應(yīng)用病毒計(jì)數(shù)儀定量檢測(cè)口蹄疫滅活抗原方法的建立

楊小蓉，嚴(yán) 石，許 磊，馬 良

(1.中牧實(shí)業(yè)股份有限公司,北京 豐臺(tái)100070；2.農(nóng)業(yè)部獸用生物制品與化學(xué)藥品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 海淀100095；3.北京市獸用多肽疫苗設(shè)計(jì)與制備工程技術(shù)研究中心,北京 海淀100095)

口蹄疫(Foot-and-Mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染的疫病,主要發(fā)生在牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物,被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為A 類(lèi)傳染病[1]。疫苗的質(zhì)量是防控該疫病的重點(diǎn),抗原含量則決定了疫苗免疫效力[2-4]。我國(guó)目前使用的口蹄疫疫苗主要是滅活疫苗,其安全性和有效性是防控口蹄疫的關(guān)鍵?？谔阋邷缁羁乖臋z測(cè)目前主要依靠蔗糖密度梯度法定量病毒146S 檢測(cè),通過(guò)146S 檢測(cè)的本質(zhì)是完整病毒的相對(duì)物理含量[5]。但該方法操作過(guò)程繁瑣,操作時(shí)間太長(zhǎng),一次能檢測(cè)樣品數(shù)量有限,檢測(cè)效率不高。現(xiàn)有的免疫學(xué)方法檢測(cè)口蹄疫病毒抗原含量,是針對(duì)抗原表位,若抗原位點(diǎn)組成有變化,使用該檢測(cè)方法可能有誤差。即病毒碎片的某些抗原表位只要存在就能被檢測(cè)出,因此,非完整病毒也能被計(jì)數(shù)。在動(dòng)物免疫試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),某些抗原位點(diǎn)不完整對(duì)機(jī)體免疫水平刺激有限,產(chǎn)生的抗體水平甚至達(dá)不到保護(hù)效果[6]。建立快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單、批量操作的口蹄疫滅活病毒抗原定量檢測(cè)方法提高疫苗生產(chǎn)廠家對(duì)于疫苗質(zhì)量的控制能力,對(duì)高效疫苗的研發(fā)具有重要意義。

本試驗(yàn)采用病毒計(jì)數(shù)儀對(duì)口蹄疫滅活病毒粒子進(jìn)行定量檢測(cè),耗時(shí)短,只需10 min,準(zhǔn)確性較高、受干擾因素少,對(duì)口蹄疫疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了較好的方法儲(chǔ)備。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 5 份口蹄疫滅活抗原,平均分為A、B 兩組,A 組用于病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè),B 組用于蔗糖密度梯度146S 檢測(cè),樣品均由中牧實(shí)業(yè)股份有限公司蘭州生物制藥廠提供；超速離心機(jī),購(gòu)自BECKMAN 公司；分光光度計(jì),購(gòu)自紫外可見(jiàn)尤尼柯(上海)儀器有限公司；ViroCyt 病毒計(jì)數(shù)儀和病毒計(jì)數(shù)染色試劑盒(Virus Counter Reagent Kit),均購(gòu)自艾貝泰公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)

1.2.1.1 病毒樣品染色 將A 組5 份滅活抗原樣品在室溫下用14 000 r/min 離心10 min,收集上清用于計(jì)數(shù)檢測(cè)；將20 μL 上清液加入到180 μL 的Sample Dilution Buffer 中；將Combo Dye 工作液混勻,加100 μL 到200 μL 上述樣品管中；將樣品管蓋子蓋上,徹底震蕩混勻；室溫放置30 min,避光染色；染色完的樣品在等待檢測(cè)過(guò)程中,保持避光。

1.2.1.2 病毒樣品檢測(cè) 打開(kāi)病毒計(jì)數(shù)儀,進(jìn)行自動(dòng)清洗。依次完成ISW 液體管、CVF 液體管檢驗(yàn),待顯示“Passed”后,換上PVS 液體管；選擇“PVS”按鈕并顯示“Successful”后,即可進(jìn)行滅活抗原樣品的檢測(cè)。再依次ISW 液體管、CVF 液體管檢驗(yàn)并顯示“Passed”后,裝上待檢樣品,選擇“Start Analysis”按鈕,開(kāi)始分析樣品,并顯示“Collecting Data”。

待檢測(cè)完成后,保存數(shù)據(jù),卸下樣品管。再依次ISW 液體管、CVF 液體管檢驗(yàn)并顯示“Passed”后,即可檢測(cè)第2 個(gè)樣品。直至第3 份樣品檢測(cè)完后,清洗管道并關(guān)機(jī)[4]。

1.2.2 口蹄疫滅活抗原146S 檢測(cè) 將B 組口蹄疫滅活抗原樣品,經(jīng)反復(fù)凍融3 次后,置-20 ℃冰箱中,備用；以5 000 r/min 離心15 min,獲取上清夜,然后再20 000 r/min 高速離心30 min 后取上清夜；接著以100 000 r/min 超速離心2 h,將沉淀用少量PBS 溶解；在離心管中依次加入15%,25%,35%,45%蔗糖,加的時(shí)候用長(zhǎng)針頭從底部往上加的；在超速離心管中加入第3 步所獲取的含抗原樣品,110 000 r/min 離心2.5 h,發(fā)現(xiàn)在25%附近有一條明亮的帶,用長(zhǎng)針頭將不同部位的帶都吸取出來(lái),分別收集到不同的瓶?jī)?nèi)；檢測(cè)用分光光度計(jì)測(cè)定各樣品病毒含量[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)結(jié)果 利用病毒計(jì)數(shù)儀對(duì)A組5 份口蹄疫滅活抗原每個(gè)樣品濃度的檢測(cè)均重復(fù)3 次,平均值分別是6.80×108、3.79×108、1.17×109、9.38×108VP/mL 和4.33×108VP/mL,其變異系數(shù)范圍為1.15%～3.57%,說(shuō)明該方法成立,且結(jié)果可靠。

表1 病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)結(jié)果

2.2 蔗糖密度梯度法定量病毒146S 檢測(cè)結(jié)果 利用蔗糖密度梯度法對(duì)B 組5 份口蹄疫滅活抗原每個(gè)樣品濃度的檢測(cè)均重復(fù)3 次,平均值分別是5.79×109、5.47×109、1.24×109、9.98×108VP/mL和4.42×108VP/mL,其變異系數(shù)范圍為1.48%～5.08%,說(shuō)明該方法結(jié)果可靠。

表2 蔗糖密度梯度法定量病毒146S 檢測(cè)結(jié)果

3 討論

為了比較146S 方法和病毒計(jì)數(shù)儀方法檢測(cè)病毒含量的特點(diǎn),選擇5 份口蹄疫滅活抗原平均分為A 組、B 組(來(lái)自同一批次樣品)進(jìn)行平行檢測(cè)。對(duì)于A 組5 份口蹄疫滅活抗原樣品,病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)結(jié)果平均值分別為6.80×108、3.79×108、1.17×109、9.38×108VP/mL 和4.33×108VP/mL。對(duì)于B 組5 份口蹄疫滅活抗原樣品,蔗糖密度梯度法檢測(cè)146S 結(jié)果平均值則為5.79×109、5.47×109、1.24×109、9.98×108VP/mL 和4.42×108VP/mL。該兩種方法都是為了檢測(cè)病毒完整粒子。B 組的檢測(cè)結(jié)果普遍比A 組高一些,均屬正常,這是由于方法原理不同造成的系統(tǒng)誤差。

蔗糖密度梯度法檢測(cè)146S 原理是,不同顆粒之間存在沉降系數(shù)差時(shí),在離心力作用下,顆粒各自以一定速度沉降,在密度梯度不同區(qū)域上形成區(qū)帶的方法,病毒完整粒子在特定的密度梯度區(qū)帶。在樣品存在雜蛋白的情況下,蔗糖密度梯度法的特定密度梯度區(qū)帶除了病毒完整粒子外,有可能存在雜蛋白,因此與病毒具有同樣沉降系數(shù)的雜蛋白也會(huì)計(jì)數(shù)為病毒粒子。因此蔗糖密度梯度法檢測(cè)口蹄疫146S 抗原,對(duì)儀器設(shè)備要求較高,操作繁瑣,耗時(shí)長(zhǎng),不能進(jìn)行大批量檢測(cè)。如果樣品純化不夠、雜蛋白偏高,由于雜蛋白的影響,蔗糖密度梯度法檢測(cè)口蹄疫146S 抗原則存在檢測(cè)結(jié)果偏高的可能。

而病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)原理是,核酸和病毒衣殼蛋白都同時(shí)被染色、并且同時(shí)通過(guò)計(jì)數(shù)孔的時(shí)候,就計(jì)數(shù)1 個(gè)病毒粒子。病毒計(jì)數(shù)儀檢測(cè)病毒不受雜蛋白影響,因此,結(jié)果也更準(zhǔn)確。

在動(dòng)物疫病的預(yù)防和治療中,總病毒顆粒的定量檢測(cè)對(duì)于病毒疫苗的生產(chǎn)和研究均十分重要,而病毒計(jì)數(shù)儀10 min 就能快速檢測(cè)到病毒的總濃度,優(yōu)勢(shì)明顯[6-7]。因此,病毒計(jì)數(shù)儀定量檢測(cè)病毒抗原耗時(shí)短、受干擾因素少、準(zhǔn)確性較高,對(duì)口蹄疫疫苗的產(chǎn)品質(zhì)量控制提供了一種可采用的方法。