午夜性视频免费| 爱豆传媒免费全集在线观看| 欧美黑人精品巨大| 亚洲情色 制服丝袜| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 啦啦啦在线免费观看视频4| 国产一区二区三区综合在线观看| 国产1区2区3区精品| 波野结衣二区三区在线| 国产精品熟女久久久久浪| 99国产精品一区二区蜜桃av | 观看av在线不卡| 欧美日韩亚洲高清精品| 色婷婷av一区二区三区视频| 美女午夜性视频免费| www.精华液| 亚洲视频免费观看视频| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产免费现黄频在线看| 99国产精品一区二区三区| 99国产精品一区二区蜜桃av | 又大又黄又爽视频免费| 老熟女久久久| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 午夜影院在线不卡| 男女国产视频网站| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 伊人久久大香线蕉亚洲五| 国产男人的电影天堂91| 免费看不卡的av| 久久综合国产亚洲精品| 性高湖久久久久久久久免费观看| 看免费av毛片| 国产av精品麻豆| 老司机亚洲免费影院| 欧美在线一区亚洲| 国产亚洲一区二区精品| 少妇人妻 视频| 午夜福利视频在线观看免费| 久久久国产一区二区| 久久亚洲精品不卡| 精品第一国产精品| 岛国毛片在线播放| 欧美人与性动交α欧美软件| 麻豆av在线久日| 免费看av在线观看网站| 久久这里只有精品19| 欧美精品高潮呻吟av久久| www.精华液| 免费在线观看完整版高清| 国精品久久久久久国模美| 天天添夜夜摸| 国产老妇伦熟女老妇高清| 免费看十八禁软件| 丝袜在线中文字幕| 成人国产av品久久久| 亚洲欧美清纯卡通| 人成视频在线观看免费观看| 久久久久久免费高清国产稀缺| 女警被强在线播放| 无遮挡黄片免费观看| 亚洲国产中文字幕在线视频| 91精品三级在线观看| 丝袜美足系列| 亚洲av欧美aⅴ国产| 丰满饥渴人妻一区二区三| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频 | 亚洲精品一二三| 黑人欧美特级aaaaaa片| 精品久久久久久久毛片微露脸 | 亚洲三区欧美一区| 99精品久久久久人妻精品| videos熟女内射| 国产男人的电影天堂91| 欧美黄色片欧美黄色片| 午夜福利视频精品| 欧美在线一区亚洲| 美女视频免费永久观看网站| 色婷婷av一区二区三区视频| 人妻 亚洲 视频| 久久久久久久精品精品| 色网站视频免费| 国产精品久久久久久精品电影小说| 大香蕉久久成人网| av天堂在线播放| 国产男女内射视频| 日本黄色日本黄色录像| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 婷婷色av中文字幕| 最新在线观看一区二区三区 | 色婷婷av一区二区三区视频| 一区二区日韩欧美中文字幕| 日日夜夜操网爽| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 欧美精品亚洲一区二区| 男人操女人黄网站| 国产野战对白在线观看| 亚洲综合色网址| 亚洲男人天堂网一区| 午夜91福利影院| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚洲欧洲国产日韩| 亚洲国产看品久久| 久久精品久久精品一区二区三区| 性色av乱码一区二区三区2| 欧美成人午夜精品| 性少妇av在线| 亚洲视频免费观看视频| 色播在线永久视频| 日韩av在线免费看完整版不卡| 欧美亚洲日本最大视频资源| 亚洲精品乱久久久久久| 久久av网站| 咕卡用的链子| 国产精品国产三级专区第一集| 嫩草影视91久久| www.精华液| 久久久久精品人妻al黑| 欧美性长视频在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 七月丁香在线播放| 亚洲第一青青草原| 国产在视频线精品| 久久精品亚洲av国产电影网| 久久久国产欧美日韩av| 国产精品一区二区免费欧美 | 中文字幕色久视频| 欧美人与善性xxx| 亚洲国产最新在线播放| 亚洲人成电影观看| 丁香六月天网| 大片电影免费在线观看免费| 成年人免费黄色播放视频| 欧美精品啪啪一区二区三区 | 可以免费在线观看a视频的电影网站| 久久亚洲国产成人精品v| 精品国产国语对白av| 亚洲一区二区三区欧美精品| 亚洲国产精品国产精品| 黑人猛操日本美女一级片| 看十八女毛片水多多多| 丝袜脚勾引网站| 99热国产这里只有精品6| avwww免费| 看免费av毛片| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲精品国产区一区二| xxx大片免费视频| 捣出白浆h1v1| 手机成人av网站| bbb黄色大片| 在线观看免费视频网站a站| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 亚洲七黄色美女视频| 飞空精品影院首页| 亚洲国产中文字幕在线视频| videosex国产| 国产亚洲av高清不卡| 亚洲免费av在线视频| 亚洲男人天堂网一区| 日本av手机在线免费观看| 国产精品国产av在线观看| 亚洲成人手机| 嫁个100分男人电影在线观看 | 国产极品粉嫩免费观看在线| h视频一区二区三区| 午夜日韩欧美国产| 亚洲一区二区三区欧美精品| 国产亚洲av片在线观看秒播厂| 人人澡人人妻人| 满18在线观看网站| 91字幕亚洲| 中文字幕最新亚洲高清| 免费观看av网站的网址| 少妇粗大呻吟视频| 欧美国产精品一级二级三级| 99精国产麻豆久久婷婷| 亚洲精品国产区一区二| 国产精品免费大片| 国产高清不卡午夜福利| 免费看av在线观看网站| 免费久久久久久久精品成人欧美视频| 90打野战视频偷拍视频| 天堂俺去俺来也www色官网| av又黄又爽大尺度在线免费看| www.av在线官网国产| 久久国产精品影院| 亚洲精品乱久久久久久| www.av在线官网国产| 少妇 在线观看| 免费不卡黄色视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 黄色视频在线播放观看不卡| 免费不卡黄色视频| 精品少妇黑人巨大在线播放| 97人妻天天添夜夜摸| 性少妇av在线| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀 | 69精品国产乱码久久久| 国产日韩欧美在线精品| 在线观看免费高清a一片| 超色免费av| 亚洲国产看品久久| 99久久99久久久精品蜜桃| 制服诱惑二区| 国产av一区二区精品久久| 亚洲精品国产av成人精品| 99精品久久久久人妻精品| 久久久欧美国产精品| 99国产精品一区二区三区| 国产成人av教育| 人妻一区二区av| a 毛片基地| 七月丁香在线播放| 国产欧美亚洲国产| 一边摸一边做爽爽视频免费| 成人三级做爰电影| 成人亚洲欧美一区二区av| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产精品 欧美亚洲|