Etest方法與微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌屬對(duì)唑類(lèi)抗真菌藥物的敏感性評(píng)價(jià)*

張 麗，王 賀，肖 盟，徐英春

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100730；2.侵襲性真菌病機(jī)制研究與精準(zhǔn)診斷北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100730)

近年來(lái)念珠菌感染的發(fā)病率逐漸增加，成為引起院內(nèi)感染的重要致病菌[1-2]。唑類(lèi)藥物是用于治療念珠菌感染常用藥物，但隨著臨床抗真菌藥物的廣泛使用，開(kāi)始出現(xiàn)耐藥菌株，因此及時(shí)準(zhǔn)確的體外藥物敏感性檢測(cè)對(duì)于指導(dǎo)臨床抗真菌治療具有重要的意義[3-4]。美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(clinical and laboratory standards institute，CLSI)推薦的微量肉湯稀釋法(broth microdilution method，BMD)為金標(biāo)準(zhǔn)，但操作繁瑣，耗時(shí)耗力，限制了其在臨床中的應(yīng)用[5]。Etest藥敏試驗(yàn)方法是改良的瓊脂擴(kuò)散法，又稱(chēng)為濃度梯度法，是使用預(yù)先制備的含梯度抗生素藥物濃度的試紙條，貼在已涂布真菌的平板后，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間孵育，根據(jù)抑菌環(huán)大小可以讀出相應(yīng)藥物的最小抑菌濃度(minimal inhibit concentration，MIC)值。目前國(guó)內(nèi)針對(duì)唑類(lèi)藥物Etest藥敏方法評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)較少，因此本試驗(yàn)將以微量肉湯稀釋法作為標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)價(jià)研究Etest法檢測(cè)常見(jiàn)念珠菌氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑的準(zhǔn)確性。

1材料與方法

1.1 菌株來(lái)源 測(cè)試5種念珠菌均來(lái)源于侵襲性真菌耐藥監(jiān)測(cè)網(wǎng)(CHIF-NET)，其中白念珠菌80株，熱帶念珠菌40株，光滑念珠菌40株，近平滑念珠菌40株和克柔念珠菌20株。質(zhì)控菌株包括ATCC22019近平滑念珠菌，ATCC90028白念珠菌和ATCC6528克柔念珠菌。

1.3 方法

1.3.1 微量肉湯稀釋法：微量肉湯稀釋法操作嚴(yán)格按CLSI M27文件操作[5]。抗真菌藥物檢測(cè)濃度范圍：氟康唑0.125～64 μg/ml，伏立康唑0.03～16 μg/ml，伊曲康唑0.03～16 μg/ml。35°C孵育24 h后讀取藥敏結(jié)果。

1.3.2 Etest方法：檢測(cè)方法主要參考廠家說(shuō)明。用生理鹽水制成0.5 MCF濃度的菌懸液；用無(wú)菌拭子沾菌液后擠干，輕輕在RPM1640瓊脂表面均勻密涂；將Etest條貼在瓊脂表面；35°C孵育24 h后讀取藥敏結(jié)果。抗真菌藥物檢測(cè)濃度范圍：氟康唑0.016～256 μg/ml，伏立康唑0.002～32 μg/ml，伊曲康唑0.002～32 μg/ml。

1.3.3 藥敏結(jié)果判定：根據(jù)CLSI M60[6]對(duì)氟康唑和伏立康唑的敏感性進(jìn)行判定。對(duì)于白念珠菌、熱帶念珠菌和近平滑念珠菌，氟康唑：敏感(susceptible，S)≤2 μg/ml；劑量依賴(lài)性敏感(susceptible-dose dependent，SDD)4 μg/ml；耐藥(resistant，R)≥8 μg/ml；伏立康唑：S≤0.12 μg/ml；中介(intermediate，I)0.25～0.5 μg/ml；R≥1 μg/ml。光滑念珠菌，氟康唑：SDD≤32 μg/ml，R≥64 μg/ml；伏立康唑無(wú)折點(diǎn)?？巳崮钪榫瑹o(wú)氟康唑折點(diǎn)；伏立康唑：S≤0.5 μg/ml，I 1 μg/ml，R≥2 μg/ml。

CLSI M60[6]未規(guī)定伊曲康唑的臨床折點(diǎn)，本研究參考CLSI M59[7]文件中伊曲康唑的流行病學(xué)折點(diǎn)(epidemiological cutoff value，ECV)對(duì)菌株界定為野生株(wide-type，WT)或非野生株(non-wide-type，NWT)。光滑念珠菌、克柔念珠菌和熱帶念珠菌的伊曲康唑ECV分別為4，1和0.5 μg/ml。

1.3.4 結(jié)果比較：分別統(tǒng)計(jì)兩種方法的基本一致率(essential agreement，EA)和分類(lèi)一致率(categorical agreement，CA)。EA指的是Etest方法和微量肉湯稀釋法的MIC值相差在2個(gè)梯度以?xún)?nèi)。CA指的是Etest方法和微量肉湯稀釋法的判定結(jié)果一致(均為敏感、中介或耐藥)的菌株占總測(cè)定株數(shù)的比率。顯著錯(cuò)誤(very major error，VME)，即微量肉湯稀釋法為耐藥，Etest方法測(cè)試為敏感；大錯(cuò)誤(major error，ME)，即微量肉湯稀釋法為敏感，Etest方法測(cè)試為耐藥；小錯(cuò)誤(minor error，MiE)，即其中一種方法為中介(I)或劑量依賴(lài)性敏感(SDD)，另外一種方法測(cè)試結(jié)果為敏感(S)或耐藥(R)。

2結(jié)果

2.1 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類(lèi)藥物敏感性的基本一致率(EA) 見(jiàn)表1。

表1 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類(lèi)藥物敏感性的基本一致率(EA)

注：BMD，微量肉湯稀釋法；EA，基本一致率。

分別計(jì)算兩種檢測(cè)方法的氟康唑、伏立康唑和伊曲康唑MIC50和MIC90，除伊曲康唑MIC90相差大于1個(gè)梯度，其余唑類(lèi)藥物MIC50與MIC90相差均在1個(gè)梯度內(nèi)。對(duì)于氟康唑有7株菌兩種方法MIC值相差2個(gè)梯度以上，其中5株近平滑念珠菌的Etest結(jié)果低于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上。對(duì)于伏立康唑有6株菌兩種方法MIC值相差2個(gè)梯度以上，其中4株白念珠菌Etest結(jié)果低于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上。對(duì)于伊曲康唑有40株菌兩種方法MIC值相差2個(gè)梯度以上，其中13株熱帶念珠菌和11株近平滑念珠菌Etest結(jié)果低于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上，9株光滑念珠菌Etest結(jié)果高于微量肉湯稀釋法2個(gè)梯度以上。

2.2 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類(lèi)藥物敏感性的分類(lèi)一致率(CA) 見(jiàn)表2。對(duì)于氟康唑，白念珠菌、熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌中兩種檢測(cè)方法的CA一致率均超過(guò)90%，Etest檢測(cè)錯(cuò)誤類(lèi)型均為小錯(cuò)誤。對(duì)于伏立康唑，白念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌中兩種檢測(cè)方法的CA一致率均大于95%，無(wú)顯著錯(cuò)誤和大錯(cuò)誤；而熱帶念珠菌兩種方法CA一致率低于90%，其中3株中介株Etest檢測(cè)為敏感，4株耐藥株Etest檢測(cè)為中介。對(duì)于伊曲康唑基于ECV評(píng)價(jià)兩種檢測(cè)方法一致率，光滑念珠菌一致率僅為70%，有12株光滑念珠菌野生株Etest檢測(cè)為非野生株。

表2 Etest方法和微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類(lèi)藥物敏感性的分類(lèi)一致率(CA)

注：BMD.微量肉湯稀釋法；S.敏感；SDD.劑量依賴(lài)敏感；I.中介；WT.野生型；NWT.非野生型；CA.分類(lèi)一致率；VME.顯著錯(cuò)誤；MER.大錯(cuò)誤；MiE.錯(cuò)誤。

3討論目前真菌體外藥物敏感性試驗(yàn)常用方法包括微量肉湯稀釋法，ATB Fungus 3，Sensititre YeastOne藥敏板、CLSI紙片擴(kuò)散法、丹麥ROSCO紙片擴(kuò)散法和Etest方法。CLSI微量肉湯稀釋法是目前認(rèn)可的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但是操作比較復(fù)雜，耗時(shí)耗力，結(jié)果不易判讀[5]。ATB Fungus 3和Sensititre YeastOne藥敏板為商品化改良微量肉湯稀釋法。CLSI紙片擴(kuò)散法和丹麥ROSCO紙片擴(kuò)散法，紙片不同但檢測(cè)原理相似，即通過(guò)藥敏紙片抑菌環(huán)直徑大小判斷菌株對(duì)不同藥物的敏感性，操作相對(duì)簡(jiǎn)便，但不能直接測(cè)得最小抑菌濃度[8]。Etest方法則是將瓊脂擴(kuò)散法與MIC檢測(cè)相結(jié)合的方法，即將已包被不同藥物濃度的藥敏條貼在涂布了菌液的瓊脂平板上，孵育一定時(shí)間后能夠根據(jù)抑菌環(huán)大小直接讀取MIC值，因此Etest方法結(jié)合了紙片擴(kuò)散法操作方便、結(jié)果易讀取及可直接獲得MIC值的優(yōu)勢(shì)。既往有研究評(píng)估唑類(lèi)藥物Etest法與微量肉湯稀釋法一致率，但不同研究結(jié)果存在差異[9-12]。在PFALLER等[9]評(píng)估的1 568株念珠菌研究中，結(jié)果顯示對(duì)于氟康唑，Etest法與CLSI微量肉湯稀釋法EA為96.4%，對(duì)于伏立康唑兩者的EA為98.1%，與本研究對(duì)比結(jié)果接近。也有研究比較歐洲EUCAST肉湯稀釋法與Etest法的一致率，發(fā)現(xiàn)伏立康唑一致率最高為86.6%，氟康唑86.6%，伊曲康唑最低70.7%[10]，與本研究結(jié)果相符但總體一致率偏低。本研究?jī)煞N方法檢測(cè)氟康唑和伏立康唑的一致率較高，EA和CA均超過(guò)90%，但兩種檢測(cè)方法測(cè)得的伊曲康唑EA亦較低，主要原因是部分熱帶念珠菌和近平滑念珠菌Etest檢測(cè)結(jié)果低于微量肉湯稀釋法檢測(cè)結(jié)果，而光滑念珠菌部分菌株Etest檢測(cè)值高于微量肉湯稀釋法，導(dǎo)致一致率偏低。因此對(duì)于熱帶念珠菌、近平滑念珠菌和光滑念珠菌，伊曲康唑Etest結(jié)果的判讀須謹(jǐn)慎，但因伊曲康唑并非治療深部念珠菌感染的首選藥物，因此對(duì)于臨床治療侵襲性念珠菌感染疾病影響不大[13]。另外，本研究未評(píng)估泊沙康唑，但既往有研究顯示泊沙康唑Etest結(jié)果與微量肉湯稀釋法的CA為93%[14]。本研究存在一定局限性，首先克柔念珠菌數(shù)量偏少，并且本研究并未覆蓋其他少見(jiàn)菌種，因此研究結(jié)論無(wú)法代表全部念珠菌屬。另外，CLSI M60僅規(guī)定了部分念珠菌對(duì)氟康唑和伏立康唑的臨床折點(diǎn)，而伊曲康唑無(wú)臨床折點(diǎn)，本研究主要參考CLSI M59規(guī)定的伊曲康唑流行病學(xué)折點(diǎn)進(jìn)行分析，因此兩種方法統(tǒng)計(jì)得出的伊曲康唑CA僅供參考。但基于本研究綜合考慮，Etest法與微量肉湯稀釋法檢測(cè)念珠菌唑類(lèi)藥物敏感性一致率較高，藥敏結(jié)果易于讀取，是適于在臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)唑類(lèi)藥物敏感性的方法。