腸道外致病性大腸桿菌外膜蛋白研究進展

許 姝，張 東，魏 星，武琥琮，劉家奇，王 亨，朱國強

(1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州225009；2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州225009)

腸道外致病性大腸桿菌病(Extraintestinal pathogenicEscherichia coli，ExPEC)是一種常發(fā)腸道外疾病，危害人類、動物的健康，也導致禽類產(chǎn)蛋量的下降及肉用動物的上市延遲，嚴重的則引起死亡。因此，對于腸道外致病性大腸桿菌的致病機制也是許多學者研究的熱點，腸道外致病性大腸桿菌致病機理的研究近些年主要集中在脂多糖(LPS)、外膜蛋白(Outer membrane protein，Omp)、菌毛、鞭毛、等毒力因子方面[1]。

Omp 是腸道外致病性大腸桿菌中含有的獨特的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)的外膜，該結(jié)構(gòu)在增強細菌黏附侵襲能力、物質(zhì)運輸及相關(guān)功能物質(zhì)的合成等方面發(fā)揮重要作用[2]，并且也能夠幫助細菌抵抗宿主免疫系統(tǒng)靶向識別的清除(表1)。因此，深入了解Omp 為探究禽致病性大腸桿菌致病機制奠定理論基礎(chǔ)。

1 腸道外致病性大腸桿菌病Omp的組成及理化性質(zhì)

Omp 是鑲嵌在革蘭氏陰性菌外膜層中多種蛋白質(zhì)的統(tǒng)稱[2]。研究表明，大腸桿菌的外膜具有獨特的曲折成波浪形狀的典型非對稱性液態(tài)脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)[3]。OMP是整合膜蛋白，由一組β 鏈構(gòu)造出β 桶空間結(jié)構(gòu)，穿透生物外膜并在整個蛋白質(zhì)生命周期內(nèi)均生存在外膜上。在周質(zhì)側(cè)鏈之間具有短環(huán)，并且在胞外側(cè)具有大的延伸環(huán)。Omp β 桶內(nèi)部的區(qū)域可能是中空的，也可能填充部分磷脂雙層分子，或者附著一些生物小分子。迄今為止，幾乎所有這個類型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)均以反向平行的方式排列偶數(shù)個β 鏈。這種結(jié)構(gòu)特征有助于Omp 在膜中保持高穩(wěn)定性，幫助病壓菌抵抗惡劣和多變的環(huán)境。Omp 也可以利用此β 桶結(jié)構(gòu)進行外膜內(nèi)外環(huán)境的相互交流，有些Omp能夠直接允許離子通過，甚至可以讓水分子通過，有些則選擇性允許生物小分子通過，其選擇性主要通過Omp 的非跨膜部分實現(xiàn)。細菌Omp 的C 末端結(jié)構(gòu)域是面向周質(zhì)空間的球狀蛋白質(zhì)，其與肽聚糖非共價相互作用，提供穩(wěn)定性和細胞完整性。Omp 暴露于細菌細胞外部，是細菌與其周圍環(huán)境之間的第一屏障。鑒于其的關(guān)鍵位置，Omp充當許多不同的角色，比如作為毒力的粘附因子，吸收營養(yǎng)素的通道，鐵載體受體和酶(例如蛋白酶和脂肪酶)[4]。目前對腸道外致病性大腸桿菌病Omp 的熱修飾蛋白(OmpA)、微孔蛋白(OmpC、OmpF)的結(jié)構(gòu)與功能了解得較為詳細。不僅如此，利用對該3 個蛋白的研究，奠定了后來對許多Omp 性質(zhì)研究的基礎(chǔ)。

OmpA 蛋白，通過分析其結(jié)構(gòu)域，了解該蛋白包括信號肽、N 末端OmpA 結(jié)構(gòu)域和C 末端配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域。OmpA 的跨膜拓撲在周質(zhì)末端表現(xiàn)為短轉(zhuǎn)角，在胞外末端具有較長的不規(guī)則環(huán)。其C 端序列保守，可能在系統(tǒng)進化中發(fā)揮著重要作用。N 端構(gòu)成8 個跨膜反向平行的β桶狀結(jié)構(gòu)域，膜的外表面由4 個環(huán)(L1、L2、L3、L4)組成，周質(zhì)面由3 個短轉(zhuǎn)角(L1、L2、L3、L4)折疊組成。一些研究表明，OmpA 的N-末端部分及其表面暴露的不規(guī)則環(huán)有助于與HBMEC (Human brain microvascular endothelia cell，HBMEC)結(jié)合[5]。然而，最近使用大腸桿菌DNA 微陣列分析親本大腸桿菌菌株RS218 和其OmpA缺失突變體的研究表明，OmpA缺失突變株顯示出fim 簇基因的表達顯著降低，并且Ⅰ型菌毛在細菌表面表達降低。這些發(fā)現(xiàn)表明，OmpA缺失突變株的黏附減少可能與其Ⅰ型菌毛的較低表達有關(guān)。與親本大腸桿菌菌株相比，OmpA缺失突變株體內(nèi)的滲透效率顯著降低[6]。由此可見OmpA 可能增強大腸桿菌的毒力。最近還有一項研究表明，OmpA 抑制劑能夠阻止大腸桿菌的粘附，從而在小鼠腹膜敗血癥模型中起到保護作用[7]。

大腸桿菌OmpC 是一種主要孔蛋白(圖1)。結(jié)晶學研究揭示，大腸桿菌OmpC 單體由16 個反向平行β 鏈構(gòu)成，具有空心桶狀結(jié)構(gòu)，是一種對蛋白質(zhì)變性具有較高穩(wěn)定性的三聚體。在細胞外側(cè)有8 個長而不規(guī)則的環(huán)(L1、L2、L4、L5、L6、L7、L8)，唯獨L3 是沿著桶壁的內(nèi)面延伸，并將孔隙收縮到一半，在周質(zhì)側(cè)具有8 條短轉(zhuǎn)角(T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8)，N 和C 末端殘基形成鹽橋。最新研究證實大腸桿菌OmpC 孔蛋白是淀粉樣蛋白以及其與神經(jīng)毒肽的結(jié)構(gòu)和功能的相似性表明OmpC 孔蛋白參與神經(jīng)變性。OmpC 能夠通過在神經(jīng)元細胞膜中形成孔并破壞Ca2+穩(wěn)態(tài)而導致細胞凋亡，引起神經(jīng)元細胞死亡從而誘導神經(jīng)變性[8]。這一研究說明可以通過控制OmpC 的表達來降低發(fā)病率。

OmpF 孔蛋白是外膜中含量最豐富的蛋白質(zhì)之一(每個細胞約105個拷貝)，是第一個獲得晶體衍射的整合膜蛋白。OmpF 是一種對稱三聚體(圖1)，通過其135 個卷曲螺旋中心結(jié)構(gòu)域與BtuB 受體緊密結(jié)合。三聚體中的每個單體是由一個有16 個兩親性β 鏈構(gòu)成的β 桶組成，在桶單體的細胞外側(cè)具有8 個延伸的環(huán)(L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8)，并且在周質(zhì)側(cè)具有8 條短轉(zhuǎn)角(T1、T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8)。晶體結(jié)構(gòu)顯示OmpF 與OmpC 兩個孔蛋白之間無明顯不同的物理化學特征，屬于同源孔蛋白，兩者有60 %的氨基酸序列相同，但這兩個孔蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上顯示出微小的差異：OmpC 比OmpF 具有更多的陽離子選擇性和更小的孔徑[9]。OmpF有較寬的孔隙，優(yōu)先在較低的滲透壓下表達。大腸桿菌的OmpF 和OmpC 孔蛋白基因均具有位于不同環(huán)上的抗原表位，它們可能具有一定的免疫特性，并在細菌發(fā)病機制中起作用，如粘附、侵襲和血清抵抗。

2 腸道外致病性大腸桿菌病Omp的致病性

2.1 Omp 維持細菌細胞膜的完整性 腸道外大腸桿菌的Omp 是最重要的細菌保護屏障，作為防御細胞外威脅的第一道防線，細菌外膜主要由脂類和幾千種Omp 組成，外膜的完整性維持著細菌的活力和參與促進耐藥性細菌的形成(表1)。因此，許多藥物通常靶向Omp 來破壞病原菌。

圖1 Omp 四級結(jié)構(gòu)圖

2.2 誘導細菌產(chǎn)生耐藥性 Omp 可以改變細胞外膜的通透性而誘導細菌耐藥性的形成。大腸桿菌的Omp，特別是其中的主要蛋白決定細胞形狀的遺傳信息。近年來，隨著異丙醇的長期和廣泛使用導致細菌產(chǎn)生耐受性。Omp處于細菌的最外層，直接與外界環(huán)境相接觸，對其展開深入研究是分析細菌對異丙醇耐受機制的一個重要方面，OmpA、OmpC、OmpF 均是細菌耐受異丙醇重要的Omp。OmpA 是一種跨膜蛋白，在維持細菌外膜結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)定方面也具有重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在含有L-亮氨酸的培養(yǎng)基中，OmpA 缺失的大腸桿菌突變株無法形成新的外膜孔道，也不能產(chǎn)生酸敏感性，而野生株則相反。這是由于OmpA 缺失的突變株通常外膜功能不穩(wěn)定，氨基酸的總轉(zhuǎn)運效率隨之下降，致使肽類及一些其它大分子產(chǎn)物無法轉(zhuǎn)運，且F 因子介導的細胞接合功能也受到影響[10-11]。OmpA 是允許外界物質(zhì)進入細胞內(nèi)的非特異孔蛋白,它的表達量降低可以減少外界異丙醇進入細胞內(nèi)[12-13]。Omp C為三聚體結(jié)構(gòu)的非特異性孔蛋白，通過控制小分子的通透性，提高細菌對抗生素的耐藥程度。一些異丙醇耐受試驗表明EnvZ 感受外界滲透壓的改變是整個雙組份調(diào)節(jié)系統(tǒng)起功能作用最為關(guān)鍵的一步，并將該信號傳遞給Omp R引起Omp C 的表達上調(diào)，以增強大腸桿菌對異丙醇耐受性[14-15]。Omp F 的生理功能與孔蛋白引起的耐藥性有著直接的關(guān)系。Omp F 對異丙醇的耐受性比Omp A 和Omp C都弱，但有研究構(gòu)建了雙重突變型(OmpC、OmpF 缺失)菌株，證明了OmpF 的丟失是大腸埃希菌對β-內(nèi)酰胺類抗生素和氟喹諾酮類藥物產(chǎn)生耐藥性的原因之一[16-18]。因此更好地了解大腸桿菌中異丙醇耐受性與OMPs 之間的關(guān)系，對之后解決大腸桿菌異丙醇耐受性問題提供很大的幫助。

2.3 Omp調(diào)節(jié)細菌的生物被膜形成 細菌為了抵抗外界不良應(yīng)激而進化出一系列的調(diào)節(jié)適應(yīng)環(huán)境機制來形成穩(wěn)定的生物被膜[20-21]。OmpA 在細菌物種中是高度保守的。這種蛋白質(zhì)是多功能的，具有多種體外和體內(nèi)生物學特性，其已被證明參與生物膜形成。有研究表明由于OmpA在細菌外膜中的高豐度，以及從細胞突出的4 個短環(huán)結(jié)構(gòu)可能在細菌生物膜中起作用[17]。而外膜孔蛋白OmpC 和OmpF 的表達可通過組氨酸蛋白激酶EnvZ/OmpR 雙組份信號調(diào)節(jié)系統(tǒng)，對環(huán)境中的滲透壓信號做出響應(yīng)，形成生物被膜。

2.4 Omp促進細菌的黏附和侵襲能力 大腸桿菌的Omp有助于細菌借助于菌毛吸附于宿主的細胞，從而引起病原體的內(nèi)轉(zhuǎn)和侵入(表1)，或者引起細菌的外部產(chǎn)物如腸毒素等物質(zhì)釋放到真核細胞的表面[19]。Omp 有助于大腸桿菌通過防御屏障，目前在腦膜炎大腸桿菌的研究中，侵襲相關(guān)Omp 近年來在禽致病性大腸桿菌中時有發(fā)現(xiàn)[20]。帥領(lǐng)等人發(fā)現(xiàn)OmpA+株對腦微血管內(nèi)皮細胞的侵襲力比OmpA-菌株高40 倍左右，多克隆微量OmpA 抗體能抑制OmpA+菌株大腸桿菌對血腦屏障的侵襲[18]。另外有研究表明OmpA 是尿道致病性大腸桿菌發(fā)病(UropathogenicEscherichia coli，UPEC)機制中的關(guān)鍵參與者，但是使用小鼠尿路感染模型證明了OmpA 基因的缺失并未破壞UPEC對尿道上皮細胞的粘附和侵襲，OmpA 在UPEC 侵襲上皮細胞后起作用，促進細胞內(nèi)細菌群落(Intracellular bacterial community，IBC)成熟[21]。根據(jù)Hejair HMA 等的研究表明與野生菌株相比，OmpF 和ompC 的缺失株在體外對小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞(Brain microvascular endothelial cells，BMEC)bend.3 細胞的黏附性顯著降低，在體外對BMEC bend.3 細胞的侵襲能力也顯著降低[22]。這表明OmpF 和OmpC 的缺失可能降低了細菌的粘附，侵襲能力。有些毒力因子自身沒有毒性，如果為其提供一個通道或載體作用于宿主，就能讓其產(chǎn)生毒力。

2.5 Omp 受體 大腸桿菌侵襲的過程是由多個因子決定的。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)侵襲進入細胞的大腸桿菌由質(zhì)膜小泡包裹，且在細胞質(zhì)、細胞間隙、胞間連接處均未發(fā)現(xiàn)游離的大腸桿菌，這些結(jié)果表明大腸桿菌和細胞表面受體結(jié)合，并以細胞轉(zhuǎn)運的方式侵襲。BMEC 中的受體是與gp96 同源的內(nèi)皮細胞(Ecgp)。Ecgp 是一層位于內(nèi)皮細胞腔面的由蛋白多糖、葡聚糖和糖蛋白組成的多功能層，糖蛋白被膜的脫落，會增加BMEC 對生物大分子的通透性，介導參與多種疾病過程[23]。大腸桿菌毒力因子與BMEC表面受體結(jié)合，觸發(fā)并激活特異性的信號轉(zhuǎn)導通路，從而引起細胞骨架重排。表達OmpA 的大腸桿菌可首先介導FAK 的酪氨酸磷酸化，其次是其下游分子樁蛋白和PI3K，進而導致BMEC 與細菌結(jié)合部位F-肌動蛋白凝聚化的形成，從而導致細胞骨架重排[24]。

表1 ExPEC 主要外膜蛋白的生物學功能

3 Omp免疫原性

Omp除了與細菌的代謝和毒力有關(guān)外，其免疫原性也越來越受到人們的重視。許多革蘭氏陰性菌Omp 可作用于參加免疫反應(yīng)的細胞，刺激機體產(chǎn)生保護性免疫。目前，對于大腸桿菌Omp 的免疫保護功能研究較多。大量試驗證明，Omp 具有良好的免疫原性，不僅可以刺激機體的體液免疫，而且對細胞免疫也有刺激作用，并且可通過遺傳工程技術(shù)大量表達[25-26]，某些細菌的不同血清型間有相同的Omp 免疫原，可以產(chǎn)生交叉保護作用。大腸桿菌的OmpA 表現(xiàn)出免疫特性，其細胞外4 個環(huán)均具有免疫原性，并且已經(jīng)證實其可以激活樹突細胞和巨噬細胞產(chǎn)生細胞因子，并引起強烈的體液免疫反應(yīng)[27]。同樣孔蛋白OmpC 和OmpF 均可為高毒力菌株提供高度保護，防止致死性感染。此外，OmpC 和OmpF 均可誘導高滴度的IgG抗體，表明這兩種蛋白均具有良好的免疫原性[28]。通過免疫產(chǎn)生的IgG1 和IgG2a 反映了免疫應(yīng)答的類型，血清IgG1 與Th2 型反應(yīng)相關(guān)，而血清IgG2a 與Th1 型反應(yīng)相關(guān)，這在介導細菌調(diào)理吞噬作用方面效果顯著。OmpC 和OmpF 引發(fā)高滴度的IgG2a，盡管低于IgG1，但也表明OmpC 和OmpF 可以誘導顯著的Th1/Th2 免疫應(yīng)答。這可能在某種程度上解釋了OmpC 和OmpF 對免疫小鼠提供了抗ExPEC 感染的保護力[27]。

4 Omp在大腸桿菌病防治中的應(yīng)用前景和展望

首先，Omp 與大腸桿菌耐藥性有著密切的關(guān)系。其次，開發(fā)研制出的新型Omp 疫苗也將具有廣泛的應(yīng)用前景。Li 等人開發(fā)了一種新方法，將異種抗血清免疫蛋白質(zhì)組學與免疫后的細菌攻毒試驗相結(jié)合，以鑒定不同物種、屬細菌家族之間的廣泛交叉保護性抗原[29]。OmpA 屬于腸桿菌科中高度保守的一類細菌蛋白，是宿主適應(yīng)性免疫反應(yīng)的靶點，特別是針對暴露于外膜表面的分子環(huán)的靶點，所以O(shè)mpA 是疫苗研究中的潛在抗原。來自其它革蘭氏陰性菌的OmpA 同源物已經(jīng)作為疫苗進行了測試。例如，最近完成了含有OprF (OmpA 同系物)的銅綠假單胞菌疫苗IC43 的II 期臨床試驗。另外最新發(fā)現(xiàn)了一種保護性抗原PA0833，其被鑒定為OmpA、OmpC 樣蛋白，PA0833 已經(jīng)被證實在小鼠敗血癥和肺炎模型中具有保護功效，是用于疫苗開發(fā)的有希望的抗原[30]。Liu 等研究表明ExEPEC 的孔蛋白OmpC 和OmpF 可以提供高度保護，抵抗高毒力菌株P(guān)CN033 的致死性感染[27]。表明暴露在外膜表面的OmpC 和OmpF 可能成為針對ExPEC 感染疾病的侯選疫苗。而且最近的研究表明，結(jié)構(gòu)生物學在疫苗設(shè)計中發(fā)揮著越來越大的作用[31]，基于蛋白質(zhì)的3D 結(jié)構(gòu)更容易發(fā)現(xiàn)安全，具有保護性、穩(wěn)定性的抗原。所以根據(jù)Omp 的細胞外環(huán)結(jié)構(gòu)來設(shè)計預(yù)防腸道外致病性大腸桿菌的疫苗是新的思路和方向。