PmOmpA的結(jié)構(gòu)與功能研究及其在疾病防控中的應(yīng)用

林澤鋒，黃蘭香，雷桂花，李 攀，彭遠(yuǎn)義

(西南大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，重慶北碚400715)

多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida，Pm)是一種條件性致病菌，屬革蘭氏陰性菌，分為A、B、D、E 和F 5個(gè)莢膜血清型和16 (1～16)個(gè)LPS 血清型[1]。對(duì)其分型時(shí)常將兩種方法組合使用，如A:1，B:2 分型等。其中A:1或A:3 主要引起禽霍亂或牛呼吸系統(tǒng)疾病，B:2 或E:5 主要引起出血性敗血癥(Haemorrhagic septicaemia，HS)，D型主要引起豬萎縮性鼻炎(Atrophic rhinitis，AR)[1-2]。Pm還能夠感染寵物、野生動(dòng)物和人[3]。畜禽感染Pm 后，引起高發(fā)病率和死亡率，給養(yǎng)殖業(yè)造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。

外膜(Outer membrane，OM)是革蘭氏陰性菌抵御外來(lái)攻擊和選擇性滲透親水性小物質(zhì)的非對(duì)稱(chēng)性屏障[4]。外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMPs)作為OM 的重要成分，約占OM 質(zhì)量的50%，具有參與細(xì)菌-宿主間的相互作用、選擇性滲透和適應(yīng)外部環(huán)境等功能[4]。結(jié)合電泳和質(zhì)譜分析，共篩選到35 個(gè)Pm OMPs[3]。目前研究較多的Pm OMPs 有OmpA、OmpH、TolC、plpE 等[3]。Hatfaludi等根據(jù)功能將Pm 72 個(gè)OMPs 和OM 相關(guān)蛋白分為結(jié)構(gòu)蛋白、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、結(jié)合蛋白、粘附蛋白、外膜蛋白組裝蛋白和膜相關(guān)酶6 類(lèi)，其中Pm 外膜蛋白A (Pasteurella multocidaOuter membrane protein A，PmOmpA)屬于結(jié)構(gòu)蛋白[4]。

PmOmpA 在維持細(xì)菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性、細(xì)菌-宿主間相互作用、生物被膜形成和物質(zhì)交換等方面發(fā)揮重要作用；同時(shí)還誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答和承受宿主選擇性壓力，因此常作為重要的疫苗候選抗原和流行病學(xué)短期跟蹤研究的靶標(biāo)[5-6]。本文將對(duì)PmOmpA的結(jié)構(gòu)和功能，其作為疫苗候選抗原和流行病學(xué)靶標(biāo)的相關(guān)研究進(jìn)行綜述，以期為Pm 病的防控、新型疫苗研制和流行病學(xué)調(diào)查提供參考。

1 PmOmpA的結(jié)構(gòu)

關(guān)于細(xì)菌OmpA 結(jié)構(gòu)研究最多的是大腸桿菌OmpA(EcOmpA)，其可能存在小通道構(gòu)象、大通道構(gòu)象和二聚體3 種結(jié)構(gòu)[7-8]。但關(guān)于PmOmpA 只有小通道構(gòu)象的報(bào)道[9]，尚無(wú)關(guān)于其大通道構(gòu)象和二聚體的文獻(xiàn)。利用SWISSMODEL[9]以EcOmpA N 端(SMTL id：2ge4.1.A)和C 端(SMTL id：2mqe.1.A)為模板分別模擬構(gòu)建小通道構(gòu)象PmOmpA N 端和C 端的3D 結(jié)構(gòu)(圖1)；利用DNAMAN 8[10]對(duì)7 個(gè)OmpA 家族蛋白PmOmpA、EcOmpA、鮑曼不動(dòng)桿菌OmpA (AbOmpA)、豬放線桿菌OmpA (AsOmpA)、溶血性曼氏桿菌OmpA (MhOmpA)、鼠疫耶爾森氏菌OmpA(YpOmpA)和流感嗜血桿菌P5 (P5)的氨基酸序列進(jìn)行比較分析(圖2)，結(jié)果顯示OmpA 氨基酸序列同源性高達(dá)55.07 %。

圖1 模擬構(gòu)建PmOmpA N 端(A)和C 端(B)的3D 結(jié)構(gòu)

1.1 PmOmpA 小通道構(gòu)象 小通道構(gòu)象PmOmpA 包含N 端和C 端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域(圖1)。依據(jù)aa176 ～aa187 的Ala-Pro 重復(fù)，將EcOmpA 分為N 端和C 端兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，N 端錨定在OM，C 端位于周質(zhì)腔內(nèi)[11]。目前并不清楚PmOmpA 為何缺失Ala-Pro 重復(fù)，其缺失可能會(huì)影響PmOmpA 的組裝及孔通道形成[11]。

PmOmpA N 端約含213 個(gè)氨基酸殘基。aa1～aa21 為信號(hào)肽、信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)Ala21～Ala22/Val22[12](圖2)。N 端由8 個(gè)β-桶狀分子反向平行構(gòu)成β-桶狀結(jié)構(gòu)，在OM 外形成4 個(gè)親水環(huán)狀結(jié)構(gòu)(L1～L4)，在周質(zhì)腔形成3個(gè)轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)(T1～T3)[12](圖1A 和圖2)。β-桶狀結(jié)構(gòu)擁有非極性外表面和極性內(nèi)表面[12-13]。β-桶狀結(jié)構(gòu)外表面的芳香族氨基酸和堿性氨基酸分別與OM 脂質(zhì)頭部和磷酸基團(tuán)相互作用，將PmOmpA 錨定在脂膜中[13]。內(nèi)表面構(gòu)成親水性通道，選擇性滲透親水性小分子物質(zhì)[12]。PmOmpA拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，其最長(zhǎng)的環(huán)狀結(jié)構(gòu)L3 含21 個(gè)氨基酸[11]。缺失或突變狀環(huán)結(jié)構(gòu)不影響β-桶狀結(jié)構(gòu)的組裝，但在轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)插入幾個(gè)氨基酸將降低β-桶狀結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[14]。

PmOmpA C 端約含135 個(gè)氨基酸殘基。C 端的4 個(gè)α螺旋和4 個(gè)β 折疊構(gòu)成βααβαβαβ 混合結(jié)構(gòu)(圖1B 和圖2)。包括PmOmpA 在內(nèi)的OmpA 家族C 端中與R286、D271 和K192 等位的氨基酸、NX2LSX2RAX2VX3L 區(qū)域、bulge 結(jié)構(gòu)以及二硫鍵均是保守的(圖2)，但AbOmpA bluge 結(jié)構(gòu)是不保守的，且不含二硫鍵。

1.2 OmpA 大通道構(gòu)象 EcOmpA 大通道構(gòu)象由小通道構(gòu)象的C 端插入OM 與N 端共同構(gòu)成含16 個(gè)β-桶狀分子的β-桶狀結(jié)構(gòu)[7,15]。溫度、二硫鍵C290-C302 (圖2)和N 端的寡聚-(R)-3-羥基丁酸修飾是形成大通道的關(guān)鍵[15]。溫度高于37 ℃時(shí)，EcOmpA 小通道構(gòu)象不可逆地轉(zhuǎn)化成大通道構(gòu)象，推測(cè)大通道構(gòu)象是最終構(gòu)象，而小通道構(gòu)象僅是過(guò)渡態(tài)[15]。雖然目前尚未有關(guān)大通道構(gòu)象PmOmpA的報(bào)道，但其也擁有關(guān)鍵的二硫鍵(圖2)，推測(cè)升高溫度后PmOmpA 也能夠形成大通道構(gòu)象。

1.3 OmpA 二聚體 Tan 等發(fā)現(xiàn)，EcOmpA C 端間可以形成二聚體，穩(wěn)定EcOmpA 結(jié)構(gòu)[16]。Ishida 等發(fā)現(xiàn)溫度(≥37 ℃)是EcOmpA 二聚化的關(guān)鍵因素，高溫通過(guò)降低C 端bulge 結(jié)構(gòu)(圖2)的穩(wěn)定性，激發(fā)EcOmpA 二聚化[15]。在EcOmpA 二聚體的維持中，K192 與E310、E312 間的鹽橋、Q190、Q223 和N288 的非特異極性作用、N 端環(huán)狀結(jié)構(gòu)L1、L2 和L4 間的極性作用和疏水性作用以及β-桶狀分子中的芳香族氨基酸均發(fā)揮一定的作用[7]。Marcoux等發(fā)現(xiàn)K192 的作用尤為重要，K192 突變?yōu)锳192 后，大部分EcOmpA 以單體形式存在[8]。目前尚無(wú)PmOmpA 二聚體的報(bào)道，但其擁有相似的bulge 結(jié)構(gòu)和與K192、E310 等位的氨基酸(圖2)，推測(cè)其也能形成二聚體結(jié)構(gòu)。溫度(≥37 ℃)是形成二聚體和大通道構(gòu)象的重要因素，因此Ishid 等猜測(cè)在該溫度的激發(fā)下二聚體最終將轉(zhuǎn)化為大通道構(gòu)象[15]。

多序列比對(duì)7 個(gè)OmpA 家族蛋白：PmOmpA、EcOmpA、AbOmpA、AsOmpA、MhOmpA、YpOmpA 和P5?！硎綪mOmpA 信號(hào)肽酶切割位點(diǎn)；T1～T3 和L1～L4 分別表示PmOmpA N 端的轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)；β1 ～β4 和α1～α4 分別表示PmOmpA C 端的β 折疊和α 螺旋；和分別表示起始于周質(zhì)腔和OM 外的假定β-桶狀分子；------表示保守的NX2LSX2RAX2VX3L 序列；▲表示PmOmpA D272 和R287 位置，分別與AbOmpA D271和R286 等價(jià)；矩形框表示可能的bulge 結(jié)構(gòu)；表示C 端形成的二硫鍵；★表示EcOmpA Q190、Q223 和N288；◆表示EcOmpA K192；表示EcOmpA E310 和E312；表示EcOmpA K267、K294 和D291。

圖2 利用DNAMAN 8 多序列比對(duì)PmOmpA 和其它OmpA 家族蛋白的氨基酸序列

2 PmOmpA 的功能

2.1 維持細(xì)菌形態(tài)和結(jié)構(gòu)完整性 目前認(rèn)為細(xì)菌OmpA最主要的功能是與肽聚糖非共價(jià)結(jié)合，維持OM 穩(wěn)定和細(xì)菌結(jié)構(gòu)的完整性。缺失AbOmpA 會(huì)改變細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，降低細(xì)菌的穩(wěn)定性[17]。

Koebnik 等研究顯示，EcOmpA C 端中可能與肽聚糖相互作用的保守氨基酸，位于α-螺旋一側(cè)NX2LSX2 RAX2VX3L(圖2 顯示為α3 螺旋)[15]。Park 等發(fā)現(xiàn)，AbOmpA C 端高度保守的R286 和D271 與肽聚糖二氨基庚二酸(m-DAP)的羧基和/或氨基形成鹽橋[17]。Tan 等通過(guò)鼠傷寒沙門(mén)氏菌OmpA (StOmpA)晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)了肽聚糖結(jié)合槽，該肽聚糖結(jié)合槽由C 端α 螺旋α1、α2 和α3以及連接結(jié)構(gòu)α1～α2、β2～α3 和α4～β4 構(gòu)成[16]。肽聚糖結(jié)合槽的發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步佐證了NX2LSX2RAX2VX3L 和R286 與D271 的作用。圖2 顯示，R286 位于α3 螺旋的NX2LSX2RAX2VX3L 序列，D271 位于β2 ～α3，均位于肽聚糖結(jié)合槽中。PmOmpA 也含有相似的NX2LSX2 RAX2VX3L 序列、與D271 和R286 等價(jià)的氨基酸位點(diǎn)以及與肽聚糖結(jié)合槽相似的結(jié)構(gòu)，推測(cè)PmOmpA 也能與肽聚糖非共價(jià)結(jié)合，參與維持OM 穩(wěn)定和細(xì)菌結(jié)構(gòu)的完整。

Carpenter 等發(fā)現(xiàn)低鹽環(huán)境中，由于PmOmpA C 端K205 和E236 分別與OM 磷脂和膽堿靜電吸引，C 端即靠近OM；而高鹽環(huán)境(1 mol/L NaCl)中，Na+和Cl-屏蔽脂質(zhì)分子和C 端氨基酸的電荷，降低靜電吸引，C 端即遠(yuǎn)離OM[13]。Samsudin 等發(fā)現(xiàn)EcOmpA C 端也能與OM 結(jié)合，其認(rèn)為C 端與肽聚糖結(jié)合時(shí)，OM 與C 端間的靜電吸引會(huì)扭曲肽聚糖的結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞壁的完整性[18]。

雖然單體EcOmpA 會(huì)扭曲肽聚糖的結(jié)構(gòu)，但EcOmpA二聚體卻能避免該情況。Marcoux 等發(fā)現(xiàn)二聚體結(jié)構(gòu)能穩(wěn)定EcOmpA 的整體結(jié)構(gòu)，并推測(cè)其能夠增強(qiáng)與肽聚糖的結(jié)合[8]。后來(lái)Samsudin 等發(fā)現(xiàn)，EcOmpA 二聚體通過(guò)增加C 端底部的負(fù)電荷和延伸N 端與C 端的連接結(jié)構(gòu)，促進(jìn)C 端與肽聚糖的結(jié)合[19]。Ortiz-Suarez 等發(fā)現(xiàn)EcOmpA 二聚體還能降低介導(dǎo)OM 和C 端結(jié)合的aa280～aa300 位的靈活性和接觸面，阻止C 端與OM 的結(jié)合，從而增強(qiáng)OM的穩(wěn)定性和細(xì)菌結(jié)構(gòu)的完整性[7]?；赑mOmpA 可以形成二聚體結(jié)構(gòu)，推測(cè)PmOmpA 也能通過(guò)增加C 端底部的負(fù)電荷、延伸N 端與C 端間的連接結(jié)構(gòu)和降低C 端中與OM 結(jié)合的氨基酸的靈活性和接觸面，促進(jìn)PmOmpA 與肽聚糖的結(jié)合。

2.2 細(xì)菌-宿主間相互作用 Dabo 等利用抗PmOmpA抗體預(yù)處理Pm 后，降低了細(xì)菌對(duì)細(xì)胞基質(zhì)中纖連蛋白(Fn)的粘附性[11]。他們也確實(shí)在環(huán)狀結(jié)構(gòu)L2 中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)K/R-X-K/R HP 結(jié)合位點(diǎn)。而重組表達(dá)的rPmOmpA 蛋白不僅能與Fn 結(jié)合，還能與MDBK 細(xì)胞和細(xì)胞基質(zhì)的肝素(HP)結(jié)合[11]。但只有未經(jīng)熱處理的rPmOmpA 能結(jié)合HP，而熱處理的rPmOmpA 不能結(jié)合HP，表明構(gòu)象影響PmOmpA 與HP 的結(jié)合[11]。而Shailja 等發(fā)現(xiàn)含不同亞型PmOmpA 的牛源Pm 與宿主的相互作用強(qiáng)度也不相同，OmpA allele(I)型Pm 對(duì)MDBK 細(xì)胞的粘附侵襲能力和對(duì)小鼠的定殖能力和致病性均高于OmpA allele(Ⅱ)型Pm[20]。

關(guān)于PmOmpA 與宿主相互作用的位點(diǎn)，目前僅證實(shí)了HP 的結(jié)合位點(diǎn)，但通過(guò)預(yù)測(cè)還發(fā)現(xiàn)了其它可能的結(jié)合位點(diǎn)。E-Kobon 等預(yù)測(cè)牛源菌株P(guān)mOmpA 環(huán)狀結(jié)構(gòu)L1～L3 的帶電氨基酸可能與宿主特異性結(jié)合有關(guān)，而豬源菌株卻無(wú)該現(xiàn)象，推測(cè)這些帶電氨基酸不參與引起豬慢性肺炎[18]。Verma 等在PmOmpA C 端中發(fā)現(xiàn)了10 個(gè)可能參與Pm 粘附和侵襲的保守氨基酸，并發(fā)現(xiàn)了Arg-Gly-Asp(RGD)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域能與宿主受體特異性結(jié)合，促進(jìn)細(xì)菌的粘附[12]。依據(jù)Stathopoulos 提出的大通道構(gòu)象，E-cOmpA C 端會(huì)在OM 外形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)[7,15]。推測(cè)PmOmpA在形成大通道構(gòu)象時(shí)，C 端RGD 結(jié)構(gòu)域會(huì)裸露在OM 外，參與細(xì)菌-宿主間的相互作用。

2.3 生物被膜形成 Kubera 等發(fā)現(xiàn)能夠結(jié)合PmOmpA 環(huán)狀結(jié)構(gòu)或環(huán)狀結(jié)構(gòu)間的藥物，這些藥物雖然不會(huì)影響已形成的生物被膜，但能夠有效抑制生物被膜的形成[1]。Orme等發(fā)現(xiàn)大腸桿菌在形成生物被膜時(shí)，EcOmpA 呈高水平表達(dá)[21]。Viviana 等發(fā)現(xiàn)AbOmpA 的過(guò)表達(dá)與鮑曼不動(dòng)桿菌引起的肺炎、菌血癥和死亡有關(guān)[22]。本研究室發(fā)現(xiàn)，在小鼠體內(nèi)，Pm 強(qiáng)毒株P(guān)mCQ2 PmOmpA 表達(dá)量高于弱毒株P(guān)mCQ6，而體外結(jié)果卻是相反的[23]。推測(cè)高水平表達(dá)PmOmpA 能夠促進(jìn)Pm 生物被膜的形成和粘附，增強(qiáng)Pm的致病性。生物被膜在為細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、群體感應(yīng)、耐藥和定植等方面發(fā)揮重要作用[24]。因此可以將PmOmpA 作為候選藥物靶標(biāo)，治療巴氏桿菌病。

2.4 物質(zhì)交換 在大腸桿菌OMPs 中，OmpA、OmpF 和OmpC 孔通道直徑相似，但由于OmpA β-桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)的鹽橋網(wǎng)能夠控制通道的開(kāi)放和關(guān)閉，因此OmpA 控制物質(zhì)進(jìn)出的速率比后兩者低兩個(gè)數(shù)量級(jí)[7,13,25]。Carpenter 等發(fā)現(xiàn)PmOmpA β-桶狀結(jié)構(gòu)內(nèi)也可以形成類(lèi)似的鹽橋網(wǎng)，其中鹽橋R156～E58 和E146～K93 關(guān)閉孔通道，而氨基酸的質(zhì)子化或去質(zhì)子化會(huì)改變鹽橋結(jié)合狀態(tài)，形成新的鹽橋R156～E146 和E58～K93，開(kāi)放孔通道[13]。在大腸桿菌中，雖然OmpF 的轉(zhuǎn)運(yùn)速率快于OmpA，但研究顯示OmpA 卻能夠轉(zhuǎn)運(yùn)分子量更大的物質(zhì)[25]。EcOmpA 大通道構(gòu)象解釋了OmpA 為何能夠轉(zhuǎn)運(yùn)更大物質(zhì)，但由于大通道構(gòu)象的存在尚有爭(zhēng)議，因此大通道構(gòu)象轉(zhuǎn)運(yùn)更大物質(zhì)的假設(shè)尚未有定論。有研究顯示，其它OmpA 還參與細(xì)胞毒性因子分泌[26]、dsDNA 轉(zhuǎn)運(yùn)[27]以及氨基酸攝取[15]。雖然PmOmpA 尚無(wú)該方面的報(bào)道，但推測(cè)PmOmpA 也能夠參與多種物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)細(xì)菌的致病性或發(fā)揮生理功能。

3 作為疫苗候選抗原

PmOmpA 是暴露在OM 外的高免疫原性蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，常作為重要的疫苗候選抗原[28]。E-Kobon 等發(fā)現(xiàn)N 端環(huán)狀結(jié)構(gòu)L1～L3 和L1 可能分別為牛源和部分豬源Pm 的抗原表位[5]。Gong 等發(fā)現(xiàn)Pm pOmpA DNA 疫苗能夠誘導(dǎo)Th1 型免疫應(yīng)答和高水平抗體滴度，為禽提供部分保護(hù)作用；pOmpA+pOmpH 二價(jià)疫苗和pOmpHA 融合疫苗也能夠提供比弱毒疫苗更強(qiáng)的保護(hù)作用[28]。而Dabo 等發(fā)現(xiàn)，rPmOmpA 雖然能夠誘導(dǎo)Th2 細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)勁的免疫應(yīng)答和高滴度IgG1，但不能為小鼠提供免疫保護(hù)，添加rPmOmpA 反而降低OMPs 的免疫保護(hù)效果[29]。抗PmOmpA 單克隆抗體也不能提供保護(hù)作用[4,28]。因此，Gong 等認(rèn)為PmOmpA 的免疫效果尚不確定[28]。

4 作為流行病學(xué)研究靶標(biāo)

受不同宿主選擇性壓力影響，OMPs 呈不同程度的異質(zhì)性[5]。PmOmpA 短期內(nèi)不會(huì)發(fā)生劇烈突變，但由于其突變率高于看家基因，因此常作為流行病學(xué)短期跟蹤的研究靶標(biāo)[5-6]。

Davies 等根據(jù)OmpA 與OmpH 分子質(zhì)量的異質(zhì)性和次要蛋白間的差異，將Pm 菌株分為不同的OMP 型[30-33]。結(jié)合莢膜血清型與OMP 型，顯示F/1.1、F/1.2、D/3.1 和D/3.2 菌株主要與綿羊肺炎有關(guān)，分離自健康母羊生殖道的主要是A/1.2、F/1.1 和F/2.1 菌株[33]。88 %的豬肺炎由不含毒素的OMP 型1.1、2.1、3.1 和5.1 的A 型菌株以及不含毒素的OMP 型為6.1 的D 型菌株引起，76 %的豬萎縮性鼻炎(PAR)由含毒素的OMP 型4.1 的D 型菌株和含毒素的OMP 型6.1 的A 型菌株引起[30]。將Pm 宿主源性和OMP 型結(jié)合得到16 個(gè)OMP 組，分析顯示4 組OMP菌株會(huì)在牛、豬和禽之間相互傳播，16 組OMP 菌株會(huì)在豬和禽間傳播，而大部分禽源(1、2、5、10、12 和13 組OMP)、牛源(1、6、9、11 和14 組OMP)、綿羊源(2、3和15 組OMP)和豬源(1、2、5 和8 組OMP)菌株不會(huì)在宿主間傳播[32]。OMP 型無(wú)法區(qū)分引起禽霍亂的菌株，這與禽源Pm 適應(yīng)多種生態(tài)位有關(guān)[31]。也無(wú)法用OMP 型區(qū)分牛源Pm 所引起的疾病和地域來(lái)源，但85 %的菌株OMP 型為1.1、2.1、3.1、4.1 和6.1 (共13 個(gè)OMP 型)[32]。

雖然OMP 型在一定程度上能夠反應(yīng)Pm 菌株間的差異，但不能直觀顯示不同血清型或不同宿主源菌株P(guān)mOmpA 核苷酸序列或氨基酸序列間的差異，因此利用PmOmpA 核苷酸序列或氨基酸序列對(duì)Pm 進(jìn)行分型，追蹤菌株的宿主源是有必要的。Singh 等發(fā)現(xiàn)A 型菌株OmpA與B:2 菌株的氨基酸序列和核苷酸序列的同源性分別為83.8 %和80 %[34]。且A 型Pm PmOmpA 核苷酸序列比B型菌株的短[12]。Vougidou 等將PmOmpA 核苷酸序列分為11 個(gè)基因型(ompA1～ompA11)，發(fā)現(xiàn)ompA4、ompA5 和ompA7 為牛源菌株的主要基因型，羊源菌株基因型主要為ompA8 ～ompA11，豬源菌株基因型主要為ompA1 ～ompA3，但發(fā)現(xiàn)1 株牛源和2 株羊源菌株的基因型與豬源菌株的更近[6]。Verma 等依據(jù)PmOmpA 氨基酸序列將Pm分為Ⅰ～Ⅶ4 個(gè)組，每個(gè)組包含若干OmpA 型，如Ⅰ組含1.1～1.4 4 個(gè)OmpA 型[12]。該組大部分為牛源菌株，但2 株兔源和1 株羊源菌株屬于1.2 型，1 株羊源菌株屬于1.3 型。Ⅶ組中OmpA 7.2 型由3 株禽源和1 株牛源菌株組成。基于PmOmpA 核苷酸序列和氨基酸序列的聚類(lèi)，Teerasak 等發(fā)現(xiàn)豬源(P1～P4)和牛源(C1、C2)菌株均屬于各自的分支，除牛源菌株1C 和12C 屬于豬源分支，表明1C 和12C 原來(lái)的宿主為豬[5]。Teerasak 等進(jìn)一步根據(jù)PmOmpA 高突變環(huán)狀結(jié)構(gòu)的氨基酸序列將Pm 分為30 個(gè)LST 型，牛源菌株主要屬于LST19 和LST8，豬源菌株主要屬于LST12(P1)、LST15(P2)和LST18(P3)[5]。其中，LST12 和LST15 的豬源菌株莢膜血清型為A 型，LST18的豬源菌株則為D 型，表明PmOmpA LST 分型可以用于區(qū)分豬源Pm 的不同血清型。

5 展 望

Carpenter 等模擬構(gòu)建了PmOmpA 小通道構(gòu)象[13]，而PmOmpA 二聚體和大通道構(gòu)象仍停留在推測(cè)階段。因此，可借鑒晶體學(xué)和波譜學(xué)等方法，研究PmOmpA 小通道構(gòu)象、二聚體和大通道構(gòu)象的結(jié)構(gòu)。蛋白結(jié)構(gòu)決定其功能，但并不能完全表明蛋白在細(xì)菌中的作用?？梢酝ㄟ^(guò)基因敲除技術(shù)，深入研究PmOmpA 的生物學(xué)功能。

PmOmpA DNA 疫苗能夠同時(shí)誘導(dǎo)體液免疫和Th2 細(xì)胞應(yīng)答(細(xì)胞免疫)，并且提供有效的保護(hù)作用[19]。而rP-mOmpA 蛋白僅能夠誘導(dǎo)Th1 細(xì)胞應(yīng)答(體液免疫)，且不提供有效的保護(hù)作用[4]。提示PmOmpA DNA 疫苗是通過(guò)誘導(dǎo)宿主的細(xì)胞免疫發(fā)揮抗感染作用，而體液免疫可能不參與該過(guò)程。與PmOmpA 同源的P5 蛋白，其N(xiāo) 端環(huán)狀結(jié)構(gòu)L4 為能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體卻不能提供保護(hù)作用的誘騙型表位[21]。因此，推測(cè)PmOmpA 可能含類(lèi)似的誘騙型表位，參與逃避宿主的免疫應(yīng)答。所以，含PmOmpA 的DNA 疫苗、OMVs 疫苗、OMPs 疫苗和全菌滅活疫苗等，可能會(huì)因此降低疫苗的保護(hù)效果。優(yōu)化PmOmpA 抗原表位或者制備不含PmOmpA 的疫苗，可能會(huì)得到更好的保護(hù)效果。

PmOmpA 作為流行病學(xué)短期跟蹤研究靶標(biāo)，將Pm 分為多個(gè)與宿主存在一定聯(lián)系的亞型，并發(fā)現(xiàn)可能發(fā)生宿主轉(zhuǎn)移的菌株。但若轉(zhuǎn)移后菌株的PmOmpA 適應(yīng)了新宿主的選擇性壓力，僅依靠PmOmpA 分型是無(wú)法追蹤Pm 真正的宿主來(lái)源。因此，將PmOmpA 分型結(jié)合MLST 分型和/或基于基因組的遺傳進(jìn)化分析，能夠更好地追蹤Pm的宿主源及研究其適應(yīng)性突變。