不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤螨類群落的影響

宋瑩瑩,王 龍,李立坤,劉向輝,戈 峰,陳法軍,*

1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲學(xué)系, 昆蟲信息生態(tài)研究室, 南京 210095 2 中國科學(xué)院動(dòng)物研究所, 北京 100101

為減輕化學(xué)農(nóng)藥使用過程中造成的系列環(huán)境問題,進(jìn)而促進(jìn)我國“新綠色農(nóng)業(yè)”的發(fā)展,基因工程技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代農(nóng)業(yè)害蟲防治中[1]。室內(nèi)或田間條件下,Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt(Bacillusthuringiensis)水稻“克螟稻”及Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻“華恢1號(hào)”均具有較好的抗蟲效果[2- 3],并有效地降低了農(nóng)藥施用[4],且我國農(nóng)業(yè)部于2009年和2014年先后兩次通過了對(duì)轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻“華恢1號(hào)”的生物安全認(rèn)證[5- 6]。然而,人們對(duì)轉(zhuǎn)基因作物的食品安全和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)問題仍存在較大爭(zhēng)議,這嚴(yán)重阻礙了我國115轉(zhuǎn)基因抗蟲育種產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

雖然大量研究表明,轉(zhuǎn)Bt作物對(duì)地上部節(jié)肢動(dòng)物以及水生生物等的影響與非轉(zhuǎn)基因作物相比均無顯著差異[7- 11]。但轉(zhuǎn)Bt作物長(zhǎng)期種植后,其外源基因表達(dá)產(chǎn)物也可能通過根系分泌物、花粉或植株殘?bào)w等方式進(jìn)入土壤,進(jìn)而對(duì)土壤非靶標(biāo)生物造成負(fù)面作用[12- 14]。此外,不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)非靶標(biāo)生物的影響存在較大差異[15- 16],且易受土壤類型以及氣候等多因素影響。因此不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)土壤非靶標(biāo)生物的綜合評(píng)價(jià)至關(guān)重要,但目前有關(guān)這方面的研究還相當(dāng)有限,尤其對(duì)土壤生態(tài)安全性評(píng)價(jià)的工作尚嚴(yán)重不足。

土壤螨類是土壤中數(shù)量和種類極為豐富的一類小型土壤節(jié)肢動(dòng)物,在土壤分解、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)等過程中均起著重要作用[17- 19]。同時(shí),土壤螨類也是自然界易受干擾的生物類群,其種類組成和密度能對(duì)土壤環(huán)境變化做出敏感響應(yīng)[20- 22]。因此,土壤螨類已成為評(píng)價(jià)土壤健康與否的重要敏感指示生物之一[23]。研究不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤螨類群落影響對(duì)轉(zhuǎn)Bt水稻種植和土壤環(huán)境安全具有重要意義。然而有關(guān)轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻對(duì)土壤螨類的安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)尚未見報(bào)道。為綜合評(píng)價(jià)不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤非靶標(biāo)生物的影響,加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估,本研究選取Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻“克螟稻”和Cry1Ab/Cry1Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻“華恢1號(hào)”為供試材料,研究不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)稻田非靶標(biāo)生物土壤螨類的數(shù)量動(dòng)態(tài)、群落組成和多樣性等的影響,以進(jìn)一步明確轉(zhuǎn)Bt水稻的土壤環(huán)境安全性。

1 材料與方法

1.1 田間試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地設(shè)在山東省寧津縣南京農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院“氣候變化與生物多樣性和控害減排【聯(lián)合】創(chuàng)新研究基地”(Innovation Research Platforms for Climate Change, Biodiversity and Pest Management, 即CCBPM; http://www.ccbpm.org; 37.64°N, 116.8°E),該地區(qū)海拔16.5 m,屬于暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)性氣候,年平均氣溫12.9℃,年平均降水量為500—800 mm；土壤類型為蒙淤砂白土,耕作層(0—20 cm)的土壤pH值(水提法,液土比5∶1)為8.5,土壤有機(jī)碳(高溫外熱重鉻酸鉀氧化-容量法)、全氮(凱氏消煮法)、堿解氮(堿解擴(kuò)散法)、速效磷(鉬藍(lán)比色法)和速效鉀(火焰光度計(jì)法)含量分別為6.6 g/kg、0.4 g/kg、7.9 g/kg、14.4 mg/kg和96 mg/kg。試驗(yàn)前該地區(qū)主要種植棉花、玉米和小麥等旱地作物,未進(jìn)行秸稈還田耕作,無轉(zhuǎn)Bt水稻種植記載,且當(dāng)前周邊100 km內(nèi)也無轉(zhuǎn)Bt水稻種植,從而避免了轉(zhuǎn)Bt作物外源Bt基因的擴(kuò)散雜交風(fēng)險(xiǎn)。整個(gè)試驗(yàn)過程除不施用化學(xué)殺蟲劑外,其他均按照常規(guī)的稻田管理措施。

1.2 供試轉(zhuǎn)Bt水稻

試驗(yàn)所用的轉(zhuǎn)Bt水稻為2個(gè)轉(zhuǎn)Cry1A基因抗蟲水稻品系,即Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻“克螟稻”和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻“華恢1號(hào)”(兩者均為恢復(fù)系),及其常規(guī)對(duì)照親本“秀水11”和“明恢63”?？嗣臼菍⑼庠碈ry1Ab基因?qū)胪砭拘闼?1后選育出的轉(zhuǎn)Bt抗蟲基因水稻,稻種由浙江大學(xué)原子能研究所提供；華恢1號(hào)以明恢63為受體材料,通過基因槍介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法將目的基因Cry1Ab/Ac轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞后所得的轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻,稻種由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科技學(xué)院提供。以上兩種轉(zhuǎn)Bt抗蟲水稻的靶標(biāo)害蟲為二化螟Chilosuppressalis和稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis等鱗翅目害蟲[2- 3]。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)包含Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻“克螟稻”和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻“華恢1號(hào)”及其常規(guī)對(duì)照親本“秀水11”和“明恢63”,共4個(gè)水稻品種。每個(gè)水稻品種設(shè)置4個(gè)小區(qū),每小區(qū)5 m×20 m,小區(qū)之間設(shè)置5 m的隔離帶,水稻品種之間采用隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)(圖1)。水稻于2011年5月15日旱作播種,11月15日收獲。播種前按每公頃375 kg氮肥、225 kg磷肥和150 kg鉀肥施底肥,大田漫灌一次,并于水稻拔節(jié)期和孕穗期分別追施氮肥(150 kg/hm2)、磷肥(90 kg/hm2)和鉀肥(60 kg/hm2)各一次；此外,播種后間隔3周人工除草和灌溉各一次。自水稻播種后一個(gè)月,每隔兩個(gè)月進(jìn)行一次土壤采樣,即6月份、8月份和10月份3次采樣。采樣時(shí),用100 mL環(huán)刀每小區(qū)隨機(jī)取樣5環(huán)刀水稻土,放入一個(gè)自封袋中,做好標(biāo)記后帶回實(shí)驗(yàn)室分別進(jìn)行分離鑒定。

圖1 Cry1Ab純和基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本大田試驗(yàn)設(shè)置圖Fig.1 Field layout and deployment diagram of transgenic Bt rice with single Cry1Ab and fused Cry1Ab/Ac transgenes and their respectively parental linesKMD：克螟稻,Kemingdao；XSD：秀水稻,Xiushuidao；HH1：華恢1號(hào),Huahui 1；MH63：明恢63,Minghui 63

1.4 土壤螨類分離與鑒定

將帶回的每個(gè)土樣充分混合后,用100 mL標(biāo)準(zhǔn)環(huán)刀量取一環(huán)刀(即100 mL)土樣采用改良的干漏斗法(即Tullgren法)進(jìn)行土壤螨類的分離,獲得的土壤螨用裝有濃度為75%酒精的白色塑料小瓶(容積：50 mL)收集[24]。螨類標(biāo)本依據(jù)尹文英《中國土壤動(dòng)物檢索圖鑒》鑒定[25],一般鑒定到屬,個(gè)別鑒定到科,同時(shí)統(tǒng)計(jì)個(gè)體數(shù)量。此外,根據(jù)各土壤螨的數(shù)量占土壤螨總數(shù)量的百分比來劃分各類群,即個(gè)體數(shù)占總量10%以上者為優(yōu)勢(shì)類群,個(gè)體數(shù)占總量1%—10%為常見類群,個(gè)體數(shù)占總量1%以下為稀有類群[26]。

1.5 土壤螨類群落指標(biāo)計(jì)算

依據(jù)以上分離鑒定的各土壤螨的類群及其數(shù)量,運(yùn)用Shannon多樣性指數(shù)、Margalef豐富度指數(shù)和Pielou均勻度指數(shù)來研究[27]Cry1Ab純和基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤螨類群落多樣性的影響。

具體公式如下：

(1)Shannon多樣性指數(shù)(H′)：

式中,Pi為土壤螨群落中第i類群(屬)個(gè)體數(shù)占總個(gè)體數(shù)的百分比；S為土壤螨群落中所有螨的類群數(shù)。

(2)Margalef豐富度(SR)：

SR=(S-1)/lnN

其中,S的含義同上,N為土壤螨類群落的總個(gè)體數(shù)。

(3)Pielou均勻度(J)：

J=H′/lnS

式中,H′,S的含義同上。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。采用單因子方差分析(One-way ANOVA)比較2011年6、8和10月份3次累計(jì)分離鑒定的轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本稻田土壤螨類的百分比組成差異,以及同一次調(diào)查取樣所分離鑒定的土壤螨類數(shù)量和測(cè)定的Shannon多樣性指數(shù)(H′)、Margalef豐富度(SR)和Pielou均勻度(J)等的差異；此外,采用單因子重復(fù)測(cè)量方差分析(One-way Repeated-Measures ANOVAs)以明確轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本之間(KMD vs. XSD或HH1 vs. MH63),以及不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻之間(KMD vs. HH1)在2011年6、8和10月份稻田土壤螨類數(shù)量動(dòng)態(tài),以及測(cè)定的Shannon多樣性指數(shù)(H′)、Margalef豐富度(SR)和Pielou均勻度(J)等的群落指標(biāo)的動(dòng)態(tài)差異。處理間差異顯著性采用LSD檢驗(yàn)(差異顯著：P<0.05；差異較大但不顯著：0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)稻田土壤螨類數(shù)量與百分比組成的影響

2011年6月份、8月份和10月份連續(xù)3次對(duì)兩種基因型(即Cry1Ab純和基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型)轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本稻田土壤進(jìn)行了土壤取樣,以及土壤螨類的分離與鑒定,共發(fā)現(xiàn)4目,27科土壤螨類(表1)。Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植增加了土壤螨類的科屬種類；其中,Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本稻田土壤中分別發(fā)現(xiàn)了17科和18科的土壤螨類,Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本稻田土壤中分別發(fā)現(xiàn)21科和17科的螨類。

對(duì)科屬組成及其百分比分析發(fā)現(xiàn)(表1),同一轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)不同的土壤螨類影響不同,不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)同一土壤螨類的影響也不同,且轉(zhuǎn)Bt水稻種植田中一些百分比含量較少的稀有類群(<1%)和常見類群(介于1%和10%)消失或出現(xiàn)。與對(duì)照親本稻田土壤相比,Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻田土壤中分別有3個(gè)科的稀有類群(赫甲螨科、真卷甲螨科和寄螨科)和3個(gè)科的常見類群(步甲螨科、蓋頭甲螨科和絨螨科)消失,同時(shí)又有1個(gè)科的稀有類群(若甲螨科)和6個(gè)科的常見類群(尖棱甲螨科(奧斯甲螨屬)、木單翼甲螨科(木單翼甲螨屬和全單翼甲螨屬)、奧甲螨科(奧甲螨屬)、厚厲螨科、尾足螨科和巨須螨科)出現(xiàn)；此外,Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻田土壤中分別有1個(gè)科的稀有類群(奧甲螨科(微奧甲螨屬))和3個(gè)科的常見類群(真卷甲螨科、奧甲螨科(多奧甲螨和隱奧甲螨屬)和吸螨科)消失,同時(shí)又有6個(gè)科的稀有類群(上羅甲螨科、維螨科、尾足螨科、寄螨科、真足螨科和絨螨科)和1個(gè)科常見類群(奧甲螨科(奧甲螨屬))出現(xiàn)。其中,Cry1Ab純和基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植均可導(dǎo)致真卷甲螨科三皺甲螨屬種類的消失,以及蓋頭甲螨科奧甲螨屬和尾足螨科種類的出現(xiàn)。與對(duì)照親本相比,Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著增加了上羅甲螨科上羅甲螨屬的百分比含量(+525%;P<0.05; 表1),而Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)稻田土壤螨的百分比組成無顯著影響(P>0.05; 表1)。

表1Cry1Ab純合基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻稻田土壤螨類優(yōu)勢(shì)類群(>10%)、常見類群(介于1%和10%)和稀有類群(<1%)組成/%

Table 1 Composition and structure of the dominant (>10%), common (≥1% and <10%) and rare (<1%) groups of soil mites genus in the paddyfields of transgenicBtrice with singleCry1Aband fusedCry1Ab/Actransgenes

目Order科Family屬GenusCry1Ab純和基因型 Single Cry1Ab transgeneCry1Ab/Ac融合基因型 Fused Cry1Ab/Ac transgenes轉(zhuǎn)Bt水稻(克螟稻)Transgenic Bt rice (KMD)對(duì)照親本(秀水11)Parental line (XSD)轉(zhuǎn)Bt水稻(華恢1號(hào))Transgenic Bt rice (HH1)對(duì)照親本(明恢63)Parental line (MH63)甲螨目縫甲螨科Hypochthoniidae縫甲螨屬Hypochthonius7.0±3.34.4±1.510.0±4.20.6±0.6Oribatida步甲螨科Carabodidae步甲螨屬Carabodes1.3±1.3赫甲螨科Hermanniidae赫甲螨屬Hermannia0.9±0.9尖棱甲螨科Ceratozetes尖棱甲螨屬Ceratozetes8.4±1.37.4±2.29.0±4.410.1±3.1奧斯甲螨屬Ocesobates3.6±2.2真卷甲螨科Euphthiracaridae三皺甲螨屬Rhysotritia0.9±0.91.0±1.0上羅甲螨科Epilohmanniidae上羅甲螨屬Epilohmannia7.5±1.1a1.2±0.8 b0.8±0.8木單翼甲螨科Xylobatidae木單翼甲螨屬Xylobates2.4±2.46.0±1.22.6±1.6全單翼甲螨屬Perxyiobates1.6±1.60.8±0.81.0±1.0蓋頭甲螨科Tectocepheidae蓋頭甲螨屬Tectocepheus2.1±1.73.1±2.23.0±3.0奧甲螨科Oppiidae奧甲螨屬Oppia1.3±1.31.7±1.0多奧甲螨Multioppia Hammer0.8±0.80.9±0.92.9±1.7隱奧甲螨屬Cryptoppia Csiszar1.0±1.0微奧甲螨屬M(fèi)icroppia0.7±0.7若甲螨科Oribatulidae合若甲螨屬Zygoribatula0.8±0.8中氣門目維螨科Veigaiidae0.7±0.7Mesostigmata囊螨科 Ascidae26.8±5.525.5±5.619.9±6.835.0±11.7厲螨科 Laelapidae1.2±1.21.3±1.31.6±1.60.6±0.6胭螨科Rhodacaridae胭螨屬 Rhodacarus9.4±5.614.8±2.56.9±1.49.2±3.2小胭螨屬 Rhodacarellus0.7±0.71.7±1.7厚厲螨科Pachylaelapidae1.3±1.3尾足螨科Uropodidae2.9±1.70.3±0.3植綏螨科Phytoseiidae1.3±1.30.9±0.90.3±0.31.7±1.7寄螨科Parasitidae0.9±0.90.8±0.8派盾螨科Parholaspidae6.3±5.32.6±1.6前氣門目真足螨科Eupodidae0.7±0.7Prostigmata長(zhǎng)須螨科Stigmaedae長(zhǎng)須螨屬Stigmaeus3.6±2.29.7±7.57.1±2.74.2±1.5微離螨科Microdispidae奇矮螨屬Allopygmephorus11.2±6.213.6±1.812.4±6.515.0±3.3絨螨科Trombidiidae1.3±1.30.7±0.7吸螨科Bdellidae1.9±1.9巨須螨科Cunaxidae巨須螨屬Cunaxa3.0±2.13.0±1.22.5±1.8無氣門目食菌螨科Anoetidae1.6±1.60.3±0.32.7±2.31.6±1.0Astigmata粉螨科 Acaridae2.1±1.312.7±9.54.7±1.81.2±1.2

不同小寫字母表示經(jīng)LSD檢驗(yàn)轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本稻田土壤螨的百分比組成差異顯著,P<0.05

2.2 轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)土壤螨類數(shù)量動(dòng)態(tài)和群落多樣性的影響

根據(jù)6、8和10月份3次調(diào)查結(jié)果分析得出,轉(zhuǎn)Bt水稻種植沒有顯著影響土壤螨類的數(shù)量,以及群落多樣性、均勻度和科屬豐富度(P>0.05; 表2),Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤螨類科屬豐富度的影響較大(P=0.072<0.10；表2)。其中,相對(duì)于對(duì)照親本而言,3次調(diào)查期間Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植提高了土壤螨類數(shù)量,以及群落多樣性、均勻度和科屬豐富度,而Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植僅明顯提高了土壤螨類群落均勻度(圖2)。

與對(duì)照親本相比,Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著降低了10月份單位面積稻田土壤中螨類數(shù)量(-72%;P<0.05)和科屬豐富度(-38%;P<0.05),同時(shí)又顯著提高了8月份稻田土壤螨類均勻度(+15%;P<0.05)；此外,Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植還顯著提高了10月份土壤螨類群落多樣性(+53%;P<0.05; 圖2)。

表2 轉(zhuǎn)Bt水稻及其親本種植對(duì)稻田土壤螨類數(shù)量和群落多樣性影響的單因子重復(fù)測(cè)量方差分析(F/P)

Table 2 One-way repeated-measures ANOVAs for the effects of the planting of transgenicBtrice and their corresponding parental lines of non-Btrice on the abundance and community diversity of soil mites in paddyfields (F/P)

土壤螨類測(cè)定指標(biāo)Measured indices of soil mitesCry1Ab純合基因型(克螟稻 vs.秀水11)Single Cry1Ab transgene(KMD vs. XSD)Cry1Ab/Ac融合基因型(華恢1號(hào) vs. 明恢63)Fused Cry1Ab/Ac transgenes(HH1 vs. MH63)數(shù)量/100 mL Abundance (Individuals per 100 mL soil)0.01/0.921.48/0.24群落多樣性(H′) Shannon diversity (H′)0.07/0.802.68/0.12群落均勻度(J) Pielou′s evenness (J)0.99/0.330.50/0.49科屬豐富度(S) Margalef′s richness (SR)0.13/0.733.60/0.072?

* 表示轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本之間經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異較大,P<0.10；該分析方法以轉(zhuǎn)基因處理(Btvs. non-Bt)為主因子,以2011年6月、8月和10月3次采樣日期為重復(fù)測(cè)量

圖2 轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本稻田土壤螨類數(shù)量和群落多樣性動(dòng)態(tài)Fig.2 Dynamics of individual abundance and community diversity of soil mites in paddyfields of transgenic Bt rice and their corresponding parental lines of non-Bt rice* 表示轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本之間經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異顯著,P<0.05; 不同大寫字母表示連續(xù)3次調(diào)查轉(zhuǎn)Bt水稻及其對(duì)照親本間經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異顯著,P<0.05

2.3 不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤螨類數(shù)量和群落多樣性的影響

根據(jù)6、8和10月份3次調(diào)查結(jié)果分析得出(表3),不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著影響了土壤螨類數(shù)量(P=0.035<0.05)和科屬豐富度(P=0.043<0.05),但對(duì)群落多樣性(P=0.21>0.05)和均勻度(P=0.86>0.05; 表3)的影響不顯著。其中,相對(duì)于Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻而言,Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著提高了土壤螨類數(shù)量和群落科屬豐富度(P<0.05),并提高了群落多樣性和均勻度,但差異不顯著(P>0.05; 圖3)。

與Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻相比,Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著提高了6、8和10月份單位面積稻田土壤中螨類數(shù)量,提高達(dá)284%、28%和124%(P<0.05)；并顯著提高了10月份稻田土壤螨類群落多樣性,提高達(dá)34%(P<0.05;)；此外,還顯著提高了6月份和10月份稻田土壤螨類科屬豐富度,提高達(dá)113%和75%(P<0.05; 圖3)。

表3 轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)稻田土壤螨類數(shù)量和群落多樣性影響的單因子重復(fù)測(cè)量方差分析(F/P值)

Table 3 One-way repeated-measures ANOVAs for the effects of transgenicBtrice planting on the abundance and community diversity of soil mites in paddyfields (F/Pvalues)

測(cè)定指標(biāo)Measured indicesCry1Ab純合基因型與Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻相比(克螟稻 vs. 華恢1號(hào))Transgenic Bt rice with single Cry1Ab transgene vs. fused Cry1Ab/Ac transgenes (KMD vs. HH1)數(shù)量/100 mL Abundance (Individuals per 100 mL soil)5.82/0.035?群落多樣性(H′) Shannon diversity index (H′)1.65/0.21群落均勻度(J) Pielou′s evenness index (J)0.03/0.86科屬豐富度(S) Margalef′s richness index (SR)4.22/0.043?

* 表示轉(zhuǎn)Bt水稻之間經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異顯著,P<0.05；該分析方法以基因型(Cry1Ab純合基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型)為主因子,以2011年6月、8月和10月3次采樣日期為重復(fù)測(cè)量

圖3 轉(zhuǎn)Bt水稻稻田土壤螨類數(shù)量和群落多樣性動(dòng)態(tài)Fig.3 Dynamics of individual abundance and community diversity of soil mites in paddyfields of transgenic Bt rice*表示轉(zhuǎn)Bt水稻之間經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異顯著,P<0.05；不同小寫字母表示連續(xù)3次調(diào)查轉(zhuǎn)Bt水稻間經(jīng)LSD檢驗(yàn)差異顯著,P<0.05

3 討論

隨著眾多轉(zhuǎn)Bt抗蟲作物培育成功并廣泛種植,在其有效控制鱗翅目等靶標(biāo)害蟲發(fā)生為害的同時(shí),其非靶標(biāo)生物安全性越來越受到普遍關(guān)注[16, 28- 29]。而隨著轉(zhuǎn)Bt作物長(zhǎng)期種植后,其外源基因表達(dá)產(chǎn)物也可能通過根系分泌物、花粉或植株殘?bào)w等方式進(jìn)入土壤,從而對(duì)土壤非靶標(biāo)生物造成負(fù)面作用[12- 14]。土壤中,大量的無脊椎動(dòng)物與植物根系和土壤相互作用,在土壤生態(tài)系統(tǒng)中扮演著非常重要的功能生物角色[30]。作為土壤生態(tài)系統(tǒng)中重要的功能生物之一,土壤螨類的群落結(jié)構(gòu)與組成通常是相對(duì)穩(wěn)定的,但當(dāng)土壤環(huán)境受到干擾時(shí)土壤螨類會(huì)做出及時(shí)響應(yīng)[20]。本研究發(fā)現(xiàn),與對(duì)照親本相比,Cry1Ab純合基因型(克螟稻)和Cry1Ab/Ac融合基因型(華恢1號(hào))轉(zhuǎn)Bt水稻種植田中,出現(xiàn)一些稀有類群(<1%)和常見類群(介于1%和10%)消失或出現(xiàn)的現(xiàn)象。這可能與轉(zhuǎn)Bt水稻的種植有關(guān),也可能與稀有類群較強(qiáng)的隨機(jī)性和土壤螨類的空間異質(zhì)性有關(guān)。Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻中僅上羅甲螨屬的百分比含量顯著高于其對(duì)照親本,而其他土壤螨類百分比含量均未出現(xiàn)顯著性的差異。由此表明,上羅甲螨屬對(duì)Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻的種植更敏感。此外,真卷甲螨科三皺甲螨屬均未在Cry1Ab純合基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻稻田土壤中發(fā)現(xiàn),且蓋頭甲螨科奧甲螨屬和尾足螨科僅在這兩類基因型轉(zhuǎn)Bt水稻稻田土壤中發(fā)現(xiàn)?？梢?以上受影響較大的上羅甲螨屬、三皺甲螨屬和尾足螨科等土壤螨類可作為轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤生態(tài)安全性評(píng)價(jià)與環(huán)境監(jiān)測(cè)的指示物種。

土壤是生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化過程中重要的場(chǎng)所,而土壤生物的多樣性是土壤多種功能的基礎(chǔ)[31]。本研究結(jié)果顯示Cry1Ab純合基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)6、8和10月份連續(xù)3次調(diào)查的土壤螨類數(shù)量發(fā)生動(dòng)態(tài),以及群落多樣性、均勻度和科屬豐富度等指標(biāo)動(dòng)態(tài)均無顯著影響。在相同試驗(yàn)條件下,Cry1Ab純合基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻經(jīng)過三年連續(xù)種植后,土壤中Bt蛋白的含量未超過0.12 ng/g[15],推測(cè)該Bt蛋白濃度尚不能對(duì)土壤螨類多樣性產(chǎn)生顯著影響。Liu研究指出在外界環(huán)境(如降雨、溫度、光照等)的影響下,轉(zhuǎn)Bt作物外源Bt毒素對(duì)非靶標(biāo)生物的影響微不足道[29]。且轉(zhuǎn)Bt水稻中的外源Cry1Ab蛋白在土壤中降解的速度非?？?一個(gè)月降解高達(dá)50%[32]。祝向鈺研究了轉(zhuǎn)Bt水稻對(duì)土壤跳蟲的影響,與對(duì)照親本相比也無顯著差異[33]。盡管本研究未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤非靶標(biāo)生物有負(fù)面影響,但其是否有累積效應(yīng)仍需長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)。此外,本研究還得出Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)6、8和10月份連續(xù)3次調(diào)查的土壤螨類群落科屬豐富度的影響較大(P=0.072<0.10；表2)。另一方面,與對(duì)照親本相比,Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著降低了10月份單位面積稻田土壤中螨類數(shù)量和科屬豐富度,同時(shí)又顯著提高了8月份稻田土壤螨類均勻度,Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植還顯著提高了10月份土壤螨類群落多樣性,且3次調(diào)查期間Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植提高了土壤螨類數(shù)量及群落多樣性、均勻度、科屬豐富度?？梢?相對(duì)于對(duì)照親本而言,轉(zhuǎn)Bt水稻(尤其是Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻)種植有提高稻田土壤螨類數(shù)量和群落多樣性、均勻性和科屬豐富度的趨勢(shì),且影響存在時(shí)間動(dòng)態(tài)差異。

通過比較Cry1Ab純和基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)稻田土壤螨類數(shù)量和相關(guān)群落參數(shù)的影響發(fā)現(xiàn),Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻顯著增加了土壤螨類的數(shù)量和科屬豐富度?？梢?在科屬分類水平上,相對(duì)于Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植而言,Cry1Ab/Ac融合基因轉(zhuǎn)Bt水稻種植在提高土壤螨類群落穩(wěn)定性方面發(fā)揮著更大的優(yōu)勢(shì),而在物種水平Cry1Ab/Ac融合基因轉(zhuǎn)Bt水稻種植是否更有利于非靶標(biāo)生物的數(shù)量發(fā)生和群落多樣性的保護(hù)有待進(jìn)一步研究。Chen報(bào)道了Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻(克螟稻)及其對(duì)照親本(秀水11)稻田土壤線蟲的數(shù)量與Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻(華恢1號(hào))及其對(duì)照親本(明恢63)間存在顯著的差異,且前者顯著高于后者[15]。可見,同一轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)不同的土壤非靶標(biāo)生物的影響不同,且不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)同一土壤非靶標(biāo)生物的影響也不盡相同。同時(shí)Chen也發(fā)現(xiàn)上述兩種轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤中Bt蛋白的濃度無顯著影響,但前者稻田土壤中硝酸氮的含量顯著高于后者[15],推測(cè)不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻稻田土壤螨類的數(shù)量和科屬豐富度的差異與土壤中硝酸氮濃度的變化有關(guān),且呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。本研究只開展了一年期Cry1Ab純和基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻短期種植對(duì)稻田土壤螨類數(shù)量及其群落組成等的影響,而長(zhǎng)期種植轉(zhuǎn)Bt水稻是否會(huì)對(duì)土壤螨類等非靶標(biāo)生物的影響存在累積效應(yīng),進(jìn)而造成更大的潛在影響仍需要更持久的田間檢測(cè)與監(jiān)測(cè)試驗(yàn)的開展。

4 結(jié)論

通過研究Cry1Ab純合基因型和Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)稻田非靶標(biāo)生物土壤螨類的數(shù)量動(dòng)態(tài)、群落組成和多樣性等的影響得出,轉(zhuǎn)Bt水稻種植田僅個(gè)別稀有類群或常見類群消失或出現(xiàn)。其中,Cry1Ab純和基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著增加了稻田土壤中上羅甲螨科上羅甲螨屬的百分比含量。此外,Cry1Ab/Ac融合基因型和Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)稻田土壤螨類的數(shù)量動(dòng)態(tài)、群落多樣性、群落均勻度和科屬豐富度等的影響都不顯著?？梢?轉(zhuǎn)Bt水稻種植并未顯著改變土壤螨類的群落組成和數(shù)量動(dòng)態(tài)等。與Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻相比,Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植顯著提高了稻田非靶標(biāo)生物土壤螨類的數(shù)量和科屬豐富度,進(jìn)而表明Cry1Ab/Ac融合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植比Cry1Ab純合基因型轉(zhuǎn)Bt水稻更有利于土壤螨類等非靶標(biāo)生物的數(shù)量發(fā)生及其群落多樣性保護(hù)。本研究的開展進(jìn)一步明確了不同基因型轉(zhuǎn)Bt水稻種植對(duì)土壤非靶標(biāo)生物的影響,并為綜合評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)Bt作物土壤環(huán)境安全性提供了試驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。