毛白楊木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶PtoXTH35原核可溶性表達(dá)方法研究

鈺華　李爽　蓋穎

摘要：從毛白楊中克隆得到木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶PtoXTH35基因，根據(jù)SignalIP在線軟件預(yù)測蛋白信號肽，并分別構(gòu)建至pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a等5種原核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切和測序驗證后轉(zhuǎn)化至BL21（DE3）感受態(tài)，使用終濃度為0.4 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)其表達(dá)目的蛋白。經(jīng)SDS-PAGE檢測，結(jié)果表明5種載體均可表達(dá)目的蛋白，pET28a、pET32a、pGEX-4t-1等3種載體所表達(dá)蛋白均以包涵體的形式存在，而pMAL-c5e和pET 43.1a載體攜帶蛋白表達(dá)量高并且所表達(dá)蛋白50%為可溶性蛋白，實現(xiàn)了毛白楊PtoXTH35在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高效可溶性表達(dá)，該試驗為后續(xù)進(jìn)一步研究毛白楊PtoXTH35的體外功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：毛白楊;木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶;原核表達(dá);包涵體;可溶性蛋白

中圖分類號： S792.117.01文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）08-0033-04

在植物的生長發(fā)育以及抵御生物和非生物脅迫過程中，細(xì)胞壁發(fā)揮著不可忽視的作用。在雙子葉植物的初生細(xì)胞壁中，木葡聚糖以非共價鍵的形式與纖維素相連，從而形成了初生細(xì)胞壁當(dāng)中主要的張力承載結(jié)構(gòu)，木葡聚糖水解酶（xyloglucan endohydrolase，XEH）可以快速催化木葡聚糖的水解從而實現(xiàn)細(xì)胞壁的膨脹[1]。Albersheim等做出假設(shè)認(rèn)為在植物細(xì)胞生長過程中還存在一種糖苷內(nèi)部轉(zhuǎn)移酶，將多糖鏈的一部分轉(zhuǎn)移至自身的其他位置[2]。隨后Fry等率先發(fā)現(xiàn)了一種蛋白可以在快速生長的植物細(xì)胞當(dāng)中催化木葡聚糖鏈的斷裂以及重連，并命名為木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶（xyloglucan endotransglycosylase，XET）[3]，XET和XEH共同組成了木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（xyloglucan endotransglycosylase/hydrolase，XTH）家族，被認(rèn)為是一種細(xì)胞壁松弛酶，在植物生長過程中以及抵御外界脅迫過程中參與了細(xì)胞壁重構(gòu)。XTH是一類龐大的多基因家族，屬于碳水化合物活性酶家族數(shù)據(jù)庫（CAZy）中的糖苷水解家族GH16。在毛果楊、擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了該基因家族中分別含有41、33個成員[4]，根據(jù)XTH蛋白編碼的氨基酸序列以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可以將它們分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ等3類，其中Ⅰ和Ⅱ類具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性，Ⅲ類具有糖苷水解酶活性[5]。

目前對于XTH的研究主要集中在對該基因家族成員的功能鑒定及其在植物生長發(fā)育和抵御外界脅迫過程中發(fā)揮作用的機(jī)制，而要對基因家族中的成員進(jìn)行體外功能驗證則必須要實現(xiàn)蛋白的體外可溶性表達(dá)。目前文獻(xiàn)中多采用酵母表達(dá)方法獲得XTH可溶性蛋白，只有極少數(shù)文獻(xiàn)報道通過原核表達(dá)以及包涵體變復(fù)性的方法獲得可溶性蛋白，這可能是受限于XTH在原核系統(tǒng)中多以包涵體的形式表達(dá)[6-10]。因此，本研究擬通過更換攜帶有不同可溶性標(biāo)簽的載體以實現(xiàn)毛白楊PtoXTH35（Populus tomentosa xyloglucan endotransgl-ycosylase/hydrolase 35）蛋白在原核中的高效可溶性表達(dá)，以期為后續(xù)功能驗證等相關(guān)試驗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

試驗于2016年10月至2017年3月在北京市海淀區(qū)北京林業(yè)大學(xué)進(jìn)行。

1.1質(zhì)粒和菌株

pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a質(zhì)粒載體以及大腸桿菌（Escherichia coli） BL21（DE3）、JM109菌株均由筆者所在實驗室保留。

1.2試劑

胰蛋白胨、酵母粉均購自O(shè)xiod公司;Taq酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶、2 ku DNA Maker、10 ku DNA Maker，均購自寶生物工程（大連）有限公司;蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所;其他化學(xué)試劑均購自北京藍(lán)弋化工產(chǎn)品有限責(zé)任公司。

1.3主要儀器

POWER PAC 300電泳儀（美國BIO-RED公司），Universal Hood Ⅱ型凝膠成像儀（美國BIO-RED公司），ABI Veriti FAST 梯度PCR儀（美國Applied Biosystems公司），DNA Engine連接儀（美國BIO-RED公司），SHK-02-Ⅰ臺式空氣恒溫?fù)u床（北京北方同正生物技術(shù)發(fā)展有限公司），JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝科器研究所）。

1.4試驗方法

1.4.1毛白楊PtoXTH35基因克隆與序列分析

通過在NCBI上查找得到毛果楊PtrXTH35基因序列信息，利用DNAMAN設(shè)計正向引物5′-ATGGCTGTTTCAGTCTTTAAG-3′和反向引物5′-CTAGTGGTGGCGGTGGCT-3′。以毛白楊的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序為95 ℃ 5 min，95 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)，72 ℃ 10 min。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，并利用DNA純化回收試劑盒進(jìn)行膠回收并送至北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序，將測序所得序列與毛果楊PtrXTH35序列進(jìn)行比對。

1.4.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用DNAMAN將測序得到的PtoXTH35的DNA序列翻譯為氨基酸序列并上傳至SignalIP和TMHMM 2.0在線軟件分析信號肽序列和跨膜區(qū)，以去除信號肽的序列為模板設(shè)計引物，利用PCR方法為目的基因兩端加上酶切位點，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收后用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切并回收目的片段，同時用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶對質(zhì)粒載體pET28a、pET32a、pGEX-4t-1、pMAL-c5e、pET 43.1a進(jìn)行酶切回收，之后將酶切的載體和目的片段利用T4連接酶連接，將連接液經(jīng)CaCl2法轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)，待長出單克隆后搖菌提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。載體構(gòu)建引物及酶切位點如表1所示。

1.4.3PtoXTH35蛋白原核表達(dá)

將構(gòu)建好的載體pET28a-PtoXTH35、pET32a-PtoXTH35、pGEX-4t1-PtoXTH35、pMAL-c5e-PtoXTH35、pET 43.1a-PtoXTH35轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)并用抗生素篩選陽性菌株，挑取陽性單克隆接種于5 mL含相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h，之后將5 mL菌液接種于 100 mL 含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至 D600 nm=0.4左右，加入異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.4 mmol/L。 28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)4 h，6 000 r/min 離心10 min收集菌體，加入4倍體積50 mmol/L Tris-HCl（pH值為8.0）緩沖液重懸，經(jīng)超聲破碎后 12 000 r/min 離心，取上清和沉淀加入等體積蛋白上樣緩沖液，沸水中煮5 min后離心取上清，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）鑒定蛋白表達(dá)。

2結(jié)果與分析

2.1毛白楊PtoXTH35基因克隆與序列分析

經(jīng)PCR擴(kuò)增得到如圖1所示的DNA片段，測序獲得毛白楊PtoXTH35核酸序列，與毛果楊PtrXTH35序列比對相似度高達(dá)98.32%（圖2），證實該序列為毛白楊PtoXTH35基因片段，該序列全長888 bp，由269個氨基酸組成，所翻譯的蛋白質(zhì)分子量為33.69 ku，經(jīng)SignalIP和TMHMM 2.0在線軟件分析該蛋白N端存在跨膜區(qū)可能為信號肽序列，且推測信號肽裂解位點位于第25和第26個氨基酸之間（圖3、圖4）。

2.2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將5個載體的陽性質(zhì)粒經(jīng)雙酶切進(jìn)行驗證，分別選用表碼和突變，可以用于下一步的誘導(dǎo)表達(dá)。

2.3PtoXTH35蛋白的原核誘導(dǎo)表達(dá)

將5種重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，經(jīng)0.4 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后收集菌體，取全菌以及經(jīng)超聲破碎后的沉淀和上清液煮沸后經(jīng)12% SDA-PAGE檢測蛋白表達(dá)，由于5種原核表達(dá)載體均攜帶了分子量不同的可溶性蛋白標(biāo)簽，因此所表達(dá)的融合蛋白分子量并不相同，根據(jù)計算獲得融合蛋白分子量的理論值，pET28a攜帶了1個 6×His標(biāo)簽，融合蛋白分子量約為32 ku;pET32a攜帶了1個19 ku的硫氧還蛋白（thioredoxin，Trx），融合蛋白分子量約為51 ku;pGEX-4t-1攜帶了1個27 ku的谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（glutathione S transferase，GST），融合蛋白分子量約為 59 ku;pMAL-c5e攜帶了1個40 ku的麥芽糖結(jié)合蛋白（maltose-binding protein，MBP），融合蛋白分子量約為72 ku;pET 43.1a攜帶了1個60 ku的轉(zhuǎn)錄終止抗終止因子（N-utilization substance，Nus），融合蛋白分子量約為92 ku。結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，攜帶5種重組載體的大腸桿菌均成功表達(dá)了融合蛋白，并且分子量與理論分子量相符合（圖6）。但五種原核表達(dá)載體所表達(dá)蛋白的表達(dá)量以及可溶性表達(dá)情況并不相同，其中pET28a蛋白表達(dá)量最高，但蛋白幾乎全部以包涵體形式存在;pGEX-4t-1和pET32a蛋白表達(dá)量較低，并且所表達(dá)蛋白同樣以包涵體形式存在;而pMAL-c5e和pET 43.1a蛋白表達(dá)量較高，而可溶性蛋白含量與包涵體蛋白大致相同，因此可溶性蛋白達(dá)到了總表達(dá)蛋白的50%左右，實現(xiàn)了PtoXTH蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高效可溶性表達(dá)。

3結(jié)論

XTH基因廣泛存在于植物中，在植物細(xì)胞壁修飾中發(fā)揮重要作用，其龐大的基因家族中存在眾多還未明確得到功能驗證的成員，因此迫切需要對該家族中成員進(jìn)行體外和體內(nèi)功能驗證，包括活性測定以及體外蛋白互作研究則須要獲得可溶性的目的蛋白?，F(xiàn)有報道XTH的原核表達(dá)往往會形成包涵體，大部分文獻(xiàn)中采用酵母表達(dá)的方法獲得XTH蛋白，但酵母表達(dá)方法耗時較長，并且純化步驟較為繁瑣，對表達(dá)條件也更為敏感，本研究更換了5種攜帶有不同可溶性標(biāo)簽的原核表達(dá)載體，通過嘗試發(fā)現(xiàn)攜帶有MBP蛋白的pMAL-c5e和攜帶有Nus因子的pET 43.1a均可實現(xiàn)PtoXTH35蛋白在原核表達(dá)系統(tǒng)中的高效可溶性表達(dá)，與大部分文獻(xiàn)中[6-9]通過酵母表達(dá)獲得XTH蛋白的方法相比，縮短了試驗周期，并且表達(dá)條件穩(wěn)定，純化步驟相較酵母表達(dá)也更為簡單，這為后續(xù)深入研究毛白楊PtoXTH35的生物學(xué)功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Rose J K，Braam J，F(xiàn)ry S C，et al. The XTH family of enzymes involved in xyloglucan endotransglucosylation and endohydrolysis：current perspectives and a new unifying nomenclature[J]. Plant & Cell Physiology，2002，43（12）：1421-1435.

[2]Albersheim，P. Xyloglucans in the primary cell wall[M]. New York：Academic Press，1976：225-274.

[3]Smith R C，F(xiàn)ry S C. Endotransglycosylation of xyloglucans in plant cell suspension cultures[J]. Biochemical Journal，1991，279（Pt 2）：529-535.

[4]Geisler-Lee J，Geisler M，Coutinho P M，et al. Poplar carbohydrate-active enzymes：Gene identification and expression analyses[J]. Plant Physiology，2006，140（3）：946-962.

[5]杜麗萍，沈昕，陳少良，等. 細(xì)胞壁重構(gòu)關(guān)鍵酶木葡聚糖內(nèi)轉(zhuǎn)糖苷酶/水解酶（XTH）的研究進(jìn)展[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2010，18（3）：604-609.

[6]Baumann M J，Eklof J M，Michel G，et al. Structural evidence for the evolution of xyloglucanase activity from xyloglucan endo-transglycosylases：biological implications for cell wall metabolism[J]. Plant Cell，2007，19（6）：1947-1963.

[7]Johansson P，Brumer H，Baumann M J，et al. Crystal structures of a [JP3]poplar xyloglucan endotransglycosylase reveal details of transglycosylation acceptor binding[J]. Plant Cell，2004，16（4）：874-886.

[8]Kallas A M，Piens K，Denman S E，et al. Enzymatic properties of native and deglycosylated hybrid aspen （Populus tremula×tremuloides） xyloglucan endotransglycosylase 16A expressed in Pichia pastoris[J]. Biochemical Journal，2005，390（Pt1）：105-113.

[9]Saura-Valls M，F(xiàn)aure R，Ragas S，et al. Kinetic analysis using low-molecular mass xyloglucan oligosaccharides defines the catalytic mechanism of a Populus xyloglucan endotransglycosylase[J]. Biochemical Journal，2006，395（1）：99-106.

[10]Han Y S，Wang W，Sun J，et al. Populus euphratica XTH overexpression enhances salinity tolerance by the development of leaf succulence in transgenic tobacco plants[J]. Journal of Experimental Botany，2013，64（14）：4225-4238.