一測多評法同時測定清解顆粒中3 種成分

唐 林， 肖望重， 黃 莉， 雷 昌， 夏新華

（1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙410007；2.中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國家重點實驗室培育基地，湖南 長沙410208；3.湖南中醫(yī)藥大學藥學院，湖南 長沙410208）

清解顆粒為湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院的院內(nèi)制劑，臨床用于治療小兒急性支氣管炎和小兒慢性支氣管炎的急性發(fā)作，療效顯著，該制劑由生石膏、苦杏仁、防風、焦山楂等12 味中藥組成，具有解表清熱、化痰止咳的功效［1］，苦杏仁、防風為方中君藥，其中苦杏仁苷為前者指標性成分，升麻素苷，5-O-甲基維斯阿米醇苷為后者指標性成分，三者均具有明顯的止咳、祛痰、平喘、抗炎、抗病毒等藥理作用［2-4］。課題組前期對清解顆粒提取工藝進行研究，建立HPLC 法測定指標成分含有量，但該方法操作繁瑣，成本較高［5］。

近年來，一測多評法在中藥多指標質(zhì)量評價過程中受到重視，其優(yōu)勢為采用相對校正因子，在僅使用1 個對照品（易得、價廉、穩(wěn)定）的情況下實現(xiàn)多指標成分同步測定，成為一種適合中藥特點的多指標質(zhì)量評價新模式［6］，已在丹參、黃連、金銀花、人參、三七、復方丹參片、梔子金花丸等多種中藥及復方制劑的多指標質(zhì)量控制中得到了應用［7-9］。因此，本實驗建立一測多評法，以含有量最高、廉價易得的苦杏仁苷為內(nèi)標，建立其與升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷之間的相對校正因子，探討該方法用于清解顆粒成分含有量測定的可行性，同時也可為該制劑質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 高效液相色譜儀，配置DEAB806546 高壓四元泵、DEAAC12853 自動進樣器、DEACN13975 柱溫箱、DEAAX03328DAD 檢測器、Agilent 1260 series 色譜工作站（美國Agilent Technologies 公司）；Waters e2695 高效液相儀，配置Waters 2489 UV 檢測器、Empower 3 色譜數(shù)據(jù)工作站（美國Waters 公司）；Hei-Vap Advantage 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；AL-204 型分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海） 有限公司］；SK-7200HP 超聲波清洗器（上?？茖С晝x器有限公司）。

1.2 試藥 白芍、柴胡等中藥飲片均購自康美藥業(yè)股份有限公司，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學藥學院劉塔斯教授鑒定為正品，符合2015 年版《中國藥典》 項下規(guī)定?？嘈尤受眨ㄅ?10820-201506，含有量93.4%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷（批號111523-201509， 含 有 量 95.8%）、 升 麻 素 苷 （批 號111522-201511，含有量94.8%） 對照品均購自中國食品藥品檢定研究院。甲醇、乙腈、冰醋酸為色譜純（德國默克公司）；其他試劑均為分析純；水為超純水（法國威立雅有限公司Purelab Option Q15 超 純 水 機 制 備）。 清 解 顆 粒 樣 品 （批 號20180401、20180501、20180801），由湖南省中醫(yī)藥研究院中藥研究所制備。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 對照品溶液 精密稱取苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品適量， 置于25 mL量瓶中，甲醇溶解定容，得到貯備液（三者質(zhì)量濃度分別為1.236、0.748、0.396 mg／mL），于冰箱中冷藏備用。精密量取適量，加甲醇稀釋，即 得 （每 1 mL 分 別 含 三 者 0.247、 0.150、0.079 mg）。

2.1.2 供試品溶液 取顆粒2 g，研細，精密稱取適量， 置于250 mL 具塞錐形瓶中， 精密加入50 mL甲醇，稱定質(zhì)量，超聲（功率250 W、頻率50 kHz） 提取30 min，放冷，甲醇補足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，濃縮至干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL 量瓶中，稀釋至刻度， 搖勻， 續(xù)濾液過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.3 陰性樣品溶液 按處方比例和制備工藝分別制備缺苦杏仁、防風的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制備，即得。

2.2 色譜條件 依利特C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A） -乙腈（B） -0.1%冰醋酸（C），梯度洗脫，程序見表1；體積流量1 mL／min；檢測波長210 nm（0 ～20 min，苦杏仁苷）、254 nm（20 ～40 min，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷）；柱溫30 ℃；進樣量5 μL。在上述色譜條件下，各成分分離度良好，陰性無干擾，色譜圖見圖1。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programs

2.3 方法學考察

2.3.1 線性關(guān)系考察 精密量取對照品貯備液適量，按一定比例配制成6 個質(zhì)量濃度，在“2.2”項色譜條件下進樣測定。以峰面積為縱坐標（Y），溶液質(zhì)量濃度為橫坐標（X） 進行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.3.2 精密度試驗 精密量取供試品 （批號20180801） 溶液5 μL，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定6 次，測得苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積RSD 分別為0.72%、0.44%、0.39%，表明儀器精密度良好。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 精密量取供試品 （批號20180801） 溶液5 μL，于0、2、4、8、12、24 h在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，測得苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積RSD分別為0.77%、2.24%、2.35%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復性試驗 取同一批樣品 （批號20180801），按“2.1.2” 項下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，測得苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷含有量RSD 分別為2.87%、1.65%、2.10%，表明該方法重復性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗 精密稱取同一批樣品（批號20180801）約1 g（含苦杏仁苷7.60 mg、升麻素苷1.22 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷0.44 mg），共6 份，精密加入苦杏仁苷對照品溶液（3.259 4 g／mL）2 mL、升麻素苷對照品溶液（0.322 mg／mL）4 mL、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品溶液（0.35 mg／mL）1.60 mL，按“2.1.2” 項下方法制備供試品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

2.4 相對校正因子測定 采用多點校正法。取“2.1.1” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，以苦杏仁苷為內(nèi)標，計算其他2 種成分相對 校正因子fk／m， 公式 為（Ak為內(nèi)標峰面積，Wk為內(nèi)標質(zhì)量濃度，Am為組分m 峰面積，Wm為組分m 質(zhì)量濃度）［10］，結(jié)果見表4。

表4 各成分相對校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

2.5 耐用性考察

2.5.1 不同儀器、色譜柱 取“2.1.1” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下進樣測定，考察不同儀器（Waters e2489、Agilent 1260）、色譜柱（依利特C18、Agilent SB-C18、Agilent HC-C18）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響，耐用性良好（RSD＜3.0%）。

表5 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.5.2 柱溫 取“2.1.1” 項下對照品溶液，在“2.2” 項色譜條件下測定柱溫25、30、35、40 ℃時的相對校正因子，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響，重復性良好（RSD＜3.0%）。

2.5.3 色譜峰定位 以苦杏仁苷為內(nèi)標，考察其他2 種成分相對保留時間（待測成分與內(nèi)標成分保留時間之比，tR） 和保留時間差（待測成分與內(nèi)標成分保留時間之差，Δt），結(jié)果見表7，可知以tR為 定 位 標 準 時， 各 成 分 差 異 較 大 （RSD ＞3.0%）；以Δt 為定位標準時，各成分差異較小（RSD＜3.0%），即可將其用于色譜峰定位。

表6 不同柱溫對相對校正因子的影響Tab.6 Effects of different column temperatures on relative correction factors

表7 各成分相對保留值、保留時間差Tab.7 Relative retention values and retention time differences for various constituents

2.6 樣品含有量測定 分別采用外標法和一測多評法測定3 批樣品含有量，結(jié)果見表8，可知2 種方法所得結(jié)果無明顯差異。

表8 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.8 Results of content determination of various constituents（mg／g）

3 討論

本實驗檢測波長根據(jù)《中國藥典》 確定，即苦杏仁苷為210 nm，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷為254 nm，故采用二極管陣列檢測器的波長切換功能，具有較高的靈敏度、準確度、專屬性。在選擇流動相時，比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-乙腈-水、甲醇-乙腈-鹽 （0.1%冰醋酸、0.1%磷酸、0.1%甲酸） 的洗脫效果，發(fā)現(xiàn)甲醇-水洗脫苦杏仁苷分離效果較好，乙腈-水洗脫5-O-甲基維斯阿米醇苷分離效果較好，而甲醇-乙腈-水洗脫各成分時基本達到基線分離，但升麻素苷存在輕微拖尾，故考慮在水相中加入弱酸來改善峰形拖尾，由于甲醇-乙腈-0.1%冰醋酸洗脫時成分分離度較好，峰形對稱，故以其為流動相。

前期分別以苦杏仁苷、升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷為內(nèi)標，比較其相對校正因子，發(fā)現(xiàn)苦杏仁苷最穩(wěn)定（RSD＜2%），而且較易分離獲得，對照品價格便宜， 含有量最高， 故選擇其作為內(nèi)標。

對于一測多評法的色譜峰定位，主要是采用相對保留時間［11-12］。但本實驗所測成分的相對保留時間在不同色譜柱中明顯不同，可能是因為它們與內(nèi)標色譜峰保留時間的差異較大［13-14］，故選擇保留時間差進行定位。