H5、H7、H9亞型禽流感病毒三重RT-PCR檢測方法的建立

趙冬敏　吳青　趙翰飛　劉青濤　楊婧　黃欣梅　劉宇卓　韓凱凱　畢可然　李銀

摘要：根據(jù)GenBank中H5、H7、H9亞型禽流感病毒血凝素蛋白（HA）編碼基因，使用DNAStar軟件比較分析篩選出特異的保守片段，設(shè)計(jì)3對引物H5-P1/H5-P2、H7-P3/P4和H9-P5/P6。在此基礎(chǔ)上，建立了H5、H7、H9亞型禽流感的三重RT-PCR檢測方法，本方法可同時(shí)檢測出樣品中的H5、H7、H9亞型禽流感病毒。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法檢測H5、H7、H9亞型禽流感RNA的敏感性分別達(dá)2.80、10.50、5.73 pg/μL，該方法檢測其他相關(guān)病毒時(shí)均為陰性，具有很高的特異性，此外，該方法具有良好的重復(fù)性。利用所建立方法對240份禽流感臨床樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果與血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果的符合率為100%。此診斷方法檢出時(shí)間早，且特異、敏感、經(jīng)濟(jì)、快速，可普遍推廣，在禽流感診斷和防制中具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒;H5亞型;H7亞型;H9亞型;三重RT-PCR

中圖分類號：S852.65+7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）09-0204-03

禽流行性感冒（avian influenza virus，AIV）是由正黏病毒科A型流感病毒引起的禽類烈性傳染病，其易感動物包括雞、鴨、火雞、鵪鶉等家禽及野鳥、水禽、海鳥等野禽，且對人類和低等哺乳動物也能引起嚴(yán)重的疾病，包括高致病性毒株引起的急性致死性疫病以及低致病毒株引起的產(chǎn)蛋下降、輕度呼吸道疾病等多種疾病[1]。禽流感病毒亞型較多，毒株變異較大，給本病的防治帶來極大困難。國際獸醫(yī)局（OIE）規(guī)定該病為A類傳染病。我國也將此病列為一類動物疫病。

研究發(fā)現(xiàn)H5、H7、H9是禽流感病毒中具有較強(qiáng)致病性的3種亞型，其中H5N1禽流感病毒對禽類的致死率通?？梢赃_(dá)到100%[2-3]。1997年，香港首次報(bào)道發(fā)生18例人感染H5N1禽流感病毒，其中6人死亡，引起了全球衛(wèi)生界的廣泛關(guān)注[4]，證實(shí)了AIV可直接對人類造成威脅。2013年3月，我國上海、安徽等地發(fā)現(xiàn)人感染H7N9型禽流感，共造成136人感染，其中37人死亡，是全球首次發(fā)現(xiàn)的新亞型流感病毒[5]。自1994年首次報(bào)道雞群分離到H9N2亞型禽流感病毒以來[6]，H9亞型低致病性禽流感病毒廣泛存在于我國[7]。低致病性的H9N2亞型禽流感病毒雖然不引起感染禽類的大量死亡，但是可導(dǎo)致感染禽產(chǎn)蛋下降和免疫抑制，與其他病原共感染時(shí)常導(dǎo)致高死亡率，給我國養(yǎng)禽業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[8-9]。1999年H9N2亞型禽流感在內(nèi)地和香港感染人事件的發(fā)生，更突出體現(xiàn)了禽流感預(yù)防治療的公共衛(wèi)生意義[10]。因此，快速、及時(shí)、準(zhǔn)確地檢測出禽流感對保障國民的生命財(cái)產(chǎn)安全具有重要意義。

RT-PCR作為一種現(xiàn)代分子生物學(xué)基因診斷技術(shù)，具有高度敏感性和特異性，并可極大縮短禽流感病毒的檢出時(shí)間，能在數(shù)小時(shí)內(nèi)檢出痕量病原，可克服傳統(tǒng)的AIV診斷技術(shù)包括病毒分離鑒定試驗(yàn)周期長的缺點(diǎn)，為AIV早期快速診斷提供了敏感、快速、實(shí)用的方法。本試驗(yàn)針對我國養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒亞型H5、H7和H9，建立了H5、H7、H9的三重RT-PCR，快速診斷禽流感，進(jìn)行禽流感早期診斷，疫情預(yù)測，為禽流感的防治提供有效的早期診斷技術(shù)和監(jiān)測手段，同時(shí)也為高致病性禽流感防治爭取寶貴的快速反應(yīng)時(shí)間。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

H9亞型禽流感病毒由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離鑒定及序列測定。H5亞型禽流感病毒RNA及陽性血清、H7亞型禽流感病毒RNA及陽性血清均由美國密西西比州立大學(xué)萬秀峰教授惠贈。鴨坦布蘇病毒（duck tembusu virus，DTMUV），雞傳染性喉氣管炎病毒（avian infectious laryngotracheitis virus，ILTV），雞傳染性支氣管炎病毒（avian infectious bronchitis virus，IBV），減蛋綜合征病毒（egg drop syndrome virus，EDS-76）、H9亞型禽流感病毒陽性血清均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試劑

液體病毒RNA/DNA抽提試劑盒，購自Axygen生物科技有限公司;5×AMV反轉(zhuǎn)錄緩沖液、High Pure dNTPs（10 mmol/L）、Rnase Inhibitor（40 U/μL）、反轉(zhuǎn)錄酶AMV、dNTPs（2.5 mmol/L）、Mg2+（25 mmol/L）、Ex Taq反應(yīng)緩沖液（10×）、Ex Taq酶，均購自TaKaRa公司;反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.3 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank已發(fā)表的H5、H7和H9亞型禽流感病毒基因序列，分析HA基因保守區(qū)，應(yīng)用DNASTAR軟件設(shè)計(jì)3對特異性引物（表1），由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.4 樣品的準(zhǔn)備

按照試劑盒說明書提取H9亞型禽流感病毒、DTMUV、IBV的總RNA。反轉(zhuǎn)錄體系：5×AMV反轉(zhuǎn)錄緩沖液4.0 μL，反轉(zhuǎn)錄隨機(jī)引物（9 mer）1.0 μL，dNTP（10 mmol/L）2.0 μL，Ribonuclease Inhibitor 0.5 μL，AMV反轉(zhuǎn)錄酶1.0 μL，模板RNA 11.5 μL。按如下條件將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA：42 ℃ 反應(yīng)1 h，95 ℃反應(yīng)5 min。將H5、H7亞型禽流感病毒RNA按上述反應(yīng)體系和條件反轉(zhuǎn)錄成cDNA。參照試劑盒說明書，提取EDS-76、ILTV的DNA，保存于-20 ℃，備用。

1.5 單引物單模板驗(yàn)證

分別以H5、H7、H9亞型禽流感病毒cDNA為模板，進(jìn)行單引物單模板PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系如下：總體系為25.00 μL，其中雙蒸水15.25 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.00 μL，上、下游引物（50 μmol/L）各0.50 μL，模板cDNA 2.00 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán);然后72 ℃延伸10 min。循環(huán)反應(yīng)結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 H5、H7、H9亞型禽流感病毒三重 RT-PCR檢測方法的建立

經(jīng)過對引物比例、引物濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等因素的反復(fù)優(yōu)化，確定了H5、H7、H9亞型禽流感病毒多重PCR基本的反應(yīng)體系為：雙蒸水13.25 μL，10×PCR Buffer 2.50 μL，25 mmol/L MgCl2 2.00 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2.00 μL，H5-P1（50 mmol/L）0.50 μL，H5-P2（50 μmol/L）0.50 μL，H7-P3（50 μmol/L）0.50 μL，H7-P4（50 μmol/L）0.50 μL，H9-P5（50 μmol/L）0.50 μL，H9-P6（50 μmol/L）0.50 μL，混合病原cDNA 2.00 μL，Ex Taq（5 U/μL）0.25 μL。按照“1.5”節(jié)中所述PCR程序進(jìn)行反應(yīng)，循環(huán)結(jié)束后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.7 敏感性試驗(yàn)

測定H5、H7、H9亞型禽流感病毒RNA濃度。在此基礎(chǔ)上，分別進(jìn)行10倍梯度稀釋，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，進(jìn)行三重RT-PCR方法檢測，確定該方法的敏感性。

1.8 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的三重RT-PCR檢測方法，對3份禽流感病毒陽性樣品重復(fù)檢測3次，以驗(yàn)證本方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.9 特異性試驗(yàn)

取DTMUV、ILTV、IBV和EDS-76，分別提取RNA或DNA，采用三重RT-PCR進(jìn)行擴(kuò)增，確定本方法檢測的特異性。

1.10 三重RT-PCR方法對臨床樣品的檢測

采集江蘇地區(qū)活禽市場中雞、鴨、鵝的泄殖腔拭子和喉拭子240份，置于添加四抗的無菌PBS緩沖液中，凍融3次后，尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，棄去24 h內(nèi)死亡雞胚，于接種后120 h收集雞胚尿囊液，分別進(jìn)行三重RT-PCR檢測、血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單引物單模板驗(yàn)證

將H5、H7和H9亞型禽流感病毒RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，采用單引物單模板進(jìn)行PCR，結(jié)果顯示，H5、H7、H9亞型禽流感病毒特異性檢測引物的目的基因大小分別為427、501、673 bp，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)相符（圖1）。

[FK（W9][TPZDM1.tif]

2.2 H5、H7、H9亞型禽流感病毒三重RT-PCR方法的建立

以H5、H7和H9亞型禽流感病毒混合cDNA為模板，同時(shí)采用3對引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，經(jīng)過對引物比例、引物濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度等因素的反復(fù)優(yōu)化，電泳結(jié)果顯示，H5、H7和H9亞型混合模板擴(kuò)增出預(yù)期大小的特異性條帶（圖2）。

2.3 敏感性試驗(yàn)

禽流感病毒核酸初始質(zhì)量濃度的測定結(jié)果為：H5亞型模板的質(zhì)量濃度為28.0 ng/μL，H7亞型模板的質(zhì)量濃度為105.3 ng/μL，H9亞型模板的質(zhì)量濃度為57.3 ng/μL。將其進(jìn)行101～105稀釋后進(jìn)行三重RT-PCR擴(kuò)增。檢測結(jié)果表明，該方法能檢測出稀釋度為104的H5、H7和H9亞型AIV（圖3）。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn)

用建立的三重RT-PCR檢測方法，對3份禽流感樣品重復(fù)檢測3次，結(jié)果均出現(xiàn)相同的檢測結(jié)果，表明所建立的方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性（圖4）。

2.5 特異性試驗(yàn)

采用所建立的三重RT-PCR方法對幾種禽主要疫病病毒進(jìn)行檢測，結(jié)果對坦布蘇病毒、雞傳染性喉氣管炎病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、減蛋綜合征病毒進(jìn)行RT-PCR均未出現(xiàn)特異擴(kuò)增條帶，說明該檢測方法特異性好（圖5）。

2.6 三重RT-PCR方法對臨床樣品的檢測

采集江蘇地區(qū)活禽市場中雞、鴨、鵝的泄殖腔拭子和喉拭子240份，接種9～11日齡SPF雞胚后收集雞胚尿囊液，利用禽流感三重RT-PCR方法進(jìn)行檢測，結(jié)果檢測到H5亞型禽流感病毒5份、H9亞型禽流感病毒6份，H9和H7亞型混合感染1份。所檢測結(jié)果與血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果完全符合，證明該方法可用于臨床檢測（圖6）。

3 結(jié)論與討論

禽流感病毒可引起禽類全身性或呼吸器官性傳染病。至今A型禽流感病毒的血凝素已發(fā)現(xiàn)16種，神經(jīng)氨酸酶10種，其血清型較多，易變異[11]。病毒主要通過病禽的排泄物、分泌物和尸體等污染飲水和飼料，經(jīng)消化道或傷口傳染[12]。早期快速診斷和血清學(xué)監(jiān)測是預(yù)防、控制禽流感的前提條件。由于感染禽種類、年齡、性別、所處環(huán)境以及感染并發(fā)癥的不同，表現(xiàn)的臨床癥狀差異極大，因此，該病主要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。

目前，禽流感的診斷技術(shù)主要有病毒分離鑒定、免疫熒光、RT-PCR、血凝抑制、瓊脂擴(kuò)散、ELISA等，其中病毒分離鑒定和RT-PCR具有很高的敏感性和特異性[13]。但由于病毒分離鑒定操作繁瑣、耗時(shí)較長，因此，RT-PCR技術(shù)仍然是當(dāng)前診斷禽流感的主要方法。多重PCR是在以單基因PCR為基礎(chǔ)上進(jìn)行的發(fā)展和完善，是在同一PCR體系中加入多對特異性引物，一次同時(shí)擴(kuò)增多個(gè)靶基因，實(shí)現(xiàn)了多基因型的鑒別和多種病原體的同時(shí)檢出，使混合感染的診斷和基因分型變得更加簡捷，減少了漏診率，提高了檢驗(yàn)效率。張文慧等建立了同時(shí)檢測H5和H7亞型禽流感病毒的多重RT-PCR方法[14];陳思懷等針對NP（型診斷）、HA（亞型診斷）基因設(shè)計(jì)2對引物，從而對H5、H6、H9亞型AIV做快速檢測[15]。馬鳴瀟等針對H5和H9這2個(gè)亞型，各設(shè)計(jì)1套特異性的引物，建立了RT-PCR一步法，用于H5和H9亞型的鑒別[16]。

本研究針對我國養(yǎng)禽業(yè)的主要病毒亞型H5、H7和H9，設(shè)計(jì)3對特異性檢測引物，通過條件優(yōu)化，建立了同時(shí)檢測H5、H7、H9亞型禽流感的三重RT-PCR方法。該方法可同時(shí)檢測H5、H7和H9亞型禽流感病毒，檢測靈敏度分別達(dá) 2.80、10.50、5.73 pg/μL，方法特異性好、重復(fù)性高，可用于快速診斷禽流感，進(jìn)行禽流感早期預(yù)測。本方法的建立可為禽流感防治提供有效的早期診斷技術(shù)和監(jiān)測手段，同時(shí)也為高致病性禽流感防治爭取了寶貴的快速反應(yīng)時(shí)間。

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