禽源多殺性巴氏桿菌的分離及生物學鑒定

陶 婭，王鉉皓，李軍朝，徐 磊，朱永江，吳鐵花，劉慧謀，王彥紅，3

(1.揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇 揚州225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 揚州225009；3.江蘇省人獸共患病學重點實驗室,江蘇 揚州225009)

多殺性巴氏桿菌(Pm)可以導致家畜和禽類的多種巴氏桿菌病,該菌可引起雞、鴨等禽類的禽霍亂。雞、鴨等禽類暴發(fā)禽霍亂時多表現(xiàn)為突然發(fā)病,同時伴有下痢呈敗血性的癥狀,該病暴發(fā)時其發(fā)病率與死亡率都極高,給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來重大的損失和威脅。禽霍亂主要侵害對象為成年禽類,以性成熟后的禽類最為易感,暴發(fā)季節(jié)主要在夏季、秋季和冬季,這種季節(jié)性的流行主要是由于環(huán)境因素影響造成的[1],因此,2017 年夏、秋季江蘇各地散養(yǎng)禽類暴發(fā)禽霍亂是由于7 ～9 月份溫熱多雨,環(huán)境潮濕,病原菌在場地不能自然凈化。更為嚴重的是該病一旦暴發(fā),在發(fā)病禽類舍飼內(nèi)很難被完全清除,禽霍亂可以在同一場地連續(xù)發(fā)生[2]。將禽霍亂病例進行細菌分離、分子鑒定、藥敏試驗,為該病的臨床用藥和防控提供指導。

1 材料與方法

1.1 試劑 采用購自杭州天和微生物試劑有限公司的綿羊血和瓊脂粉,按照通用組方配置成綿羊血瓊脂平板和麥康凱瓊脂平板。藥敏試紙片,購自杭州天和微生物試劑有限公司。本次試驗所用引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

1.2 細菌分離 2017 年1 月-12 月間于揚州大學動物醫(yī)院畜禽門診部收集禽霍亂病料,共收集到12份病料(詳見表1)。采集病禽的肝臟、心臟和脾臟等主要病變器官,按照無菌要求,用接種環(huán)挑取病料接種于綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上,在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后觀察菌落生長情況,將生長良好的單個菌落進行純化傳代分別接種于綿羊血培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基,并繼續(xù)觀察菌落生長情況。

表1 分離菌株的背景來源

1.3 PCR 方法鑒定多殺性巴氏桿菌及其莢膜血清型 使用煮沸裂解的傳統(tǒng)方法來提取分離菌株中的DNA 模板,再根據(jù)Townsend[3]描述的試驗方法來鑒定分離菌株,先用kmt 引物對分離菌株進行鑒定,再capA 特異性引物鑒定分離菌株的血清型,從而得出分離菌株的莢膜血清型。

1.4 MLST 分析 根據(jù)est、pmi、adk、pgi、mdh、gdh、zwf 這7 個多殺性巴氏桿菌的管家基因?qū)Ψ蛛x菌株進行PCR[4]。將PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳進一步鑒定后,將其送往南京金斯瑞生物科技有限公司進行測序。得到分離菌株所對應的等位基因后上傳至(http://pubmlst.org/pmultocida_rirdc/)以獲取相關(guān)的ST。

1.5 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer 藥敏紙片的方法,選取頭孢曲松、氟苯尼考、美洛西林、多粘菌素B、多西環(huán)素、新霉素、丁胺卡那霉素、卡那霉素、慶大霉素、復方新諾明、鏈霉素、諾氟沙星、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和妥布霉素這15 種藥敏紙片,在無菌條件下,挑取純化后的菌株,在綿羊血瓊脂培養(yǎng)基上劃線涂布均勻后,取藥敏紙片均勻分布貼于瓊脂面上,在37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h 后觀察細菌生長狀況,并且直接測量藥物的抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離 分離所得的12 株細菌在綿羊血瓊脂上生長良好,呈露珠樣無色透明濕潤的針尖大小的菌落。12 株菌株在麥康凱培養(yǎng)基上均不生長。

2.2 PCR 方法鑒定多殺性巴氏桿菌及其莢膜血清型 分離菌株用kmt 引物進行PCR,將產(chǎn)物經(jīng)過電泳后出現(xiàn)約為500 bp 的條帶(圖1),從而進一步確定分離所得菌株為多殺性巴氏桿菌。利用capA 的PCR 引物,對其進行PCR,將產(chǎn)物經(jīng)電泳后出現(xiàn)約為1 000 bp 的條帶(圖2),因此確定分離株為莢膜血清A 型的多殺性巴氏桿菌。

圖1 kmt 基因PCR 檢測結(jié)果

2.3 MLST 分析 根據(jù)adk、est、pmi、zwf、mdh、gdh、pgi 這7 個多殺性巴氏桿菌的管家基因?qū)Ψ蛛x菌株進行PCR,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后分別均出現(xiàn)570 bp、641 bp、739 bp、614 bp、620 bp、702 bp、784 bp 這7條目的條帶(圖3)。測序結(jié)果12 株細菌adk 均為21,est 均為33,pmi 均為26,zwf 均為2,mdh 均為17,gdh 均為20,pgi 均為20。因此,12 株分離株的序列型均為ST-129。

圖2 莢膜血清型PCR 檢測結(jié)果

圖3 MLST 7 個基因PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.4 藥敏試驗 藥敏結(jié)果顯示,對于不同的抗生素分離菌的敏感性不同,12 株多殺性巴氏桿菌的耐藥率分別是:強力霉素(58.3%)、卡那霉素(50%)、環(huán)丙沙星(25%)、鏈霉素(41.7%)、諾氟沙星(25%)、新霉素(33.3%)、復方新諾明(25%)、慶大霉素(8.3%)、左氧氟沙星(8.3%)、美洛西林(8.3%)、菌必治(8.3%)、妥布霉素(8.3%),而對丁胺卡那霉素、氟苯尼考、多粘菌素B 均敏感。

3 討論

3.1 多殺性巴氏桿菌的分離鑒定 從臨床送檢的12 份病料中分離出細菌,經(jīng)PCR 鑒定12 株分離菌都是莢膜血清型A 型的多殺性巴氏桿菌,其序列型皆為ST-129。多殺性巴氏桿菌是動物臨床上危害較大的病原微生物,其宿主廣泛,多種家畜與禽類甚至一部分野生動物都可感染,并且感染后可引起多種的疾病和臨床表現(xiàn)。我國禽源多殺性巴氏桿菌的莢膜血清型以A 型為主,且在江蘇地區(qū)流行株序列型為ST-129,多殺性巴氏桿菌的血清型、序列與其致病性存在一定的聯(lián)系,因此在臨床上建立多殺性巴氏桿菌分離株的快速分型鑒定對了解其致病規(guī)律和感染具有重要的意義[5-7]。多殺性巴氏桿菌常使雞、鴨等禽類爆發(fā)禽霍亂,給我國的禽類養(yǎng)殖市場帶來了巨大的損失和隱患,針對江蘇及周邊地區(qū)流行菌株的基因型單一性現(xiàn)象,使用全價細菌滅活菌苗對于該病的預防可能有較好的作用。

3.2 多殺性巴氏桿菌的藥物治療 12 株分離菌藥敏結(jié)果顯示,該菌對強力霉素和卡那霉素有較強的耐藥性,但不同來源的分離菌株所產(chǎn)生的耐藥性不同。其中12 株多殺性巴氏桿菌僅有兩株對強力霉素敏感,其余10 株均產(chǎn)生不同程度耐藥性。強力霉素抗菌譜廣,且藥物口服后吸收作用快,在體內(nèi)維持時間長,禽類養(yǎng)殖中經(jīng)常使用該藥用以治療和預防疾病。該藥的濫用是臨床上分離菌株產(chǎn)生耐藥性的主要原因。有關(guān)研究表明,不同地區(qū)的多殺性巴氏桿菌其耐藥性具有一定的地域差異性[8]。為了降低耐藥菌株的產(chǎn)生,臨床要科學合理的使用抗生素,使用時要考慮抗生素的質(zhì)量、劑量、療程和使用方法,以減少耐藥性的產(chǎn)生。