PK-15 細胞微載體懸浮培養(yǎng)及PCV2 增殖工藝研究

梁 武，喬 健，李亞杰，易小萍，楊保收

(1.中國農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,北京 海淀100193；2.天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司,天津 空港300308；3.華東理工大學生物反應(yīng)器國家重點實驗室,上海 徐匯200237)

豬圓環(huán)病毒病(PCVD)主要由豬2 型圓環(huán)病毒(PCV2)引起的免疫抑制性疾病,造成免疫抑制,使豬群生產(chǎn)性能下降,自1991 年發(fā)現(xiàn)以來已成為危害養(yǎng)豬的主要疫病之一,給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的損失。疫苗免疫是預防PCVD 最有效的手段,目前國內(nèi)外學者對PCV2 疫苗的研究主要是從滅活疫苗、嵌合病毒疫苗、亞單位疫苗、重組腺病毒基因工程疫苗以及核酸疫苗等方面進行研究。在我國,已商品化的PCV2 疫苗絕大部分為全病毒滅活疫苗,但PCV2 增殖滴度較低,PCV2 感染宿主細胞后,病毒采用滾環(huán)復制(Rolling circle replication)模式進行復制,在病毒生長的S 期復制效率較高,隨宿主細胞復制而復制,因此,PCV2 的復制周期比其他病毒長,這為研究高效PCV2 疫苗帶來了障礙[4-5]。為了提升PCV2 疫苗市場競爭力,就需要優(yōu)化疫苗生產(chǎn)工藝,降低生產(chǎn)成本,減少批間差異,保證產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定。本研究利用細胞微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)摸索PCV2 在敏感細胞株P(guān)K-15 細胞增殖工藝,旨在打破現(xiàn)有PCV2 滅活疫苗生產(chǎn)過程中病毒效價低的技術(shù)瓶頸,從而進一步提升PCV2 疫苗質(zhì)量和臨床免疫效果,帶動行業(yè)技術(shù)升級。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒毒株、細胞與血清 豬圓環(huán)病毒PCV2-ZJ/C 株,病毒含量107.5TCID50/mL,由天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司制備、保存；PK-15 細胞由本公司研究院保存,新生牛血清,購自美國Gibco 公司。

1.1.2 培養(yǎng)基及生物反應(yīng)器 PK-15 細胞專用低血清培養(yǎng)基P-LSM,購自蘇州沃美生物技術(shù)有限公司(貨號P22301-2)；14 L、42 L 生物反應(yīng)器,購自德國賽多利斯(Sartorius)公司。

1.1.3 單抗及微載體 PCV2 免疫熒光單抗由浙江大學周繼勇教授惠贈；Cytodex1 微載體,購自GE Healthcare 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 細胞密度的測定 采用結(jié)晶紫染色法,計算微載體上細胞數(shù)量,具體步驟為:將樣品吹打均勻后取出1 mL 微載體懸液置于EP 管中,1 000 r/min,離心5 min 后棄上清,加入等量的0.1%檸檬酸結(jié)晶紫(0.1 mol/L)溶液并混勻,37 ℃孵育1 ～2 h 后,用移液槍吹打,使微載體上的細胞脫落并保證細胞核全部釋放,稀釋后用血球計數(shù)板計數(shù)釋放的細胞核,即為細胞的密度。

1.2.2 病毒滴度的測定 參照農(nóng)業(yè)部第1893 號公告,按照“豬圓環(huán)病毒2 型滅活疫苗(ZJ/C 株)制造及檢驗試行規(guī)程”進行PCV2 ZJ/C 株毒液病毒滴度的測定(間接免疫熒光法)。

1.2.3 細胞初始接種密度優(yōu)化 設(shè)定0.25×106、0.5×106、0.75×106、1.00×106cells/mL 四個初始細胞接種密度,分別接種于14 L 生物反應(yīng)器培養(yǎng),每隔24 h 取樣進行細胞計數(shù),繪制細胞生長曲線。其他參數(shù)條件為:微載體濃度:3 g/L,攪拌轉(zhuǎn)速:60 r/min,pH 值:7.2,溶氧(DO)40%,培養(yǎng)溫度:37 ℃,培養(yǎng)基:P-LSM 專用低血清培養(yǎng)基。

1.2.4 微載體濃度的優(yōu)化 選取濃度分別為2、3、4、5 g/L 的微載體與適量細胞濃度(0.5×106cells/mL)懸液于14 L 反應(yīng)器進行培養(yǎng),觀察不同微載體濃度對細胞生長影響,確定微載體最適濃度。其他參數(shù)條件:細胞初始接種密度:0.5×106cells/mL,攪拌轉(zhuǎn)速:60 r/min,pH 值:7.2,溶氧(DO)40%,溫度:37 ℃,培養(yǎng)基:P-LSM 專用培養(yǎng)基。

1.2.5 攪拌轉(zhuǎn)速選擇 設(shè)定50、60、70、80 r/min 4個攪拌轉(zhuǎn)速,于14 L 反應(yīng)器培養(yǎng),每隔24 h 取樣觀察計數(shù)、繪制細胞生長曲線,選擇最適攪拌轉(zhuǎn)速。其他參數(shù)條件:細胞初始接種密度:0.5×106cells/mL,微載體濃度:3 g/L,pH 值:7.2,溶氧(DO)40%,溫度:37 ℃,培養(yǎng)基:P-LSM 專用培養(yǎng)基。

1.2.6 不同接毒時間對ZJ/C 株增殖的影響 將PK-15 細胞以0.5×106cells/mL 的密度接種于14 L反應(yīng)器,分別在細胞生長0、6、12 h 和24 h,以病毒感染復數(shù)(MOI)0.5 接種PCV2-ZJ/C 株,于培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 分別取樣,測定病毒滴度,確定最適接毒時間。其他參數(shù)條件:溶氧(DO)40%,轉(zhuǎn)速:60 r/min,溫度:37 ℃。

1.2.7 接毒劑量對ZJ/C 株增殖的影響 將PK-15細胞以0.5×106cells/mL 密度接于14 L 反應(yīng)器,細胞培養(yǎng)6 h 時,分別設(shè)定MOI 為0.05、0.5、1、3 四組,于病毒培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度,確定最適接毒劑量。其他參數(shù)條件:轉(zhuǎn)速:60 r/min,溫度:37 ℃。

1.2.8 收毒時間的確定 將PK-15 細胞以0.5×106cells/mL 密度接種于14 L 反應(yīng)器中,細胞培養(yǎng)6 h 接毒(MOI 為0.5),于病毒培養(yǎng)第60、72、96 h和120 h 分別取樣,測定病毒滴度,確定最適收毒時間。其他參數(shù)條件:病毒感染復數(shù):0.5,轉(zhuǎn)速:60 r/min,培養(yǎng)溫度:37 ℃。

1.2.9 培養(yǎng)溫度對PCV2 增殖的影響 將PK-15細胞以0.5×106cells/mL 密度接種于14 L 反應(yīng)器中,培養(yǎng)6 h 后接毒,分別設(shè)定36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃培養(yǎng),于病毒培養(yǎng)60、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度,確定最適培養(yǎng)溫度。其他培養(yǎng)條件:病毒感染復數(shù):0.5,轉(zhuǎn)速:60 r/min。

1.2.10 PK-15 細胞懸浮培養(yǎng)消化與放大工藝驗證 按照預準備、細胞消化、重懸培養(yǎng)三步進行放大工藝研究,方法如下:(1)預準備:細胞消化前,先將適量培養(yǎng)基與微載體處理液注入42 L 反應(yīng)器；(2)清洗:將14 L 反應(yīng)器細胞打入消化罐,間斷性攪拌棄去生長液,注入PBS,清洗微載體；(3)消化:將適量胰酶注入消化罐中,采用間歇性攪拌棄去胰酶方式消化載體上細胞；(4)終止:將生長液注入消化罐中,攪拌終止消化并注入42 L罐。補足培養(yǎng)液。參數(shù)如下:轉(zhuǎn)速:35 r/min,病毒培養(yǎng)溫度:39 ℃,MOI:0.5,病毒培養(yǎng)96 h 收獲,測定病毒滴度。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞初始接種密度優(yōu)化 選擇0.25×106、0.5×106、0.75×106、1.00×106cells/mL 四個接種密度分別于14 L 反應(yīng)器培養(yǎng),結(jié)果表明,密度為0.5×106cells/mL 和0.75×106cells/mL 時,細胞生長延滯期均較短,均可達到最大細胞密度,基于生產(chǎn)成本考慮,選擇0.5×106cells/mL 為細胞的最佳初始接種密度(見圖1)。

圖1 不同初始接種密度PK-15 細胞生長曲線

2.2 微載體濃度優(yōu)化 選取2、3、4、5 g/L 的微載體濃度與0.5×106cells/mL 細胞懸液在14 L 反應(yīng)器培養(yǎng),結(jié)果表明,當微載體濃度為3 g/L 時,細胞于微載體上生長滿球率最高,達到95%以上(見圖2、圖3),初步確定3 g/L 為最佳微載體使用濃度。

圖2 PK-15 細胞在3 g/L 微載體濃度下狀態(tài) (20×)

圖3 不同微載體濃度培養(yǎng)PK-15 細胞比較

2.3 攪拌轉(zhuǎn)速的選擇 選取不同攪拌轉(zhuǎn)速于14 L反應(yīng)器進行PK-15 細胞培養(yǎng),結(jié)果表明,當攪拌轉(zhuǎn)速為60 r/min 時,細胞生長密度最大,因此,選擇60 r/min 為最適攪拌轉(zhuǎn)速(見圖4)。

圖4 不同攪拌轉(zhuǎn)速下PK-15 細胞生長密度的比較

2.4 病毒接種時間的確定 選取細胞生長0、6、12 h 和24 h 四個接毒時間于14 L 反應(yīng)器進行病毒培養(yǎng),于細胞培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度。結(jié)果表明,當細胞生長6 h 時接毒,產(chǎn)毒效果最好,培養(yǎng)96 h 收獲病毒滴度可達108.0TCID50/mL,因此,確定細胞培養(yǎng)6 h 為最佳接毒時間(見圖5)。

圖5 不同接毒時間的PCV2 增殖曲線

2.5 病毒感染復數(shù)(MOI)的確定 選取接毒劑量(MOI)為0.05、0.5、1、3 于14 L 反應(yīng)器進行病毒培養(yǎng),病毒培養(yǎng)24、48、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度。結(jié)果表明,病毒感染復數(shù)MOI 為0.5、1 時,產(chǎn)毒效果最好,病毒最高滴度107.8TCID50/mL,因此,考慮成本因素,選擇MOI 為0.5 為最佳接毒劑量(見圖6)。

圖6 不同接毒劑量的PCV2 增殖曲線

2.6 最佳收毒時間的確定 選取病毒培養(yǎng)60、72、96 h 和120 h 四個不同收毒時間于14 L 反應(yīng)器進行病毒培養(yǎng)。結(jié)果表明,96 h 收獲病毒滴度最高,達到108.5TCID50/mL,因此,選擇96 h 為最佳收毒時間(見圖7)。

圖7 最佳收毒時間的確定

2.7 病毒培養(yǎng)溫度的確定 選擇36 ℃、37 ℃、38 ℃、39 ℃4 個溫度于14 L 反應(yīng)器進行病毒培養(yǎng),病毒培養(yǎng)60、72 h 和96 h 取樣,測定病毒滴度。結(jié)果表明,39 ℃時細胞生長較快,產(chǎn)毒較37 ℃培養(yǎng)要高,最高滴度108.5TCID50/mL,較37 ℃培養(yǎng)高0.5 個滴度。因此,選擇39 ℃為最佳病毒增殖溫度(見表1)。

表1 不同培養(yǎng)溫度下PCV2 增殖滴度

2.8 微載體懸浮培養(yǎng)PK-15 細胞14 L 罐消化分散結(jié)果 按1.2.10 項方法,將14 L 反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)48 h 的PK-15 細胞進行消化分散。結(jié)果表明,95%以上的PK-15 細胞從微載體上成功消化,細胞分散良好,折光性好,無明顯結(jié)團現(xiàn)象,可滿足下一級42 L 罐進行PCV2 病毒培養(yǎng)(見圖8)。

圖8 14 L 反應(yīng)器培養(yǎng)PK-15 細胞消化分散效果

2.9 PCV2 ZJ/C 株的生物反應(yīng)器42 L 放大培養(yǎng)工藝驗證及與轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的比較 按方法1.2.10項確定的工藝參數(shù),于42 L 反應(yīng)器中培養(yǎng)48、72、96 h 后收獲病毒,結(jié)果表明,按上述14 L 已摸索接毒工藝,病毒培養(yǎng)96 h 收獲,病毒滴度可穩(wěn)定在108.3TCID50/mL,是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)工藝的10 倍(見表2)。因此,本研究初步建立了一種高效、穩(wěn)定、低成本利用PK-15 細胞反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)PCV2 抗原的生產(chǎn)工藝。

表2 42 L 生物反應(yīng)器培養(yǎng)PCV2 ZJ/C 株毒價驗證

3 討論

應(yīng)用微載體培養(yǎng)技術(shù),初期細胞快速貼附并延展是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵之一,因此,多數(shù)學者趨向于提高細胞初始接種密度和采用間歇攪拌方式。但也有人提出間歇攪拌會使細胞在微載體上貼附不均一,出現(xiàn)空微載體的幾率大大增加[6-7]。本研究發(fā)現(xiàn),當初始接種密度為0.5×106cells/mL 和0.75×106cells/mL時,細胞生長延滯期均較短,細胞密度最大,并沒有因初始接種密度的無限增大而增加細胞密度,進一步說明高接種密度時,細胞會更早進入對數(shù)生長期,細胞受到接觸抑制作用的程度比低接種密度組更強,使得細胞比生長速率下降更快；而采用低轉(zhuǎn)速連續(xù)攪拌效果較好,可使細胞在微載體上均勻分布,對細胞生長影響最小,微載體滿球率更高。

微載體消化放大工藝是指用胰蛋白酶消化上一級反應(yīng)器中貼附于微載體上的細胞,并把細胞或細胞和舊微載體接入下一級更大規(guī)模反應(yīng)器,補加新微載體和新鮮培養(yǎng)基進行新一輪的培養(yǎng)。本研究采用將消化下來的細胞和舊微載體一起接入下一級反應(yīng)器的方法,解決了新舊微載體上細胞貼附不均勻的問題,從而提高了消化放大過程中的細胞回收率,減少了新微載體的消耗。消化放大工藝中存在的種種難題是微載體廣泛應(yīng)用于大規(guī)模生產(chǎn)的障礙,除了細胞培養(yǎng)、消化等設(shè)備的限制,微載體上連續(xù)消化傳代過程中細胞生長速率的急劇下降是普遍面臨的難題。Forestell 等認為培養(yǎng)基中的血清濃度是關(guān)鍵因素,他們證明降低培養(yǎng)基中血清含量可有效緩解MRC-5 細胞在微載體傳代過程中生長速率的下降[8-9]。

本研究通過對PK-15 細胞懸浮馴化及生物反應(yīng)器培養(yǎng)參數(shù)優(yōu)化研究,進一步說明應(yīng)用生物反應(yīng)器系統(tǒng)和微載體懸浮培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)PK-15 細胞,在細胞密度、比生長速率等方面均優(yōu)于傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式；在此基礎(chǔ)上,通過優(yōu)化PCV2 在生物反應(yīng)器培養(yǎng)工藝參數(shù),進行了14 L 至42 L 生物反應(yīng)器消化放大并獲得成功,其病毒滴度較轉(zhuǎn)瓶相比提高了約10 倍,為下一步實現(xiàn)1 000 升級工業(yè)規(guī)模放大工藝奠定了基礎(chǔ)。