桑黃提取液抗尿酸活性的研究

劉帥陽，廖宣宇，余戎鎮(zhèn)，楊振贇，韓 鏐，郭 瓊，施 維*

（吉林大學分子酶學工程教育部重點實驗室·生命科學學院長春·130012）

痛風是一種嘌呤代謝紊亂所致的慢性代謝紊亂疾病。主要臨床特點是體內尿酸產生過多或腎臟排泄尿酸減少，引起血中尿酸升高，形成高尿酸血癥以及反復發(fā)作的痛風性急性關節(jié)炎、痛風石沉積、痛風性慢性關節(jié)炎和關節(jié)畸形等。痛風常累及腎臟而引起慢性間質性腎炎和尿酸性腎結石。原發(fā)性痛風除少數由于遺傳原因導致體內某些酶缺陷外，大都病因未明，并常伴有肥胖、高脂血癥、高血壓、冠心病、動脈硬化、糖尿病及甲狀腺功能亢進等。繼發(fā)性痛風是繼發(fā)于白血、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤、溶血性貧血、真性紅細胞增多癥、惡性腫瘤、慢性腎功能不全、某些先天性代謝紊亂性疾病如糖原累積病I型等。目前臨床上治療痛風的藥物常具有一定的毒副作用，長期服用容易誘發(fā)肝腎衰竭等疾病。

桑黃又稱桑臣、桑耳、胡孫眼、桑黃菇等，因多寄生于桑樹上而得名，在我國大部分地區(qū)均有分布，是一種珍貴的大型食藥兩用菌，素有“森林黃金”之稱。桑黃在我國的應用已經有相當長的歷史，古代藥典中對其治療婦科急癥、瀉血、血淋疼痛等功效進行了詳細記載，在現代，因其突出的調節(jié)免疫力、抗腫瘤、抗氧化活性，逐漸成為國內外關注的重點。一系列研究表明，桑黃具有降血糖、抗癌、抗氧化、免疫調節(jié)、保肝護肝、及抗肝硬化等藥理作用，而對桑黃抗尿酸活性的研究仍然很少。尿酸主要是由黃嘌呤在XO酶的作用下氧化而來，而黃嘌呤由上游次黃嘌呤轉化得到，次黃嘌呤可在HGPRT酶的作用下轉化為其他物質，所以說尿酸的生成量與XO酶和HGPRT酶的表達及活性密切相關。本文利用液體發(fā)酵，研究桑黃提取物對XO和HGPRT基因表達以及酶活的影響，揭示其抗尿酸的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與儀器

胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰酶，細胞培養(yǎng)皿，離心管、槍頭等耗材，0.22 μm濾膜，測HGPRT酶活用的ELISA試劑盒，預染蛋白Marker，RIPA裂解液，細胞計數板，Tris緩沖液，PBS緩沖液，TransZol Up RNA提取液，Takara試劑盒，長白山桑黃，LO2細胞 （培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中）。

HC-3018R高速冷凍離心機，DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱，WFH-201BJ紫外可見投射反射儀，紫外分光光度計，基因擴增儀，GF-M3000酶標儀，78-1磁力加熱攪拌器，恒溫振蕩器，超聲波細胞粉碎機隔音箱，電子天平，電熱恒溫培養(yǎng)箱，TGl-16G離心機，全自動玻璃發(fā)酵罐，LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器。

1.2 實驗方法

1.2.1 桑黃的培養(yǎng)

取生長于長白山地區(qū)的桑黃子實體為菌種，通過液體發(fā)酵培養(yǎng)（配方為土豆兩個、葡萄糖40g、純凈水3L）在5L的發(fā)酵罐中發(fā)酵5天，發(fā)酵參數為溫度28℃、轉速120 rpm/min、pH 6.5，獲得桑黃子實體和培養(yǎng)液的混合物。

1.2.2 桑黃提取物的制備

將桑黃子實體和培養(yǎng)液的混合物進行超聲破碎并過濾，將濾液12000 r/min，4℃離心5min獲取上清液，標記為A于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

將桑黃子實體 （破碎成粉末）96℃水浴加熱30 min中得到桑黃水提物，過濾并離心得上清液，標記為B于4℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 桑黃提取液主要成分檢測

將A、B兩組樣品進行飛行質譜檢測，對質譜結果進行比較分析。

1.2.4 冷凍干燥制得母液

通過低溫真空凍干方法將A液凍干，得黃褐色粉末即為桑黃提取物干粉，稱取0.6 g加入10 ml去離子水制成桑黃母液，濃度為0.06 g/ml。

1.2.5 RNA的提取

將 母 液 分 別 稀 釋 成 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/ml的濃度作用于生長狀況良好的人體肝臟細胞中，作用48 h后用TransZol Up提取細胞中的RNA。每 10 cm2生長的培養(yǎng)細胞中加入 1 ml的TransZol Up，然后用移液槍吹打細胞使其脫落，將裂解液轉移至離心管中，8000 g，4℃離心2min棄上清，向每1×107個細胞中加入1ml的TransZol Up，吹下細胞后靜置5 min，加入0.8 ml氯仿劇烈振蕩30 s，室溫孵育3min。10000 g，4°C離心15min，此時樣品分為三層，無色的水相（上層），中間層和有機層，轉移無色的水相于新離心管中，每使用1 ml TransZol Up加入0.5 ml的異丙醇，顛倒混勻室溫孵育10min。去上清加1 ml 75%乙醇劇烈漩渦，7500 g，4°C 離心 5min。棄上清，沉淀溶于 100 μl RNA Elution Buffer中。

1.2.6 qRT-PCR檢測XO酶和HGPRT酶基因表達量的變化

將提取的RNA進行PCR擴增，引物序列如下，XO：Sense 為 5’-GATGGGCCAAGGCCTTCATA-3’，anti-sense 為 5’-CTGACAAGCCGCATAGACGG-3’；HGPRT：Sense為 TGACCAGTCAACAGGGGACAT，anti-sense為TTTCACCAGCAAGCTTGCGA。用Takara公司的實時熒光試劑盒進行熒光定量法檢測，具體步驟如下。

在反應管中按照下表1進行配制，42°C反應2 min，去除基因組的DNA。進行各項反應時，應先按反應數+2的量配制Master Mix，然后再分裝到每個反應管中，最后加入RNA樣品。

表1 反應體系1Table 1 reaction system1

按下表2配制反應體系，輕柔混勻后立即進行反轉錄反應，條件為37°C反應15 min，85°C反應5 s。

表2 反應體系2Table 2 reaction system2

在冰上按下表3配制qRT-PCR反應體系，應用Applied Biosystems 7300/7500 Real Time PCR System進行檢測，采用兩步法PCR擴增標準程序：第一步為95°C反應30 s； 第二步為95°C反應5 s，60°C反應34 s，40 個循環(huán)。

表3 反應體系3Table 3 reaction system3

1.2.7 HGPRT活性的檢測

將母液分別稀釋成 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025 g/ml的濃度作用于生長狀況良好的人體肝臟細胞中，48 h后提取細胞中蛋白質，然后利用蛋白質試劑盒進行蛋白質的定量，按照樣品中最低濃度進行倍比稀釋，通過人HGPRT酶聯免疫分析試劑盒測定HGPRT酶的活性，具體步驟如下：先將標準品按示意圖分別稀釋為20、40、80、160、320 U/L，往 HGPRT 抗體包被的 96 孔板中加入準備好的樣品和標準品，37℃反應30min。洗板5次，加入酶標試劑37℃反應30min，洗板5次，加入顯色液A、B，37℃顯色10min。加終止液，15min內在495nm處測OD值。

2 實驗結果及其討論

2.1 桑黃提取液的主要成分

查閱文獻資料得知桑黃主要活性成分為多糖，根據質譜檢測結果分析桑黃提取液中主要多糖活性物質的相對分子質量約為800～850。

2.2 細胞毒性的檢測

如圖4所示，用藥量超過0.20 g/ml后大量貼壁細胞懸浮在液體上層，由不透光的梭形活細胞變?yōu)橥腹獾膱A形死細胞，細胞出現較多死亡，因此桑黃提取液濃度超過0.20 g/ml后對細胞的毒性較大。

2.3 XO基因及HGPRT基因的表達量的檢測

由圖5可以看出，在轉錄水平上XO隨著桑黃提取液用藥量的增加而逐漸減少，藥物濃度為0.005 g/ml時即對XO基因有著較強的抑制，因此藥物通過抑制XO基因表達對XO合成有抑制作用，進而黃嘌呤轉化為尿酸的反應受到抑制，尿酸合成受阻；HGPRT基因的表達隨著桑黃提取液給藥量的增加而逐漸增多，藥物對HGPRT合成具有促進作用，有利于尿酸前體物質次黃嘌呤通過支路途徑轉化為次黃嘌呤核苷，抑制了尿酸的生成。

2.4 HGPRT酶活的檢測

用ELISA酶聯免疫法測定通過BCA定量后，不同給藥濃度下的細胞蛋白提取物中HGPRT的酶活性，由圖6結果顯示在一定范圍內（0.005～0.15 g/ml）HGPRT酶活性隨著給藥濃度的提高而逐漸增大，HGPRT通過支路途徑將尿酸前體物質轉化為次黃嘌呤核苷，進而使尿酸因為原料不足而合成受阻。

3 結論

在本實驗條件下，通過液體發(fā)酵得到桑黃菌培養(yǎng)液，進行質譜分析后，確定桑黃培養(yǎng)液主要活性多糖成分的相對分子質量為800～850左右。在細胞毒性實驗中，發(fā)現用藥量超過0.20 g/ml后對細胞影響較大，細胞出現較多的死亡。然后將桑黃提取液作用于肝臟細胞后，發(fā)現其能夠在一定范圍內能促進HGPRT基因的表達及其酶活性，使尿酸前體物質黃嘌呤被更多的轉化為其他物質，導致尿酸合成受阻；在一定范圍內其能抑制XO基因的表達，從而抑制體內尿酸的生成途徑的關鍵酶，使尿酸的合成受阻。本實驗從分子水平上研究了桑黃抗尿酸活性的機理，為桑黃資源的開發(fā)利用提供了一定的科學依據，并為天然降尿酸藥物的開發(fā)和桑黃的臨床應用提供了一定的理論機理，但桑黃體內抗尿酸活性的研究有待實驗進一步的跟進。

致謝：感謝長白朝鮮族自治縣林豐菌業(yè)有限公司提供的桑黃菌。