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    吸煙對青年吸煙者血漿微小RNA表達(dá)譜影響的研究

    2016-11-16 08:38:21施冰張?zhí)礻?/span>劉興余張杰周駿王彥亭
    中國煙草學(xué)報 2016年1期
    關(guān)鍵詞:血漿差異分析

    施冰,張?zhí)礻枺瑒⑴d余,張杰,周駿,王彥亭

    1 北京軍區(qū)總醫(yī)院,心內(nèi)科,北京市東城區(qū)南門倉5號,100700;2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠,技術(shù)中心,北京市通州區(qū)萬盛南路99號,100141;3 國家煙草專賣局,北京西城區(qū)月壇南路55號,100045

    吸煙與健康

    吸煙對青年吸煙者血漿微小RNA表達(dá)譜影響的研究

    施冰1,張?zhí)礻?,劉興余2,張杰2,周駿2,王彥亭3

    1 北京軍區(qū)總醫(yī)院,心內(nèi)科,北京市東城區(qū)南門倉5號,100700;2 上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠,技術(shù)中心,北京市通州區(qū)萬盛南路99號,100141;3 國家煙草專賣局,北京西城區(qū)月壇南路55號,100045

    目的: microRNA(miRNA)是一類新的用于診斷疾病的生物標(biāo)志物。目前關(guān)于吸煙與血漿miRNA表達(dá)譜的研究相對較少。本研究通過血漿miRNA表達(dá)譜芯片檢測,篩選與吸煙相關(guān)的特異性miRNA,為吸煙與健康研究提供一個新的方法。方法:應(yīng)用人miRNA表達(dá)譜芯片檢測了28位青年吸煙者和12位非吸煙者血漿miRNA表達(dá)譜,篩選了差異表達(dá)的miRNA。應(yīng)用生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了功能富集分析。結(jié)果:與非吸煙者比較,吸煙者血漿中35個miRNA發(fā)生了差異表達(dá)。其中24個miRNA表達(dá)上調(diào),11個miRNA表達(dá)下調(diào)。功能富集分析提示差異表達(dá)的miRNA與免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等生物學(xué)功能以及白血病等疾病密切相關(guān)。結(jié)論:吸煙可導(dǎo)致血漿miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化。差異表達(dá)的miRNA可能成為吸煙與健康研究的新靶點(diǎn)。

    吸煙;血漿;微小RNA; 表達(dá)譜;生物標(biāo)志物

    隨著人們對吸煙與健康關(guān)系的日趨關(guān)注,對吸煙影響健康進(jìn)而導(dǎo)致疾病患病風(fēng)險增加的研究已從傳統(tǒng)流行病學(xué)的宏觀統(tǒng)計分析走向與分子流行病學(xué)緊密結(jié)合的系統(tǒng)性研究。隨著代謝組學(xué)、化學(xué)信息學(xué)、生物信息學(xué)、基因組學(xué)的不斷發(fā)展與融合,通過分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)研究吸煙與人類基因表達(dá)譜變化進(jìn)而進(jìn)一步探索吸煙與疾病之間的關(guān)系研究,可能為深入了解吸煙與健康的關(guān)系提供一個新的重要研究方向。

    microRNA(miRNA)是一類長約18-25個核苷酸的單鏈非編碼小分子RNA,主要通過與靶基因mRNA的3’端非編碼區(qū)(3’UTR)不完全堿基互補(bǔ)配對方式結(jié)合,抑制靶mRNA翻譯成蛋白質(zhì),在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的降解或抑制其翻譯,從而發(fā)揮調(diào)控靶基因表達(dá)的作用[1]。目前認(rèn)為,至少約20%-30%的人類基因受到miRNA的調(diào)控。越來越多的研究表明,miRNA不僅廣泛參與了細(xì)胞增殖、分化、凋亡、上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型、組織器官形成和生長等多種生物學(xué)功能,也與疾病的發(fā)生、發(fā)展,特別是腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移等病理過程密切相關(guān)[2]。miRNA的表達(dá)具有組織特異性和時空特異性,在血清(血漿)中穩(wěn)定表達(dá)[3]。由于循環(huán)miRNA具有良好的微侵襲性、高度組織特異性、穩(wěn)定性、無后加工修飾等特點(diǎn),血清(血漿)miRNA作為新型的生物標(biāo)志物已廣泛應(yīng)用于臨床診斷和疾病預(yù)后評估等方面[4]。但是有關(guān)吸煙與血清(血漿)miRNA表達(dá)譜的研究相對較少。

    本研究應(yīng)用人microarray芯片檢測了吸煙人群外周血miRNA表達(dá)譜,篩選了差異表達(dá)的miRNA,應(yīng)用生物信息學(xué)方法分析了差異表達(dá)的miRNA的富集功能。擬為在基因水平建立一種新的評價吸煙與健康關(guān)系的方法提供實驗數(shù)據(jù)。

    1 資料與方法

    1.1 研究對象

    由于中國的吸煙人群多為男性,故選擇60名吸煙男性入選本研究。 吸煙者年齡21-30歲,平均年齡22.3±3.4歲。入選標(biāo)準(zhǔn):(1)18歲以上的吸煙男性;(2)吸煙指數(shù)大于30(吸煙指數(shù)=平均第天吸煙支數(shù)x吸煙年數(shù))[5];(3)簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)目前正在使用其他含有煙草的產(chǎn)品;(2)有濫用藥物史或酗酒史;(3)確認(rèn)為高血壓、冠心病、糖尿病、腦血管疾病、肺心病、瓣膜病和其他器質(zhì)性心臟疾病,有嚴(yán)重的肝腎功能疾病,確診為呼吸系統(tǒng)疾病或血液系統(tǒng)疾病等。此外,40名年齡匹配的非吸煙健康男性(年齡21-30歲,平均年齡23.1±4.7歲)作為對照組參與本研究。所有研究對象均來自同一單位,生活和工作條件相同。所有實驗對象均獲得本人知情同意并簽署知情同意書,課題研究通過醫(yī)學(xué)倫理審批同意。

    1.2 血液樣本采集

    標(biāo)本采集時間和方法:60名吸煙者隨機(jī)分為3組,第組20人。在完成體格檢查后所有吸煙人員首先吸食某一品牌的混合型卷煙(焦油量11mg)2周,然后3組人員分別吸食同一品牌的三個不同焦油量的混合型卷煙( 焦油量3mg, 8mg,11 mg)共計6 周,同組人員均吸食同一品牌同一種焦油量的卷煙。吸煙者根據(jù)個人生活習(xí)慣第日吸食10~20支卷煙。收集第日吸食卷煙后剩余的煙蒂,-80℃凍存。

    分別于吸煙者吸食不同焦油量卷煙的觀察期的第14天、28天、42天進(jìn)行血液樣本采集。非吸煙者在體格檢查完成后的第2天進(jìn)行血液標(biāo)本采集。采集血液樣本前晚18時以后禁食,禁飲酒、咖啡、濃茶等。采集空腹肘靜脈血 4 mL,置入EDTA抗凝管中。血液樣本采集后2 h內(nèi)離心,4℃,3000rpm/min,離心10 min,血漿轉(zhuǎn)移至無RNA酶的潔凈EP管中,-80℃冰箱保存,擇期統(tǒng)一進(jìn)行miRNA檢測。

    1.3 血漿miRNA的提取和miRNA表達(dá)譜芯片檢測

    應(yīng)用miRNA提取試劑盒提取血漿miRNA(Qiagen kit),應(yīng)用Nanodrop儀進(jìn)行miRNA質(zhì)量檢測,全部100份血漿miRNA均質(zhì)檢合格。選取其中40例質(zhì)量好的血漿miRNA樣本(吸煙組28例,非吸煙者12例)進(jìn)行human miRNA表達(dá)譜芯片檢測。應(yīng)用安捷倫human miRNA microarray芯片(Version 19.0)進(jìn)行檢測,共檢測40張芯片。應(yīng)用Signi fi cance Analysis Microarrays(SAM,Version 3.0)軟件挑選差異表達(dá)的miRNA。應(yīng)用Cluster 3.0對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行聚類分析,F(xiàn)DR(False discovery rate)控制在5%以內(nèi)。

    1.4 血漿miRNA實時聚合酶鏈反應(yīng)

    從microarray芯片檢測發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)的miRNA 中隨機(jī)選擇自身表達(dá)豐度高的3個miRNAs(has-miR-16-5p, has-miR-451a, has-miR-486-5p)進(jìn)一步應(yīng)用熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測,驗證芯片的準(zhǔn)確性。應(yīng)用RNA U6作為內(nèi)參,第個miRNA進(jìn)行3次熒光定量PCR檢測。PCR擴(kuò)增條件:95℃,15s;60℃,30s,40個循環(huán);75℃至95℃繪制溶解曲線,非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增情況。

    1.5 差異表達(dá)的miRNA的功能富集分析

    應(yīng)用生物信息學(xué)方法對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行功能富集分析。利用超幾何分布假設(shè)檢驗分析差異表達(dá)的miRNA的相關(guān)功能及相關(guān)疾病的富集度,對獲得的p 值進(jìn)行Bonferroni多重比較校正。

    1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

    對于 microarray,應(yīng)用 Agilent Feature Extraction(v10.7)軟件對雜交圖片進(jìn)行分析并提取數(shù)據(jù)。使用 Agilent GeneSpring 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化,采用 GeneSpring軟件進(jìn)行組間的差異分析。采用兩組獨(dú)立樣本的t 檢驗方法進(jìn)行兩組差異表達(dá)基因分析,ANOVA 方法進(jìn)行多組差異表達(dá)基因分析。P<0.05定義為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 血漿miRNA表達(dá)譜芯片檢測結(jié)果

    吸煙者與非吸煙者血漿miRNA的microarray比較,共篩選出35個差異表達(dá)的miRNA(表達(dá)上調(diào)>2倍或表達(dá)下調(diào)<0.5倍)。其中24個miRNA 表達(dá)上調(diào),11個miRNA表達(dá)下調(diào)(表1)。

    表1 吸煙者和非吸煙者血漿中差異表達(dá)的miRNATab.1 Expression difference of miRNAs in the plasma of smokers and non-smokers

    has-miR-20b-5p5.039064up has-miR-25-3p3.595638up has-miR-42714.768379up has-miR-42985.516026up has-miR-451a3.819415up has-miR-4738-3p3.590218up has-miR-5196-5p2.078181up has-miR-60762.067823up has-miR-60853.424223up has-miR-61243.564162up has-miR-61272.395435up has-miR-61652.637793up has-miR-93-5p2.631095up has-miR-7d-3p3.208561down has-miR-1227-5p4.2256down has-miR-15874.316864down has-miR-3135b5.213491down has-miR-3940-5p3.098348down has-miR-45302.216615down has-miR-485-3p5.370382down has-miR-4944.935441down has-miR-5724.414798down has-miR-574-3p8.195707down has-miR-60682.692841down

    2.2 差異表達(dá)的miRNA的熒光定量PCR驗證

    為驗證microarray芯片檢測的可靠性,應(yīng)用熒光定量PCR方法對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行了實驗驗證。在35個顯著差異表達(dá)的miRNAs中隨機(jī)選擇了表達(dá)豐度高且目前研究廣泛的2個miRNAs (has-miR-451a,has-miR-16-5p) ,以及在循環(huán)中表達(dá)豐度高但差異表達(dá)不顯著(小于2倍)的has-miR-486-5p進(jìn)行了熒光定量PCR檢測。

    參照文獻(xiàn)[6],對芯片數(shù)據(jù)及熒光定量PCR數(shù)據(jù)進(jìn)行了歸一化處理,使兩者具有可比性。具體方法:從miRNA 芯片得到吸煙者與非吸煙者血漿中不同miRNA的信號平均值,將吸煙者的信號值除以非吸煙者的信號值,得到比值Rarray(吸煙/非吸煙對照)。miRNA的熒光定量PCR(qRT-PCR)計算公式:

    Rpcr=EmiR-x?CP(對照-樣本)/ERNAU6?CP(對照-樣本)

    公式中,RNAU6 作為內(nèi)參;E表示擴(kuò)增效率;CP(crossing point) 表示實時熒光強(qiáng)度顯著大于背景值時的循環(huán)數(shù)。計算miRNA的芯片檢測比值Rarray與熒光定量PCR比值Rpcr, 比值大于1表示miRNA表達(dá)上調(diào),比值小于1表示miRNA表達(dá)下調(diào)。相對于內(nèi)參RNAU6, has-miR-16-5p, has-miR-451a, has-miR-486-5p的表達(dá)在芯片檢測和熒光定量PCR檢測中均上調(diào)。熒光定量PCR檢測結(jié)果與芯片檢測結(jié)果一致(圖1)。

    圖1 miRNA的芯片檢測和qRT-PCR檢測結(jié)果Fig.1 Quantitative PCR validation and microarray results of miRNA

    2.3 差異表達(dá)的miRNA的功能富集分析

    應(yīng)用TAM 工具 (http://202.38.126.151/hmdd/tools/tam.html)對差異表達(dá)的miRNA進(jìn)行功能富集分析。通過富集分析,我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的miRNA和32種疾病條目具有顯著差異,見表2(藍(lán)色條目)。分析這32條疾病條目發(fā)現(xiàn):表達(dá)上調(diào)的miRNA與乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等實體瘤以及血液系統(tǒng)腫瘤密切相關(guān)。表達(dá)上調(diào)的miRNA和12條生理過程條目具有顯著差異,見表2(紅色條目)。分析這12條生理過程條目發(fā)現(xiàn):表達(dá)上調(diào)的miRNA與凋亡、細(xì)胞死亡、血管生成等組織發(fā)育、免疫有著極為密切的聯(lián)系。

    表達(dá)下調(diào)miRNA和prion disease (P=0.02), Ischemia(P=0.03),SARS (P=0.03)以及Cocaine-related disorders(P=0.04)等有關(guān),但對p-value經(jīng)過FDR校正之后,差異均不顯著。

    表2 吸煙者血漿中差異表達(dá)miRNA所富集的分子功能和疾病條目Tab. 2 Enriched function categories and diseases of miRNAs with signi fi cantly different expression in the plasma of smokers and nonsmokers

    續(xù)表2

    3 討論

    研究報道,吸煙可導(dǎo)致血漿中微泡和miRNA簽名發(fā)生變化[7]。吸煙也可誘發(fā)肺組織、食道、肝細(xì)胞miRNA表達(dá)發(fā)生變化[8-10]。日本學(xué)者比較了11名吸煙者和7名非吸煙者血漿miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)慢性吸煙可影響血漿miRNA表達(dá)譜變化,而急性環(huán)境暴露并不影響血漿miRNA表達(dá)譜變化[11]。本研究應(yīng)用的Agilent人miRNA表達(dá)譜芯片檢測的miRNA總數(shù)為1875個。我們將吸煙者與非吸煙者血漿miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了比較。芯片表達(dá)譜分析共發(fā)現(xiàn)35個差異表達(dá)的miRNA,其中表達(dá)顯著上調(diào)的有24個,表達(dá)顯著下調(diào)的有11個。尼古丁敏感的Has-miR-140-3p 在吸煙人群血漿表達(dá)顯著上調(diào)。對尼古丁和苯并芘應(yīng)激反應(yīng)最敏感的has-miR-16在吸煙人群血漿表達(dá)也顯著上調(diào)。結(jié)果提示,研究吸煙者血漿中特異性miRNA表達(dá)變化,可為“吸煙與健康”的關(guān)系研究提供新的研究思路和研究靶點(diǎn)。

    卷煙煙氣中含有一氧化碳、亞硝胺等化學(xué)物質(zhì),這些物質(zhì)可通過染色體畸變、DNA損傷等多種交叉途徑引發(fā)細(xì)胞損傷[12-13]。由于miRNA大多位于基因的脆性位點(diǎn)上,導(dǎo)致miRNA容易受到毒物攻擊而導(dǎo)致表達(dá)改變。NNK是一種煙草特異性致癌物,廣泛存在于各類煙草制品中。文獻(xiàn)報道,雄性大鼠飲水中持續(xù)喂飼10 ppM 的NNK 20周可導(dǎo)致大鼠肺組織miRNA表達(dá)變化[14]。我國科研人員發(fā)現(xiàn),雄性大鼠皮下注射NNK 1.15mg/kg,第周3次,連續(xù)皮下注射20周可導(dǎo)致肺癌發(fā)生,大鼠血清中miR-206和miR-133b表達(dá)顯著上調(diào),肺癌組織miR-206和miR-133b表達(dá)顯著降低[15],提示循環(huán)miRNA可能成為NNK誘導(dǎo)肺癌發(fā)生的潛在生物標(biāo)志物。

    文獻(xiàn)報道,吸煙者易患白血病[16],父母吸煙者,其子女易患白血病的發(fā)病率增高[17-18]。究其原因,考慮尼古丁暴露導(dǎo)致原代miRNA表達(dá)譜發(fā)生變化,這種變化可影響子代和孫代miRNA的表達(dá)[19]。吸煙者易發(fā)生心律失常、房顫,其原因與吸煙者血漿中miR-1202表達(dá)發(fā)生變化進(jìn)而促進(jìn)心肌纖維化以及房顫的發(fā)生有關(guān)[20]。吸煙導(dǎo)致差異表達(dá)的miRNA的靶基因與腫瘤中吸煙調(diào)節(jié)的基因有很強(qiáng)的相關(guān)性[21]。文獻(xiàn)報道m(xù)iRNAs(has-miR-107, has-miR-140-3p,has-miR-15a-5p, has-miR-16-5p)在白血病患者血漿中表達(dá)升高[22],血漿中的miR-17-5p, miR-185-5p,miR-19a-3p,miR-19b-3p,miR-20a-5p,miR-20b-5p,miR-25-3p,miR-451a, miR-93-5p,miR-4738-3p在肝癌、食道癌、膀胱癌等腫瘤中差異表達(dá)[23-25]。提示吸煙者血漿中差異表達(dá)的miRNA可能是誘發(fā)房顫、白血病、腫瘤等疾病發(fā)生的危險因素。

    本研究中,我們通過miRNA功能富集分析發(fā)現(xiàn),吸煙導(dǎo)致血漿中差異表達(dá)的miRNA的功能涉及免疫調(diào)節(jié)、激素調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡、血管生成、AKT信號通路等生物學(xué)進(jìn)程。通過研究吸煙與血漿miRNA表達(dá)譜變化,以及miRNA與疾病之間的關(guān)聯(lián)度分析,有助于幫助了解卷煙煙氣中的有害化學(xué)物質(zhì)對機(jī)體的影響及可能導(dǎo)致疾病發(fā)生的分子作用機(jī)制,可為煙草制品提供一種新的檢測有害物質(zhì)的生物標(biāo)志物。為通過煙葉改良、卷煙工藝改良等技術(shù)手段干預(yù)差異表達(dá)的miRNA,進(jìn)一步降低吸煙對健康的危害提供新的思路和研究方法。

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    Effect of cigarette smoking on plasma microRNA expression pro fi le

    SHI Bing1, ZHANG Tianyang1, LIU Xingyu2, ZHANG Jie2, ZHOU Jun2, WANG Yanting3
    1 Department of Cardiology, Beijing Military General Hospital, Beijing 100700, China;2 Technology Center, Beijing Cigarettes Factory, Beijing 100141, China;3 State Tobacco Monopoly Administration, Beijing 100045, China

    Objective: Circulating microRNA (miRNA) is recognized as potential biomarkers of various diseases. This study aims to explore whether the level of circulating miRNA in smoker vary with cigarette smoking by using plasma miRNA expression profile to detect smoking-related speci fi city of miRNA. Methods: In this study, the miRNA expression pro fi les of 28 young smokers and 12 non-smokers were determined by Agilent human MicroRNA array. The enrichment function of di ff erentially expressed miRNAs induced by cigarette smoking was analyzed by bioinformatics method. Results: 35 miRNAs were di ff erentially expressed between smokers and non-smokers.24 miRNAs were up-regulated and 11 miRNAs were down-regulated in the smokers. Bioinformatics analysis indicated that dysregulated miRNAs was related to immune system and hormones regulation. Conclusion: Cigarette smoking changed plasma miRNA expression pro fi le in smokers. As a biomarker, miRNA may help to understand the mechanisms by which disease responds to toxic substances included in tobacco smoking.

    cigarette smoking; plasma; microRNA; expression pro fi le; biomarker

    施冰,張?zhí)礻?,劉興余,等. 吸煙對青年吸煙者血漿微小RNA表達(dá)譜影響的研究[J]. 中國煙草學(xué)報,2016,22(1)

    上海煙草集團(tuán)北京卷煙廠資助項目(No. JZ13005)

    施冰,博士,副主任醫(yī)師,副教授,碩士研究生導(dǎo)師,主要從事心血管疾病的臨床診治及生物標(biāo)志物研究,Tel:010-66721250,Email:dr_shibing@bjmu.edu.cn

    2015-05-04

    : SHI Bing, ZHANG Tianyang, LIU Xingyu, et al. E ff ect of cigarette smoking on plasma microRNA expression pro fi le [J]. Acta Tabacaria Sinica, 2016,22(1)

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