食品中氨基糖苷類抗生素快速分析方法研究進(jìn)展

邵杰　韋達(dá)理　曾昆　黃哲　杜道林

摘要：氨基糖苷類抗生素是一類廣譜性抗生素，在臨床和動(dòng)物醫(yī)療中應(yīng)用廣泛，從而導(dǎo)致它在動(dòng)物源性食品中廣泛殘留。目前，各國針對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素以及鏈霉素/雙氫鏈霉素設(shè)有最高殘留限量。由于檢測(cè)樣本數(shù)量龐大，并且檢測(cè)目標(biāo)物種類眾多，因此對(duì)簡便、快速的分析方法需求愈加強(qiáng)烈。以特異性抗體為基礎(chǔ)的免疫分析方法在氨基糖苷類抗生素的快速分析中占有重要地位，同時(shí)核酸適配體被篩選出來并被引入到快速分析領(lǐng)域，豐富和發(fā)展了快速分析的類型。主要綜述基于能夠特異性識(shí)別氨基糖苷類抗生素抗體和適配體構(gòu)建的快速分析方法，包括單一藥物分析和多殘留分析方法，以期對(duì)該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)和方向提供參考。

關(guān)鍵詞：氨基糖苷類抗生素;抗體;適配體;快速分析方法;ELISA

中圖分類號(hào)： TS207.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2019）08-0018-07

氨基糖苷類（aminoglycosides，AGs）抗生素是一類由氨基環(huán)醇和氨基糖通過氧橋連接而成的苷類化合物，通過與細(xì)菌的沉降系數(shù)為70S核糖體的30S亞基部位結(jié)合，抑制始動(dòng)復(fù)合物形成，阻礙終止因子的作用，阻礙合成的蛋白質(zhì)的釋放，從而抑制細(xì)菌體內(nèi)的蛋白質(zhì)合成，使細(xì)菌不能生長[1]。常用的AGs包括卡那霉素、新霉素、鏈霉素、慶大霉素、妥布霉素、小諾米星、西索米星、阿貝卡星、阿司米星和達(dá)地米星等。由于其價(jià)格低廉且抗菌效果好，在臨床上廣泛用于革蘭氏陰性菌、單胞菌屬、葡萄菌屬感染和結(jié)核病等的治療[2]。在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，AGs主要用于防治牛乳腺炎、腸炎、子宮炎、腹膜炎、敗血癥等，同時(shí)還可以促進(jìn)動(dòng)物的生長[3]。

然而AGs具有較明顯的腎毒性、耳毒性以及前庭神經(jīng)功能損害[4]，嚴(yán)重時(shí)還會(huì)致人休克，甚至死亡。我國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY 5045—2008《無公害食品生鮮牛乳》中明確規(guī)定，牛奶中“抗生素不得檢出”。我國、歐盟、日本以及美國均制定了AGs的最高殘留限量（maximum residue limit，MRL）（表1）。目前主要針對(duì)慶大霉素、卡那霉素、新霉素以及鏈霉素/雙氫鏈霉素（表示2種霉素總量，下文同）設(shè)有MRLs，具體結(jié)構(gòu)見圖1。

鑒于AGs在動(dòng)物性食品中的廣泛殘留，對(duì)人體和環(huán)境造成的巨大危害，發(fā)展簡便、快速、靈敏的檢測(cè)方法顯得十分重要。儀器分析方法，如高效液相色譜（HPLC）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）[8-9]方法，具有較高的靈敏度和準(zhǔn)確性，但是儀器昂貴并且前處理復(fù)雜，使儀器分析方法在快速分析領(lǐng)域并不占優(yōu)勢(shì)。近年來，隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基于特異性生物識(shí)別元件，如抗體和核酸適配體，構(gòu)建一系列快速、靈敏的分析方法，并在方法中結(jié)合新型納米材料、熒光信號(hào)等，極大地提高了檢測(cè)的靈敏度，縮短了檢測(cè)時(shí)間。其中抗體制備通常來自于免疫動(dòng)物以及雜交瘤技術(shù)，由于AGs屬于小分子半抗原，無法單獨(dú)刺激機(jī)體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，因此須要對(duì)抗原進(jìn)行設(shè)計(jì)和改造，要獲得高靈敏度的抗體有一定難度。核酸適配體是一小段單鏈DNA或RNA序列，通過指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技術(shù)篩選得到[10]。與傳統(tǒng)的抗體相比，核酸適配體不僅選擇性專一，且具有體外合成周期短、性質(zhì)穩(wěn)定、易于修飾和保存、靶標(biāo)分子種類多等優(yōu)勢(shì)。本研究主要綜述了基于抗體和適配體的快速分析方法在慶大霉素、卡那霉素、新霉素以及鏈霉素/雙氫鏈霉素4種AGs快速檢測(cè)中的應(yīng)用，旨在為該領(lǐng)域的發(fā)展趨勢(shì)和方向提供參考。

1慶大霉素快速分析方法

1.1基于抗體的免疫分析方法

酶聯(lián)免疫分析方法（ELISA）是最常見，也是較早建立的免疫分析方法。職愛民等制備了慶大霉素抗體，并建立了間接競(jìng)爭ELISA，檢測(cè)限可達(dá)0.1 ng/mL[11-14]。郭浩等建立了慶大霉素獸藥殘留的懸液芯片直接競(jìng)爭檢測(cè)法，并同時(shí)與常規(guī)酶聯(lián)免疫分析方法進(jìn)行比較，二者的檢測(cè)限分別為010、0.27 ng/mL[15]。

可視化檢測(cè)可以避免使用大型儀器，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中極具優(yōu)勢(shì)，結(jié)合納米金、納米銀、碳納米管等新型納米材料極大地拓展了分析方法的類型。王麗哲等研制了慶大霉素半定量膠體金試紙條，對(duì)牛奶樣品的檢測(cè)限為20 μg/kg[16]。Jin等建立了免疫層析方法定量和定性檢測(cè)慶大霉素，檢測(cè)限為 6 ng/mL[13]。李周敏等采用納米銀標(biāo)記的二抗（羊抗鼠）及銀增強(qiáng)顯色劑，建立可視化蛋白芯片檢測(cè)牛奶中的慶大霉素，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，該方法慶大霉素的線性檢測(cè)范圍為0.1～200.0 ng/mL，檢測(cè)限為0.1 ng/mL[17]。筆者所在研究小組獲得了一株高靈敏度的慶大霉素單克隆抗體， 并建立了基于碳納米管的離心定量方法和過濾定性方法，其中前者的檢測(cè)限為0.048 ng/mL，線性范圍為0.080～0.512 ng/mL，后者的檢測(cè)限為0.1 ng/mL[18]。

除了常規(guī)的IgG抗體外，Li等免疫雞獲得了針對(duì)慶大霉素的IgY抗體，并建立了熒光偏振免疫分析法（fluorescence polarization immunoassay，F(xiàn)PIA），方法的檢測(cè)限為 0.17 μg/mL[19]。

1.2基于適配體的分析方法

關(guān)于慶大霉素適配體的報(bào)道較少，Wang等篩選到了特異性識(shí)別氨基糖苷類藥物的RNA，對(duì)妥布霉素、新霉素B、慶大霉素、紅霉素的解離常數(shù)分別為0.77 nmol/L、1.03 μmol/L、[JP+1]7.81 μmol/L、9.23 μmol/L[20];Rowe等利用RNA適配體，建立了電化學(xué)分析方法檢測(cè)血液樣品中的卡那霉素、妥布霉素和慶大霉素，檢測(cè)范圍在4～10 μg/mL[21]。上述研究主要分析人血液中的藥物濃度，所建立的方法靈敏度較低，目前對(duì)于食品中的基于適配體的慶大霉素的分析方法鮮有報(bào)道。

2卡那霉素快速分析方法

2.1基于抗體的免疫分析方法

He等選用碳二亞胺法合成免疫原免疫雞，經(jīng)5次免疫后獲得IgY型抗體，應(yīng)用此抗體建立了間接競(jìng)爭ELISA檢測(cè)食品中卡那霉素的方法，該方法的IC50（half maximal inhibitory concentration，半抑制濃度）為4.48 ng/mL，回收率在 82.02%～98.20%之間[22]。Li等獲得了針對(duì)卡那霉素的IgY抗體，并建立了FPIA，檢測(cè)限可達(dá)0.001 μg/mL[19]。徐飛等建立了牛奶中同時(shí)檢測(cè)卡那霉素和慶大霉素的可視化凝膠ELISA，該方法采用的是一步法，檢測(cè)耗時(shí)僅為15 min，對(duì)2種抗生素的檢出限均為5 μg/L[23]。

Wei等利用石墨片-全氟磺酸/硫堇/鉑修飾的玻璃碳電極建立了一個(gè)無標(biāo)記的電化學(xué)免疫傳感器法來檢測(cè)動(dòng)物源性食品中的卡那霉素，該方法具有較低的檢測(cè)限（5.74 pg/mL）和較寬的檢測(cè)范圍（0.01～12.00 ng/mL）[24]。Yu等建立了以銀雜化多孔四氧化三鐵納米材料（Ag@Fe3O4NPs）和硫堇混合石墨烯片（TH-GS）為基礎(chǔ)的免疫傳感器，并應(yīng)用于檢測(cè)卡那霉素，該免疫傳感器中硫堇被用作電子轉(zhuǎn)移媒介，Ag@Fe3O4NPs能夠固定更多的卡那霉素和促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，在循環(huán)伏安法和方波伏安法作用下可以用于識(shí)別卡那霉素，檢測(cè)限可達(dá)15 pg/mL[25]。

2.2基于適配體的分析方法

根據(jù)不同納米材料的理化性質(zhì)，將適配體與之結(jié)合，構(gòu)建了多種比色分析方法。Wang等用酪氨酸作為還原劑和封閉劑制備了具有酶促活性的金納米顆粒，再將金納米顆粒與核酸適配體結(jié)合，建立了無需酶的直接電化學(xué)法來檢測(cè)蜂蜜中的卡那霉素，該方法具有極高的靈敏度，檢測(cè)限可達(dá) 60 pmol/L[26]。賈向陽等基于聚陽離子魚精蛋白與帶負(fù)電的核酸適配體以及金納米粒子之間的靜電作用，構(gòu)建了一種新型生物納米檢測(cè)技術(shù)來檢測(cè)牛奶中的卡那霉素，其線性范圍是5～5 000 nmol/L，該方法的檢出限為0.52 nmol/L[27]。Sharma等將具有酶活性的金納米顆粒和卡那霉素適配體結(jié)合，建立了能夠在3～8 min內(nèi)快速檢測(cè)出卡那霉素含量的生物傳感器，該傳感器檢測(cè)用時(shí)短，還能高靈敏地識(shí)別卡那霉素，檢測(cè)限達(dá)1.49 nmol/L[28]。Xu等應(yīng)用未被修飾的銀納米顆粒作探針，卡那霉素可以保護(hù)銀納米顆粒抵抗鹽離子誘導(dǎo)的聚沉，而卡那霉素與適配體結(jié)合后，它的保護(hù)機(jī)制被削弱，該方法可在20 min內(nèi)完成對(duì)卡那霉素的測(cè)定，線性范圍在 0.05～0.60 μg/mL之間[29]。Ramezani等將核酸外切酶Ⅲ、金納米顆粒還有羧基熒光素（FAM）標(biāo)記的卡那適配體互補(bǔ)序列等結(jié)合在一起建立了適用于檢測(cè)食品中卡那霉素殘留的熒光適體傳感器方法。該方法對(duì)卡那霉素和慶大霉素均有很高的識(shí)別能力，且檢測(cè)卡那霉素的檢測(cè)限可達(dá)321 pmol/L [30]。

適配體取代抗體在傳感器技術(shù)的發(fā)展中也有較多的應(yīng)用。Bai等建立了一個(gè)基于適配體的懸臂陣列傳感器來檢測(cè)卡那霉素。該懸臂陣列由傳感懸臂梁和參考懸臂梁組成，當(dāng)卡那霉素和適配體結(jié)合時(shí)會(huì)引起懸臂表面壓力的改變，這個(gè)表面壓力的改變和卡那霉素的濃度呈一定的線性關(guān)系，因此可以達(dá)到檢測(cè)卡那霉素的目的[31]。Qin等首次以硫氨酸功能化石墨烯（GR-TH）和分吸納米孔（HNP）PtCu合金為生物傳感底物，建立了一種無標(biāo)記的電化學(xué)適體傳感器，這一方法具有較寬的線性范圍（5.00×10-7～0.05 μg/mL），檢測(cè)限可達(dá)0.42 pg/mL[32]。Sun等在金電極表面依次修飾殼聚糖金納米粒子（CS-AuNPs）、石墨烯金納米粒子（GR-AuNPs）和多壁碳納米管-鈷酞菁（MWCNTs-CoPc）用于固化適配體，構(gòu)建了一種靈敏的電化學(xué)傳感器，對(duì)卡那霉素的檢測(cè)限可達(dá)5.8 nmol/L [33]。

3新霉素快速分析方法

3.1基于抗體的免疫分析方法

針對(duì)新霉素的免疫分析方法開始的較晚，目前的報(bào)道以ELISA為主。劉沙洲等分別采用1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDC）法、戊二醛法等合成完全抗原，制備了多克隆抗體或單克隆抗體，建立了競(jìng)爭性ELISA，檢測(cè)限為0.1 ng/mL，對(duì)牛奶中新霉素檢測(cè)限為 0.69 ng/mL[34-38]。王愛萍等應(yīng)用制備的新霉素B單克隆抗體，建立了簡便的免疫層析分析方法，通過肉眼判斷其檢測(cè)限為50 ng/mL，可用于奶樣、肌肉以及飼料樣本的分析[39]。

Zhu等在玻碳電極表面先修飾了納米金顆粒，然后組裝了單分子層poly-[2，5-di-（2-thienyl）-1H-pyrrole-1-（p-benzoic acid）]（pDPB），通過EDC/羥基琥珀酰亞胺（NHS）將新霉素抗體1固化在電極表面，新霉素抗體2連接在標(biāo)記烯丙基肼的金納米粒子（AuNPs）/多壁碳納米管復(fù)合材料（Hyd-MWCNT（AuNP）-Ab2）上[40]。當(dāng)有新霉素存在時(shí)，Hyd-MWCNT（AuNP）-Ab2與目標(biāo)物以及電極上的抗體1形成夾心結(jié)構(gòu)，從而誘發(fā)電流的變化。該方法檢測(cè)的線性范圍為10～250 ng/mL，檢測(cè)限為6.76 ng/mL[40]。

3.2基于適配體的分析方法

最早在1999年，Jiang等通過光譜和計(jì)算機(jī)模擬的方法研究了新霉素B與其天然RNA結(jié)合靶點(diǎn)以及體外篩選獲得的RNA適配體的結(jié)合特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)新霉素B與RNA適配體結(jié)合的親和力可以達(dá)到100 nmol/mL[41]。de-los-Santos-Alvarez等在金電極表面修飾了巰基丙酸（MPA）的單層，然后利用碳二亞胺將新霉素B固定在電極上。適配體與電極表面的新霉素B特異性結(jié)合，從而誘發(fā)阻抗變化，該方法的線性范圍在0.75～500.00 μmol/L之間，并且具有較高的特異性，和卡那霉素、鏈霉素、巴龍霉素均沒有交叉反應(yīng)[42]。Ling等將新霉素B的RNA適配體分成2段，一段通過多聚腺苷酸尾（PolyA）吸附在納米金表面，另一段末端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)。當(dāng)樣品中存在靶物質(zhì)時(shí)，靶物質(zhì)與這2段核酸片段在納米金表面快速組裝成緊密的H維結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致FAM熒光基團(tuán)淬滅，因此，溶液中新霉素B的濃度與熒光值成反比。該方法檢測(cè)的線性范圍為0～10 μmol/L，檢測(cè)限為0.01 μmol/L，并且具有較高的特異性[43]。De-Los-Santos-lvarez等構(gòu)建了基于表面等離子共振（SPR）的新霉素B分析方法，它的線性檢測(cè)范圍為10～100 μmol/L，檢測(cè)限為 5 nmol/L[44]。

4鏈霉素/雙氫鏈霉素快速分析方法

4.1基于抗體的免疫分析方法

國外對(duì)鏈霉素免疫分析方法的研究開始得比較早，集中在20世紀(jì)90年代。早在1992年，Hammer等將鏈霉素偶聯(lián)到細(xì)菌蛋白上免疫家兔獲得多克隆抗體，并建立了牛奶中鏈霉素殘留的間接競(jìng)爭ELISA，檢測(cè)限為100 ng/mL[45]。隨后Schnappinger等均建立了競(jìng)爭性ELISA檢測(cè)食品中的鏈霉素/雙氫鏈霉素[46-48]，我國在2000年后才開始相關(guān)研究，并且進(jìn)展迅速，秦燕等制備了鏈霉素抗體，建立了鏈霉素/雙氫鏈霉素殘留檢測(cè)ELISA，檢測(cè)限為0.4～30.0 ng/mL，能夠滿足鏈霉素/雙氫鏈霉素檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[49-56]。

可視化分析方法在鏈霉素/雙氫鏈霉素檢測(cè)中也多有應(yīng)用。Schnappinger等建立了一種簡便的、可視化的免疫過濾方法，對(duì)奶中鏈霉素和雙氫鏈霉素的檢測(cè)限分別是2、5 ng/mL，樣品無需任何處理，整個(gè)過程僅需10 min[57]。Ferguson等建立了生物傳感免疫檢測(cè)法，測(cè)定了牛奶、蜂蜜、腎臟、肌肉等多種樣品中的鏈霉素/雙氫鏈霉素殘留，在上述樣品中的檢測(cè)限分別為30、15、50、70 μg/kg[58]。Verheijen等利用膠體金標(biāo)記單抗，建立了快速檢測(cè)牛奶中鏈霉素和雙氫鏈霉素殘留的方法，檢測(cè)限分為160、190 ng/mL[59]。

新型標(biāo)記物及新型分析方法也被引入進(jìn)來。Sun等引入鑭系元素標(biāo)記物Eu+，建立了時(shí)間分辨免疫分析方法檢測(cè)鏈霉素，在牛奶中的檢測(cè)限達(dá)1.8 ng/mL[60]。Mishra等將鏈霉素抗體固化在硫醇改性金石英晶體表面，建立了電化學(xué)石英晶體納米天平生物傳感器方法檢測(cè)，對(duì)牛奶樣品中的檢測(cè)限可達(dá)0.3 ng/mL[61]。Wutz等將待測(cè)物質(zhì)分子直接固化在玻片表面，采用競(jìng)爭性反應(yīng)模式，用CCD（charge coupled device）圖像傳感器記錄其化學(xué)發(fā)光值，該方法對(duì)鏈霉素的檢測(cè)限為15.9 ng/mL，并且通過陣列的方式，可以同時(shí)檢測(cè)4種抗生素[62]。Liu等將介孔二氧化硅、AuNPs、HRP以及鏈霉素組裝成多酶標(biāo)記物，在玻碳電極表面修飾一層膠體有機(jī)硅納米復(fù)合材料，建立了電化學(xué)分析方法檢測(cè)食品中的鏈霉素，檢測(cè)限為5 pg/mL，線性范圍為 0.05～50.00 ng/mL[63]。

4.2基于適配體的分析方法

利用適配體對(duì)納米金顆粒的保護(hù)作用，構(gòu)建的比色分析方法在鏈霉素檢測(cè)中報(bào)道較多。它的原理是當(dāng)沒有鏈霉素存在時(shí)，其適配體與AuNPs結(jié)合，在高鹽條件下，由于核酸的保護(hù)AuNPs不會(huì)發(fā)生聚沉;而當(dāng)有鏈霉素存在時(shí)，其適配體與鏈霉素結(jié)合，不能附著在AuNPs上，在高鹽條件下，AuNPs會(huì)發(fā)生聚沉，使得吸光度發(fā)生變化。Zhou等均基于此原理構(gòu)建了比色分析方法，檢測(cè)限分別為0.2 μmol/L、47.2 nmol/L、73.1 nmol/L[64-66]。

Zhao等利用AuNPs的擬酶催化活性建立了鏈霉素比色分析方法。沒有鏈霉素存在時(shí)，其適配體與AuNPs結(jié)合，阻礙了AuNPs的擬酶活性;而當(dāng)有鏈霉素存在時(shí)，其適配體與鏈霉素結(jié)合，不能附著在AuNPs上，使得AuNPs的擬酶活性得以體現(xiàn)，該方法對(duì)鏈霉素的檢測(cè)限為86 nmol/L，檢測(cè)線性范圍為0.1～0.5 μmol/L[67]。Emranj等采用鏈霉素適配體建立了熒光淬滅分析方法，首先合成一段與適配體互補(bǔ)的序列并標(biāo)記FAM（cDNA-FAM），當(dāng)鏈霉素存在時(shí)，適配體與鏈霉素結(jié)合，并吸附在AuNPs表面的FAM標(biāo)記的互補(bǔ)鏈上，熒光基團(tuán)被AuNPs所淬滅;反之，則出現(xiàn)熒光信號(hào)，這種方法的檢測(cè)限為47.6 nmol/L[66]。

同時(shí)基于適配體核酸的化學(xué)性質(zhì)，一系列利用核酸外切酶設(shè)計(jì)的分析方法被報(bào)道。Luan等先將AuNPs和鏈霉素適配體共同組裝在一種酶聚合物（Apt-Au-PV）上，在多空二氧化硅（SiO2）微球上修飾單鏈DNA結(jié)合蛋白（P-SiO2-SSB）。當(dāng)沒有鏈霉素時(shí)，Apt-Au-PV與P-SiO2-SSB結(jié)合，反應(yīng)液中沒有聚合酶釋放出來;當(dāng)鏈霉素存在時(shí)，鏈霉素與適配體結(jié)合，使得Apt-Au-PV與P-SiO2-SSB分離，并且在核酸外切酶ExoⅠ作用下，適配體被降解，鏈霉素被釋放出來，重新進(jìn)入循環(huán)，使得反應(yīng)液中聚合酶越來越多，起到信號(hào)放大的作用，該方法可以檢測(cè)低至1 pg/mL的鏈霉素[68]。Taghdisi等利用Exo Ⅲ和SYBR Gold構(gòu)建了一種無標(biāo)記的熒光分析方法檢測(cè)牛奶和血樣中的鏈霉素。在沒有鏈霉素時(shí)，適配體與其互補(bǔ)序列結(jié)合形成雙鏈，能夠被Exo Ⅲ所降解，不能與核酸染料SYBR Gold結(jié)合;當(dāng)有鏈霉素時(shí)，適配體與鏈霉素結(jié)合，與其互補(bǔ)序列解離形成單鏈，不能被Exo Ⅲ所降解，在加入SYBR Gold后會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，檢測(cè)限可達(dá) 54.5 nmol/L[69]。Wu等構(gòu)建了一種新型的“signal-on”熒光分析方法，結(jié)合有單鏈DNA結(jié)合蛋白的量子點(diǎn)作為熒光探針（QDs-SSB），沒有鏈霉素時(shí)，適配體與QDs-SSB結(jié)合誘發(fā)量子點(diǎn)聚集，導(dǎo)致量子點(diǎn)熒光的自淬滅;有鏈霉素存在時(shí)，鏈霉素與適配體結(jié)合，量子點(diǎn)被釋放出來產(chǎn)生熒光，同時(shí)引入核酸外切酶ExoⅠ，降解核酸，鏈霉素被釋放出來，重新進(jìn)入循環(huán)，熒光進(jìn)一步增強(qiáng)，放大信號(hào)，該方法最低可檢測(cè) 0.03 ng/mL 的鏈霉素[70]。Danesh等設(shè)計(jì)了一種新型的電化學(xué)傳感器，當(dāng)沒有鏈霉素時(shí)，適配體和它的互補(bǔ)序列部分結(jié)合形成弓形結(jié)構(gòu)，核酸外切酶Exo Ⅰ不能發(fā)揮作用，不能產(chǎn)生化學(xué)信號(hào);當(dāng)鏈霉素存在時(shí)，適配體與其結(jié)合，并與互補(bǔ)序列解離，Exo Ⅰ降解單鏈DNA的3′末端，并與氧化還原探針結(jié)合，優(yōu)化電信號(hào)，該方法的檢測(cè)限為11.4 nmol/L[71]。

5氨基糖苷類藥物多殘留快速分析方法

同時(shí)檢測(cè)多種藥物殘留可以提高檢測(cè)效率，縮短檢測(cè)周期，成為殘留分析的重要研究方向。要實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的同時(shí)檢測(cè)，一般采用2種策略：一是使用能同時(shí)識(shí)別多種靶物質(zhì)的識(shí)別分子;二是構(gòu)建多通道分析方法，實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)。

小分子物質(zhì)要獲得同時(shí)識(shí)別多種靶物質(zhì)的抗體，半抗原的設(shè)計(jì)直接決定了所得抗體的特性。以多種靶物質(zhì)的共同結(jié)構(gòu)作為半抗原，是較常采用的策略。從圖1可以看出，新霉胺含有2個(gè)六元環(huán)，它的空間構(gòu)象與卡那霉素以及慶大霉素部分結(jié)構(gòu)十分相似。Loomans等以新霉胺作為通用型半抗原，采用EDC法合成免疫原，獲得可通用型的多克隆抗體，能夠同時(shí)識(shí)別慶大霉素、新霉素和卡那霉素，在原奶中IC50分別為9、113、21 ng/mL[72]。王忠斌等以新霉胺作為半抗原，采用戊二醛法合成免疫原，制備出能夠識(shí)別多種氨基糖苷類藥物的通用型抗體，該多克隆抗體對(duì)新霉素、慶大霉素和卡那霉素的檢出限分別為0.20、0.15、0.35 mg/kg[73]。也有研究者嘗試用鏈霉素作為通用抗原，如楊建軍等采用EDC法將鏈霉素分別與牛血清白蛋白（BSA）、雞卵白蛋白（OVA）偶聯(lián)構(gòu)建完全抗原，通過雜交瘤細(xì)胞篩選，獲得了一株通用型的氨基苷類抗生素抗體PamiSP20-1，可以同時(shí)識(shí)別鏈霉素、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、大觀霉素，相關(guān)靈敏度并沒有給出[74]。Rowe等利用RNA適配體，建立了電化學(xué)分析方法檢測(cè)血液樣品中的卡那霉素、妥布霉素和慶大霉素，檢測(cè)范圍為4～10 g/mL[21]?？梢钥闯觯墨I(xiàn)所報(bào)道的通用型識(shí)別分子盡管能夠滿足MRL標(biāo)準(zhǔn)，但是相對(duì)于單一藥物檢測(cè)來說，靈敏度降低了很多，找尋新的半抗原結(jié)構(gòu)以獲得靈敏度較高的通用型抗體或是篩選出更高靈敏度的廣譜性適配體仍然需要繼續(xù)探索。

在獲得特異性識(shí)別分子的基礎(chǔ)上，將其整合在同一分析方法中，同樣可以實(shí)現(xiàn)多種靶物質(zhì)的同時(shí)分析。Haasnoot等將慶大霉素、新霉素、卡那霉素和雙氫鏈霉素通過氨基偶聯(lián)直接固化在芯片上，采用四通道傳感器Biacore 3000，實(shí)現(xiàn)同時(shí)檢測(cè)5種氨基糖苷類抗生素。在牛奶樣品中，慶大霉素、新霉素、卡那霉素、鏈霉素和雙氫鏈霉素的檢測(cè)限分別為 20、40、15、30、60 ng/mL[75]。Xue等以適配體序列為模板，首先設(shè)計(jì)與適配體部分互補(bǔ)的DNA1（cDNA1）序列，然后以cDNA1序列為模板，分別設(shè)計(jì)了與其3′端部分互補(bǔ)的捕獲探針（Cap-DNA）序列和與其5′端部分互補(bǔ)的DNA2（cDNA2）序列，并在cDNA2上標(biāo)記量子點(diǎn)。當(dāng)有靶物質(zhì)存在時(shí)，適配體優(yōu)先與靶物質(zhì)結(jié)合，cDNA1被釋放出來，隨后被金電極表面的 Cap-DNA 捕獲，再與標(biāo)記有量子點(diǎn)的cDNA2結(jié)合，產(chǎn)生電信號(hào);當(dāng)沒有靶物質(zhì)存在時(shí)，cDNA1沒有被釋放出來，隨后一系列反應(yīng)無法進(jìn)行，不能產(chǎn)生電信號(hào)。同時(shí)，采用多種不同的量子點(diǎn)（PbS、CdS、ZnS）進(jìn)行試驗(yàn)，該方法可以實(shí)現(xiàn)3種物質(zhì)同時(shí)檢測(cè)。優(yōu)化條件后，對(duì)鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素的檢測(cè)限分別為10、5、20 nmol/L[76]。徐飛等在凝膠檢測(cè)柱的2個(gè)檢測(cè)層中填充 CN-Br活化的Sephrose 4B凝膠-羊抗鼠IgG作為固相載體，然后分別結(jié)合卡那霉素和慶大霉素的單克隆抗體與載體結(jié)合，酶標(biāo)抗原和待測(cè)樣本中的物質(zhì)競(jìng)爭性抗體通過3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺（3，3′，5，5′-Tetramethylbenzidine）底物顯色實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間僅為15 min，對(duì)慶大霉素和卡那霉素的靈敏度為2.0 μg/L，對(duì)牛奶中的檢出限為 5 μg/L[23]。

6結(jié)論與展望

隨著生產(chǎn)和生活水平的提高，食品安全問題被提到了一個(gè)前所未有的重視程度，食品中的藥物殘留是影響食品安全的重要因素。鑒于藥物種類眾多，樣本數(shù)量龐大，基于特異性識(shí)別分子的快速檢測(cè)方法成為研究的熱點(diǎn)?；诳贵w的免疫分析方法為藥物殘留快速檢測(cè)提供了簡便、快速、靈敏的技術(shù)手段，已在藥物殘留篩選中應(yīng)用廣泛，而基于適配體的分析方法則可將分子生物學(xué)技術(shù)與分析方法巧妙結(jié)合，構(gòu)建出更多新型、超靈敏的檢測(cè)方法（表2）。

基于上述對(duì)AGs快速分析方法的總結(jié)和綜述發(fā)現(xiàn)：（1）由于傳統(tǒng)抗體獲得的局限性，適配體日益成為重要的生物識(shí)別分子;（2）利用適配體的理化性質(zhì)，結(jié)合新型納米材料以及電化學(xué)傳感器等平臺(tái)，設(shè)計(jì)并構(gòu)建多種新型的、高靈敏度分析方法，靈敏度甚至可達(dá)飛克（fg，10-15 g）水平;（3）AGs多殘留檢測(cè)方法靈敏度尚不理想，通過設(shè)計(jì)新的半抗原獲得高靈敏度的廣譜性抗體或適配體還有待進(jìn)一步研究，另外將高靈敏度的特異性識(shí)別分子組合在同一分析方法中，也是實(shí)現(xiàn)多殘留檢測(cè)的重要途徑。

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