農(nóng)桿菌介導的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系優(yōu)化

卜璐璐　趙凱　楊榮萍　羅興會　李清云　楊正安

摘要：以番茄自交系A(chǔ)C++和番茄母本材料1448的子葉為外植體，采用農(nóng)桿菌介導的方式接種于含有不同濃度玉米素（ZT）、吲哚-3-乙酸（IAA）和硝酸銀（AgNO3）的MS培養(yǎng)基上，以篩選適合番茄自交系A(chǔ)C++和1448的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果顯示，誘導愈傷組織及不定芽分化的最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO3;誘導生根的最適培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L IAA。

關(guān)鍵詞：番茄;農(nóng)桿菌介導;再生體系;遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號： S641.201文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0096-04

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）作為具備良好加工特性的蔬菜，其普及性廣，口感好，營養(yǎng)豐富，是植物口服疫苗的理想載體[1-2]。目前，利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)口服疫苗愈加受到重視[3-4]。番茄作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)可食性疫苗具有較好的應(yīng)用前景，因此選擇較好的番茄遺傳轉(zhuǎn)化材料和優(yōu)化番茄的遺傳轉(zhuǎn)化體系顯得極為重要。

影響番茄遺傳轉(zhuǎn)化的因素有很多，大量研究表明，目前已開發(fā)出比較成熟的番茄遺傳轉(zhuǎn)化體系。但是不同基因型的番茄品種在相同的轉(zhuǎn)化條件下，其轉(zhuǎn)化率差異較大[5]。在番茄遺傳轉(zhuǎn)化研究中應(yīng)用得比較多的番茄品種為中蔬4號。葛艷輝等的研究表明，使用中蔬4號作為番茄遺傳轉(zhuǎn)化研究的品種，其轉(zhuǎn)化率可以高達51.40%，而在相同的體系下，T03的轉(zhuǎn)化率僅為28.17%[6-8]。以上研究結(jié)果表明，對于不同基因型的番茄，其最適的遺傳轉(zhuǎn)化體系不同，因此需要對不同基因型的番茄篩選出其最適合的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

本試驗采用轉(zhuǎn)化效率比較高的番茄自交系A(chǔ)C++和1448作為遺傳轉(zhuǎn)化材料，通過農(nóng)桿菌介導的方式，采用正交試驗設(shè)計，篩選出適合這2個品種的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系，并確定2種番茄材料中的最佳轉(zhuǎn)化材料，為后續(xù)利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)番茄口服疫苗提供試驗材料并奠定試驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試番茄材料為番茄自交系A(chǔ)C++和筆者所在實驗室保存的母本材料1448，分別由西南大學園藝園林學院和云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院提供。

試驗所用菌種（含有IGF-1基因的pCAMBIA2301-IGF-1載體）由筆者所在實驗室保存。

1.2 試驗時間和地點

本試驗于2017年6月至2017年12月進行，整個試驗過程均在云南農(nóng)業(yè)大學園林園藝學院蔬菜分子生物學實驗室完成。

1.3 試驗方法

1.3.1 無菌苗的獲取 挑選飽滿的番茄種子，加入洗潔精進行搓洗（盡量去除其表面抑制種子發(fā)芽的物質(zhì)和種子表面的小茸毛），將種子清洗干凈。在超凈工作臺上完成以下操作。（1）種子的消毒處理。首先用75%乙醇消毒30 s，然后快速用無菌水清洗3次，之后加入飽和磷酸鈉溶液消毒20 min，再用無菌水清洗種子3次，其間不斷攪拌;加入有效濃度為2%的次氯酸鈉消毒10 min，其間稍作搖晃，用無菌水清洗5～7次，每次洗2 min。（2）種子消毒后的處理。將消毒的種子用無菌吸水紙吸干水分，然后將種子接種在1/2MS培養(yǎng)基中，每瓶接5～6粒種子。將培養(yǎng)基置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光—暗周期為16 h—8 h，光—暗溫度周期為26 ℃—18 ℃，光照度為1 500～2 000 lx，培養(yǎng)10～15 d左右獲得無菌番茄植株。

1.3.2 農(nóng)桿菌浸染番茄葉片 （1）選取培養(yǎng)7 d的番茄葉片，切成大小約為0.5 cm×0.5 cm的小塊，將葉片塊接種于如表1所示篩選好的固體培養(yǎng)基中，在黑暗條件下預培養(yǎng) 24～36 h。（2）將含有載體的農(nóng)桿菌接種于含有500 μg/L鏈霉素（Sm）、50 μg/L利福平（Rif）、50 mg/L卡那霉素（Kan）的液態(tài)酵母甘露醇培養(yǎng)基（YEB）中，28 ℃黑暗培養(yǎng)2 d。（3）取500 μL復壯后的農(nóng)桿菌加入液體YEB培養(yǎng)基（含有 500 μg/L Sm，50 μg/L Rif，50 mg/L Kan）中，過夜培養(yǎng)16 h，至D600 nm為0.5左右。（4）在室溫條件下于6 000 r/min離心10 min，用等體積的YEB重懸菌體;在室溫條件下于 4 000 r/min 離心10 min，棄上清，收集農(nóng)桿菌，用50 μL MS液體培養(yǎng)基重懸，作為浸染液。（5）將預培養(yǎng)的外植體浸泡在重懸的浸染液中10 min，其間振蕩，之后用濾紙吸去葉片上多余的菌液，放回原固體培養(yǎng)基內(nèi)進行共培養(yǎng)。每個處理接種10瓶，每個處理重復3次，每瓶接種6個葉片塊。（6）共培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的抗性培養(yǎng)基上，于光—暗周期為16 h（26 ℃）—8 h（18 ℃）的光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2周更換1次培養(yǎng)基，直到愈傷組織生成。

1.3.3 誘導愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基篩選 本試驗采用3因素3水平，對番茄外植體葉片誘導愈傷組織和不定芽的培養(yǎng)基進行L9（34）正交設(shè)計，以確定誘導愈傷組織和芽分化的最佳激素組合。具體試驗設(shè)計組合見表1。

本試驗以愈傷組織形成率（即出愈率，%）和不定芽分化率（%）來評價外植體的再生能力。接種21 d后統(tǒng)計愈傷組織數(shù)及形成率，42 d后統(tǒng)計出芽數(shù)及不定芽分化率，從而篩選出最適的誘導愈傷組織的培養(yǎng)基激素濃度。

愈傷組織形成率=形成愈傷組織的外植體數(shù)/接種的總外植體數(shù)×100%;

不定芽分化率=分化的不定芽數(shù)/接種的總外植體 數(shù)×100%。

1.3.4 不同培養(yǎng)基配方誘導番茄生根的試驗 當不定芽長至3～4 cm左右時，切取生長健壯的不定芽，分別插入含有0.2、0.3、0.4 mg/L IAA的MS生根培養(yǎng)基中，每個處理接種15株，誘導生根。1周后統(tǒng)計不同處理的生根數(shù)及生根率，并篩選出最適培養(yǎng)基。

生根率=生根的不定芽數(shù)/接種的總不定芽數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄自交系A(chǔ)C++的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果及分析

2.1.1 番茄自交系A(chǔ)C++的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果 番茄葉片經(jīng)過培養(yǎng)后，所有處理組合均有愈傷組織及再生芽生成，且不同處理組合形成愈傷組織和再生芽的情況不同。由表2可見，葉片的出愈率在23.68%～97.67%之間，以處理7組合的出愈率最高;芽的平均分化率在5.56%～86.05%之間，以處理1組合的芽平均分化率最低，而處理7組合的芽平均分化率最高。因此，以處理7組合作為誘導愈傷組織和芽分化的最佳處理組合，具體培養(yǎng)基配比為MS+3 mg/L AgNO3+0.5 mg/L IAA+2.00 mg/L ZT。

2.1.2 不同激素濃度對番茄自交系A(chǔ)C++生根的影響 挑選分化效果較好的番茄苗轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基中，用不同濃度的IAA對分化芽進行處理，隨時觀察其生根動態(tài)。試驗結(jié)果表明，接種約4～5 d便可見根從小苗基部分化出來，10 d左右瓶中的小苗長出1～2 cm的白色須根。

通過實際的試驗觀察和表3的結(jié)果可以看出，番茄苗生根較為容易，一般1/2MS培養(yǎng)基都能獲得很好的效果，但是根較細長，長出的植株較弱。對同一時期的生根情況進行比較可知，1/2MS+0.3 mg/L IAA誘導生根的生根率最高，達到100.00%，并且每個不定芽發(fā)生的不定根數(shù)量較多，根系粗壯，適于后期移栽工作。因此，選用1/2MS+0.3 mg/L IAA作為最佳生根培養(yǎng)基。

2.1.3 番茄自交系A(chǔ)C++的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果分析 由表4可以看出，平均出愈外植體數(shù)以處理7最高，達到42個，經(jīng)計算，其出愈率達到97.67%;進一步分析表明，處理7與處理5、6、8之間的出愈外植體數(shù)差異相對不明顯。

由表5可以看出，AC++番茄外植體的芽分化結(jié)果表現(xiàn)為處理7的分化出芽外植體數(shù)最多，平均為37個， 經(jīng)計算芽分化率為86.05%;處理7與其他處理間差異明顯，處理6與處理7、5之間的芽分化結(jié)果差異明顯。

2.2 番茄母本材料1448的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果及分析

2.2.1 1448番茄的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果 由表6可見，對番茄母本材料1448的外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化后，所有處理組合均有愈傷組織產(chǎn)生，不同處理組合的出愈情況不同，其中以處理7的外植體出愈數(shù)最多，為32個，其出愈率為73.08%，出愈率最低的為處理1，僅為14.29%。1448番茄材料的芽分化率最高可達69.23%，其最適的芽分化與愈傷誘導培養(yǎng)基組合為MS+3 mg/L AgNO3+0.5 mg/L IAA+2.00 mg/L ZT。

2.2.2 不同激素濃度對番茄母本材料1448生根的影響 挑選分化效果較好的番茄苗，轉(zhuǎn)入含有不同IAA濃度的生根培養(yǎng)基中，通過試驗觀察和表7的結(jié)果可以看出，番茄苗生根較為容易，不添加激素的1/2MS培養(yǎng)基也可生根，但是根較細。對同一時期進行比較可知，用1/2MS+0.3 mg/L IAA培養(yǎng)基誘導生根，其生根率最高，根系粗壯，生根率達到100.00%。因此，以1/2MS+0.3 mg/L IAA作為最佳生根培養(yǎng)基。

2.2.3 番茄母本材料1448的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果分析 對番茄母本材料1448外植體在不同處理下的出愈結(jié)果進行分析，表8結(jié)果顯示，出愈效果最好的為處理7，與其他處理之間的差異明顯，處理3和處理4間的出愈外植體數(shù)差異明顯。

如表9所示，出愈數(shù)最高的處理組合7，其分化出芽外植體數(shù)也最多。處理7與其他處理組合之間的芽分化數(shù)差異明顯，此外，處理4、9和處理1、2、3之間差異明顯。

2.3 不同基因型番茄材料遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果的對比

由圖1、圖2可以看出，2個基因型番茄材料的出愈率、芽分化率最高的均為處理7，對于AC++番茄材料，最優(yōu)處理組合的出愈率為96.92%，芽分化率為86.15%。對于1448材料，最優(yōu)處理組合的出愈率和芽分化率明顯低于AC++材料。由圖1、圖2還可以看出，在使用處理組合4誘導愈傷組織以及誘導芽分化時，1448材料的出愈率和芽分化率要高于AC++，但是處理4不是2個材料中的最優(yōu)處理組合。綜合對2個基因型番茄材料的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果的對比得出，番茄自交系A(chǔ)C++為最佳遺傳轉(zhuǎn)化材料。

3 討論

3.1 不同基因型番茄材料對植株再生效率的影響

由本研究結(jié)果得出，植物的基因型不同，對培養(yǎng)條件的反應(yīng)不同，植物的再生效率（即出愈數(shù)）具有顯著差異。本試驗得出的結(jié)論與前人的研究結(jié)果一致。孫靖棣等選用5種不同基因型的番茄材料進行再生體系調(diào)控研究，結(jié)果表明，不同基因型番茄的再生體系受不同激素配比的調(diào)控差異顯著[9]。裴華麗等以特大瑞光、菜都982F1和菜都六號3種番茄為試驗材料進行的研究結(jié)果表明，3種材料的分化率差異較大[10]。韋鵬霄等選用4種番茄材料進行誘導花藥愈傷組織試驗，結(jié)果得出，不同基因型番茄花藥對激素的敏感性不同[11]。

本試驗結(jié)果表明，番茄自交系A(chǔ)C++的平均分化率最高可達到86.15%，比他人研究得出的其他品種的分化效率高。比如常用的番茄遺傳轉(zhuǎn)化材料中蔬4號，陳珍等篩選得出該基因型的遺傳體系轉(zhuǎn)化效率僅為51.4%[7]。

3.2 不同激素處理組合對外植體愈傷組織和再生芽形成以及根生長的影響

番茄外植體分化愈傷組織和芽的能力取決于培養(yǎng)基中細胞分裂素和生長素的種類和濃度比例。番茄組培中常用的細胞分裂素為6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和ZT，而張艷芳等的研究則以6-BA和IAA 2種激素進行搭配組合，篩選毛粉802的最佳培養(yǎng)體系，結(jié)果顯示，2種激素的作用相同，但不同基因型的番茄應(yīng)該選擇其最適合的激素[12-13]。本試驗采用ZT結(jié)合IAA、AgNO3進行激素配比，篩選出適合誘導愈傷組織和再生芽的體系為MS+2.00 mg/L ZT+0.5 mg/L IAA+3 mg/L AgNO3，培養(yǎng)基中添加的IAA濃度要比前人所用的濃度高。例如，王傲雪等以宇番一號和0949-46為試驗材料，篩選出誘導子葉出芽的最佳激素組合中的IAA濃度為 0.2 mg/L[14]。這種情況可能是由不同基因型的番茄的內(nèi)源激素差異所造成的。

植物根系生長的強弱直接關(guān)系到植株的生長狀況[15]。本研究中誘導生根的最適宜培養(yǎng)基為1/2 MS+0.3 mg/L IAA。研究表明，不添加激素的培養(yǎng)基也可以生根，但其根系生長較弱。陳火英等用不同濃度的α-萘乙酸（NAA）、IAA、吲哚丁酸（IBA）、二氯苯氧乙酸（2，4-D）進行生根培養(yǎng)試驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，番茄的內(nèi)源生長素濃度較高，添加生長素對不定芽發(fā)根有一定的作用，若不添加生長素也極易發(fā)根[16]。

本試驗對2個番茄品種的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系進行了篩選，分別得到最佳的遺傳轉(zhuǎn)化體系，并對2個材料的遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果進行了對比，得出番茄自交系A(chǔ)C++材料的轉(zhuǎn)化效率要比1448材料的高。研究結(jié)果為后續(xù)研究口服疫苗提供了試驗材料，并奠定了試驗基礎(chǔ)。

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