琴葉榕根提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶的抑制作用

1.廣東省梅州市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，廣東 梅州 514071；2.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院，廣東 梅州 514031；3.嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 梅州 514031

糖尿病(Diabetes Mellitus，DM)是繼腫瘤、心腦血管疾病之后的嚴(yán)重威脅人類健康的第三大疾病，為全球性公共衛(wèi)生難題[1]。目前，臨床治療糖尿病主要采用化學(xué)藥物療法，但其有效率僅有70%，且長(zhǎng)期連續(xù)服藥會(huì)出現(xiàn)耐藥、胃腸道反應(yīng)和肝臟損害等不良反應(yīng)[2-3]。且2型糖尿病由于胰島素分泌不足及分泌高峰延遲，餐后血糖持續(xù)升高，進(jìn)而引起血管內(nèi)皮損傷、視網(wǎng)膜病變等并發(fā)癥[4]。因此，有效控制餐后血糖上升是防治糖尿病及其并發(fā)癥發(fā)生的重要途徑之一。 α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶是碳水化合物消化為葡萄糖的關(guān)鍵酶，為降低餐后血糖的有效分子靶標(biāo)[5]，目前臨床上廣泛使用的α-葡萄糖苷酶抑制劑，如阿卡波糖，存在胃腸道反應(yīng)[6]。從傳統(tǒng)中草藥中篩選新型的、安全有效的α-葡萄糖苷酶抑制劑已成為研究熱點(diǎn)。

琴葉榕為?？崎艑偾偃~榕FicuspandurataHance，又稱為牛奶樹(shù)根、牛奶子，主要分布于廣東、廣西、江西等地[7-8]，具有清熱、健脾開(kāi)胃、溢氣生津、祛濕化滯等功效，用于祛風(fēng)、去濕、解毒、通乳等[8]。在梅州地區(qū)民間常用琴葉榕的根制作藥膳，用于腰背酸痛、糖尿病、風(fēng)濕病等的輔助治療，但其藥用及食用的科學(xué)內(nèi)涵至今尚未明確，嚴(yán)重制約了琴葉榕根的開(kāi)發(fā)利用[8-9]。實(shí)驗(yàn)以α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶為靶標(biāo)，對(duì)琴葉榕根醇提取物和水提取物進(jìn)行體外降血糖活性的比較研究，為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 試藥 藥材琴葉榕根于2017年5月采購(gòu)于廣東省梅州市梅江區(qū)美苑市場(chǎng)，經(jīng)筆者丘建媚主管中藥師鑒定為桑科榕屬琴葉榕(FicuspandurataHance)的根部。

1.2 試劑 酵母來(lái)源α-葡萄糖苷酶 (α-glucosidase，批號(hào)：SLBT8587，美國(guó) Sigma 公司)； α-淀粉酶(α-amylase，批號(hào)：SLBV0705，美國(guó)sigma 公司)；4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷 (4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG，批號(hào)：K26J8B39810 ，上海源葉科技有限公司)；3,5二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid，批號(hào)：20170904，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；阿卡波糖(Acarbose，批號(hào)：BJ41706，德國(guó)拜耳有限公司)；甲醇和乙腈腈(色譜純，fisher scientific 公司)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 儀器 Alliance2695型高效液相色譜儀(沃特世科技(上海)有限公司)；UV-1800型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(日本島津公司)；MING-CHE 24ΜV型純水儀(法國(guó)Merck Millipore公司)；N-1100V型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)；PB-21型pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性健康昆明種小鼠(由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供合格證號(hào)：SCXK(粵)2018-0002)，體重18～22g。實(shí)驗(yàn)前動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

2 方法

2.1 琴葉榕根提取物的制備 琴葉榕根干品1.0 kg，粉碎，加入適量超純水，回流提取2 h，提取三次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮后得到琴葉榕根水提取物(73.47 g)，備用。

琴葉榕根干品1.0 kg，粉碎，加入適量的95%乙醇，浸泡12 h，超聲輔助提取(45℃，200 W，60 min)三次，過(guò)濾，合并濾液，減壓濃縮后得到琴葉榕根乙醇提取物(90.42g)，備用。

2.2 酶溶液的制備

2.2.1 酵母來(lái)源α-葡萄糖苷酶溶液的制備 將含酶凍干粉用磷酸鹽緩沖溶液(67 mmol/L，pH 6.8)溶解并定容于100 mL容量瓶，即得1.0 U/mL酶溶液，分裝，于-20 ℃冰箱凍存，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.1 U/mL。

2.2.2 小鼠小腸來(lái)源α-葡萄糖苷酶溶液的制備 小鼠小腸來(lái)源α-葡萄糖苷酶參考文獻(xiàn)[10]的方法進(jìn)行提取，采用頸椎脫位的方法處死小鼠，獲得小鼠小腸。分別采用4 ℃預(yù)冷的0.9% NaCl溶液和10 mmol/L的磷酸鈉緩沖液(pH 7.0)清洗腸道脂肪組織，縱向切開(kāi)，洗凈內(nèi)容物，在濾紙上吸干，用剪刀剪碎后分別放入10 mL離心管中，加入4 ℃預(yù)冷的磷酸鈉緩沖液稀釋，置勻漿機(jī)勻漿，后于4 ℃下8000 r/min離心20 min，吸取上清液于10 mL離心管中，即得鼠源α-葡萄糖苷酶，-20 ℃冰箱貯存以備用，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至0.1 U/mL。

2.2.3 α-淀粉酶溶液的制備 將含酶凍干粉用磷酸鹽緩沖溶液(67 mmol/L，pH 6.8)溶解并定容于1000 mL容量瓶，即得500.0 U/mL酶溶液，分裝，于-20 ℃冰箱凍存，使用前解凍并用磷酸鹽緩沖溶液稀釋至3.75 U/mL。

2.3 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性 琴葉榕提取物對(duì)酵母來(lái)源和小鼠小腸來(lái)源α-葡萄糖苷酶抑制實(shí)驗(yàn)的反應(yīng)體系參考文獻(xiàn)[11]方法，并在其基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)，具體如下：將67 mmol/L pH 6.8 的磷酸鹽緩沖溶液250 μL、待測(cè)樣品50 μL(4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0 μg/mL)、0.1 U/mL α-葡萄糖苷酶 300 μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫孵育 20 min，加入4.0 mmol/L pNPG 200 μL，振蕩混勻，37 ℃恒溫反應(yīng) 30 min 后，加入碳酸鈉800 μL 終止反應(yīng)，經(jīng)0.45 μm 膜過(guò)濾后，采用 HPLC 檢測(cè)，按公式(1)計(jì)算對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制率。阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。

α-葡萄糖苷酶抑制率%=(A0-Ai+Aj)/A0×100% 公式(1)

注：A0 為緩沖液+酶液+底物反應(yīng)后的 pNP 濃度；Ai:樣品+酶液+底物反應(yīng)后的 pNP 濃度；Aj:樣品+緩沖液+底物反應(yīng)后的 pNP 濃度。

2.4 色譜條件 色譜柱：XBridge Peptide BEH C18 柱(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動(dòng)相： 乙腈(A)～0.1%甲酸水溶液(B)梯度洗脫條件：0～8 min，20%～30% A；8～13 min，30%～80% A；13～15 min，80%～20% A；15～25 min，20% A。流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)315 nm。

2.5 對(duì)α-淀粉酶的抑制活性 參考文獻(xiàn)[12]，在反應(yīng)體系中分別加入不同質(zhì)量濃度的樣品溶液0.3 mL(4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0 μg/mL)，取0.3 mL α-淀粉酶溶液分別與樣品混合均勻，置于37 ℃水浴中預(yù)溫5 min，加入0.3 mL在37℃水浴中同時(shí)預(yù)溫5 min的1%可溶性淀粉溶液，混勻后反應(yīng)15 min，立即加入0.5 mL DNS顯色并終止反應(yīng)，置于沸水中煮沸5 min，隨后放置于冰水中靜置20 min，磷酸緩沖溶液定容至5 mL，在540 nm下測(cè)吸光值，按公式(2)求得 α-淀粉酶的抑制活性。實(shí)驗(yàn)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照為阿卡波糖，空白對(duì)照為不加樣品和酶液，空白組不加樣品，背景對(duì)照為對(duì)應(yīng)質(zhì)量濃度的樣品及底物溶液(不加酶液和樣品以緩沖液補(bǔ)足)。

抑制率(%)=1-(A空白-A空白對(duì)照)/(A抑制劑-A背景對(duì)照) 公式(2)

注：A空白：空白組吸光值；A空白對(duì)照：空白對(duì)照吸光值；A抑制劑：抑制劑吸光值；A背景對(duì)照：背景對(duì)照吸光值。

3 結(jié)果

3.1 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性 在α-葡萄糖苷酶的作用下，底物pNPG的糖苷鍵斷裂，水解成的亮黃色物質(zhì)對(duì)硝基苯酚(pNP)，pNP在315 nm有最大吸收，可通過(guò)高效液相色譜(HPLC)紫外檢測(cè)器測(cè)定水解生成pNP的量。

3.1.1 精密度試驗(yàn) 在無(wú)抑制劑的條件下，按照2.3項(xiàng)，進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)，同一份樣品，重復(fù)進(jìn)樣6次，根據(jù)6次的pNP峰面積，計(jì)算得到RSD值為0.42%(n=6)，表明HPLC精密度良好。

3.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在無(wú)抑制劑的條件下，按照2.3項(xiàng)，進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)，同一份樣品，分別于0、2、6、12、24 h進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示pNP峰面積的RSD值為0. 60%，表明pNP在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)：在無(wú)抑制劑的條件下，按照2.3項(xiàng)，設(shè)6個(gè)實(shí)驗(yàn)組，分別進(jìn)行活性實(shí)驗(yàn)，根據(jù)6次的pNP峰面積，計(jì)算得到RSD值為0.93%(n=6)，表明方法重復(fù)性良好。

3.1.4 對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率測(cè)定 由圖1可知，無(wú)抑制時(shí)的pNPG和pNP色譜峰保留時(shí)間分別為4.99 min、11.96 min。此外，為考察提取物對(duì)pNPG和pNP的保留時(shí)間、峰型是否有影響，實(shí)驗(yàn)設(shè)不加酶溶液的實(shí)驗(yàn)組，結(jié)果見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，琴葉榕提取物對(duì)pNPG保留時(shí)間、峰型不產(chǎn)生影響。此外，在11.96 min也未檢測(cè)到峰，說(shuō)明琴葉榕提取物在11.96 min沒(méi)有吸收，對(duì)pNP含量的檢測(cè)無(wú)影響，同時(shí)也表明琴葉榕提取物不會(huì)使底物pNPG分解產(chǎn)生pNP，可避免假陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)的發(fā)生。

α-葡萄糖苷酶在抑制劑的作用下，隨抑制劑質(zhì)量濃度的增大，其催化pNPG水解生成pNP的量減少，結(jié)果見(jiàn)圖3(以琴葉榕醇提取物對(duì)酵母來(lái)源α-葡萄糖苷酶的影響為例，其余相同)。圖中pNP(tR=11.96 min)峰面積由小到大對(duì)應(yīng)的琴葉榕醇提取物質(zhì)量濃度依次為4000.0、2000.0、1000.0、500.0、100.0、0.0 μg/mL，表明隨琴葉榕醇提取物質(zhì)量濃度的增大，酶抑制效果越強(qiáng)。

圖1 pNPG和pNP的HPLC

圖2 琴葉榕提取物對(duì)色譜峰的影響

圖3 琴葉榕醇提取物對(duì)酵母來(lái)源α-葡萄糖苷酶的影響

琴葉榕根乙醇提取物抑制酵母來(lái)源和小鼠小腸來(lái)源 α-葡萄糖苷酶的IC50值分別為(128.13±3.28)μg/mL、(531.04±5.72)μg/mL，均顯著低于水提取物(見(jiàn)表1)，提示琴葉榕根乙醇提取物對(duì) α-葡萄糖苷酶的抑制活性強(qiáng)于水提取物。

表1琴葉榕根提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶抑制結(jié)果

樣品IC50 /μg/mLα-葡萄糖苷酶酵母菌來(lái)源小鼠小腸來(lái)源α-淀粉酶阿卡波糖2872.12±4.241321.03±4.55 29.57±1.44水提取物1923.45±3.24?2232.27±5.76?1141.28±1.23?乙醇提取物 128.13±3.28?#531.04±5.72?#714.25±4.37?#

注：與對(duì)照組阿卡波糖比較，*P<0.05；與樣品組水提取物比較，#P<0.05。

3.2 對(duì)α-淀粉酶的抑制活性 琴葉榕根乙醇提取物對(duì)α-淀粉酶的IC50值為(714.25±4.37)μg/mL，顯著低于水提取物(1141.28±1.23)μg/mL(P<0.05)，提示琴葉榕根乙醇提取物對(duì)α-淀粉酶的抑制活性強(qiáng)于水提取物(見(jiàn)表1)。

4 討論與結(jié)論

琴葉榕在客家地區(qū)常作滋補(bǔ)湯料，配以龍骨、雞肉煲湯，用于祛濕、降糖等。據(jù)《江西民間草藥驗(yàn)方》、《福建中草藥》等客家地區(qū)經(jīng)典著作記載，牛奶樹(shù)根祛風(fēng)除濕、清熱解毒、活血行氣、舒經(jīng)通絡(luò)等功效明顯[13]。琴葉榕藥用和食用價(jià)值高，市場(chǎng)經(jīng)濟(jì)價(jià)值潛力巨大，但其現(xiàn)代藥學(xué)研究薄弱。實(shí)驗(yàn)以琴葉榕根為研究對(duì)象，對(duì)其醇提取物和水提取物進(jìn)行降血糖活性評(píng)價(jià)，并進(jìn)行活性差異的比較研究，結(jié)果表明，琴葉榕根乙醇提取物和水提取物對(duì)兩種來(lái)源α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶均具有顯著的抑制活性，其中乙醇提取物抑制活性強(qiáng)于水提取物。結(jié)果提示應(yīng)聚焦于琴葉榕根乙醇提取物，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)的化學(xué)成分、藥理活性研究，明確藥效物質(zhì)基礎(chǔ)以及作用機(jī)制，推動(dòng)琴葉榕的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。