基因治療與遺傳性耳聾

顧湘 郭維維 楊仕明

聽覺作為人類最重要的感知覺之一，在人們的日常生活中具有不可替代的重要作用。耳聾，即聽覺功能障礙，表現(xiàn)為不同程度的聽力損失，影響了全世界約3.6億的人口和1/500的新生兒[1]。據(jù)全國殘疾人抽樣調查統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國現(xiàn)有聽力語言殘疾者2780萬，其中感音神經(jīng)性聾占重度耳聾中的絕大部分[2]。在重度感音神經(jīng)性聾患者中，超過60%是由于遺傳因素引起，且這一比例在兒童患者中表現(xiàn)得更高。根據(jù)臨床表現(xiàn)的不同，遺傳性耳聾通常被分為非綜合征型（70%）和綜合征型（30%）兩大類。其中，非綜合征型遺傳性耳聾是指臨床上僅出現(xiàn)聽覺功能障礙，不伴隨其它器官和系統(tǒng)異常，其發(fā)病率為1/800～1/1000。目前，針對遺傳性耳聾的治療重點是通過各種聽覺輔助設備放大聲音，以恢復患者的聽覺功能，但卻不能接近自然聽覺水平。因此，探索遺傳性耳聾的生物治療方法勢在必行。

1 基因治療相比其它生物治療手段的優(yōu)勢

近年來，針對遺傳性聽力下降的治療研究探索了很多生物治療的方法，其中最熱門的方法包括促進毛細胞再生、干細胞移植以及基因治療。

眾所周知，對于哺乳類動物來說，內耳毛細胞不可再生，一旦損失便沒有辦法補充，而鳥類和魚類的毛細胞卻可以在損傷后重新產(chǎn)生?；谶@種差別，促進毛細胞再生的研究一直在進行中。目前認為，毛細胞的分化由Math1基因和轉錄因子ATOH1調節(jié)控制。但截至目前，針對成年的哺乳動物ATOH1調控的研究均未能產(chǎn)生足以恢復聽力的毛細胞，且ATOH1的持續(xù)表達反而會引起大量的毛細胞凋亡[3]。解放軍耳鼻咽喉研究所對聽覺生理及聾病進行了長期系統(tǒng)研究，而且在毛細胞再生研究方面也已有相當?shù)姆e累[4～6]。該課題組最新研究結果發(fā)現(xiàn)，經(jīng)圓窗膜以重組腺病毒為載體成功將Math1基因導入爆震性聾豚鼠內耳[7]，發(fā)現(xiàn)基因轉導1個月后部分豚鼠聽力開始恢復，2個月聽力有更好的改善[8]。

另外一個相對熱門的方法是干細胞移植。將具有分化能力的干細胞引入聽力受損的耳蝸中，通過適當?shù)沫h(huán)境誘導，使其分化成為毛細胞。干細胞的來源包括胚胎干細胞、誘導多能干細胞或從內耳提取的干細胞。目前用于研究的主要是胚胎干細胞和誘導多能干細胞。盡管在體內和體外均已成功通過誘導使干細胞分化成為毛細胞樣細胞[9]，該研究目前的瓶頸是在干細胞移植后，分化出來的毛細胞并沒有集中分布在Corti器，而是雜亂分布且成活率很低。

隨著人類基因組計劃及精準醫(yī)學計劃的實施，人們對遺傳性聾的認識也在分子水平上得到突破。利用基因編輯的方法，通過對實驗動物進行基因編輯獲得基因缺陷動物，或對已有的基因缺陷動物進行基因糾正是現(xiàn)階段探索遺傳性病最為普遍和有效地研究方案。

人們嘗試將具有相應功能的基因片段導入基因缺陷患者的細胞中。這一導入過程依賴于病毒基因轉運載體。目前較常用的病毒基因轉運載體有慢病毒載體、腺病毒載體和腺相關病毒載體。慢病毒(lentivirus)載體是非常高效的轉運載體，其靶向的細胞種類非常廣泛，但在感染過程中會整合到宿主細胞染色體并表達自身蛋白引起免疫反應，因而不是最理想的病毒基因轉運載體。腺病毒(adenovirus，ADV)載體是一種無包膜的線性雙鏈DNA病毒，靶向范圍廣、致病性低、基因表達能力強，但由于ADV其中的一些血清型在人群中廣泛傳播，大約80%的健康成年人體內都含有一種或幾種抗ADV不同血清型的抗體。這就造成部分血清型的ADV無法感染人體，限制了可改造的血清型別。初次感染ADV后病人會產(chǎn)生抗體，無法二次使用同種血清型的ADV進行治療。腺相關病毒(adreno-associated virus，AAV)是一種小型的無包膜的二十面體病毒，經(jīng)過改造的AAV載體并不會整合到宿主基因染色體上，并且AAV不同血清型別都有其特異性的靶器官，這使得AAV成為現(xiàn)階段基因治療相關研究的理想載體。

2 基因編輯技術

2.1 早期的基因編輯工具

鋅指核酸酶（zinc finger nucleases，ZFNs）和Z F N s的升級版轉錄激活子樣效應物核酸酶（transcription activator-like effector nucleases，TALENs）是兩種早期的基因組工程工具。這兩種基因編輯技術對每個新的目標序列，都需要設計一個新的DNA長片段（500～1500堿基對）合成相應目的蛋白。此外，由于非特異性核酸內切酶FokI形成二聚體才有內切酶活性，故ZFNs和TALENs都需要合成兩個新的蛋白，操作復雜，效率偏低，對實驗設備要求較高，且都存在較為顯著的脫靶問題，一直較難普及。

2.2 CRISPR/Cas9基因組編輯

CRISPR/Cas技術作為第三代的靶向基因組編輯技術系統(tǒng)，一問世就吸引了整個科學界。該技術的發(fā)現(xiàn)者珍妮弗和艾曼紐因此獲得了“2015年度生命科學突破獎”。相較于前面兩種基因編輯技術，CRISPR/Cas9技術簡便、易用，且成本低廉，具有可編程性以及可同時編輯多個基因，最重要的是針對人類細胞靶序列作用時具有很高的特異性（90%）和較低的脫靶率（20%）[10]。這些優(yōu)勢使得CRISPR/Cas基因組編輯技術被應用于多種真核和原核生物，其產(chǎn)生的研究成果涉及農業(yè)、畜牧業(yè)、生物、醫(yī)學等各個領域[11]。

CRISPR/Cas基因最早是1987年在大腸桿菌基因組中首次發(fā)現(xiàn)的[12]。CRISPR/Cas系統(tǒng)被認定為細菌適應性免疫系統(tǒng)，由規(guī)律成簇間隔短回文重復（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR相關（CRISPR-associated，Cas）兩部分組成，該系統(tǒng)廣泛存在于微生物界中。40%的細菌和90%的古生菌中都發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas系統(tǒng)[13]。根據(jù)核酸內切酶的識別和切割機制的不同，CRISPR/Cas系統(tǒng)被分為I～Ⅵ型。目前作為靶向基因編輯工具，最廣泛應用的是來源于化膿性鏈球菌的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)。該系統(tǒng)由Cas9蛋白、crRNA（CRISPR RNA）和tracrRNA（trans-activating crRNA）組成。在這個系統(tǒng)中，Case9蛋白具有核酸內切酶功能，tracrRNA參與crRNA的成熟過程，并與crRNA形成復合物，結合到入侵的噬菌體或質粒的互補雙鏈DNA序列上，并引導Cas9核酸酶對外源DNA靶向切割，從而起到免疫保護作用[14]。隨著研究的深入，研究人員用sgRNA代替了crRNA和tracrRNA對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行了簡化。sgRNA由堿基互補配對區(qū)（base pairing region）、Cas9把手（Cas9 handle）和終止子（terminator）3部分組成，簡化了和目標基因配對結合的過程。精心設計的gRNA能顯著降低脫靶效應，從而獲得較高的基因編輯有效率。另外，Cas9在定位結合目標序列時，只需識別與目標序列附近的前間區(qū)序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），而PAM序列普遍的存在基因組[15]，這就使得CRISPR/Cas9系統(tǒng)應用范圍非常廣泛。

切割形成D N A雙鏈斷裂（double-strand break，DSB）的修復途徑共有兩種：非同源末端連接（nonhomologous end joining，NHEJ）和同源性定性修復（homology directed repair，HDR）。研究發(fā)現(xiàn)，NHEJ途徑進行修復時易發(fā)生堿基的插入或缺失，從而引發(fā)編碼區(qū)的移碼突變，準確性相對較低[16]。HDR途徑屬于精確修復途徑，在修復過程中，需要提供同源的DNA模板。通過對DNA模板進行合理地設計，HDR途徑可以準確的進行特定核苷酸序列的插入、敲除和替換，從而達到對目標DNA序列進行精確編輯的目的[17]。目前，活體動物模型中HDR的效果尚未可知，且HDR在活體動物中的效率很低(＜1%)，其內耳研究中的可行性仍需進一步研究證實。CRISPR/Cas9在聽力學研究中應用的一個主要挑戰(zhàn)是該技術對PAM序列的依賴，如果單核苷酸堿基替換突變序列周圍沒有PAM序列，此時基因編輯便可能受到限制。

此外，CRISPR/Cas9系統(tǒng)的最大優(yōu)勢在于它可以和AAV載體結合使用，2015年5月《nature》發(fā)表了美國的張峰實驗室首次利用來自金黃色葡萄球菌的Sa Cas9構建腺相關病毒介導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的文章[18]，在高效率的同時獲得了高靶向的優(yōu)勢。

3 基因編輯技術在遺傳性聾研究中的應用

非綜合征型耳聾作為一種單基因病，其傳遞方式符合孟德爾分離定律，包括常染色體顯性遺傳（22%）、常染色體隱性遺傳（77%）、X-連鎖遺傳（1%）、Y-連鎖遺傳（僅在中國有一個家系報道）和線粒體突變母系遺傳（＜1%）[19]。目前，已報道的非綜合征型耳聾基因座位共175個，定位在全部的常染色體和兩條性染色體及線粒體基因上，分別編碼細胞骨架、轉錄因子、離子通道、轉運蛋白等重要功能蛋白[20]。耳聾患者的基因突變也有很多種，包括單核苷酸替換、堿基缺失、插入等。治療這些由于基因突變引起的聽力下降的最理想的方案，是在基因水平選擇性糾正這些變異。目前，針對遺傳性聾的研究，多數(shù)仍停留在基因篩查，明確診斷以及遺傳指導方面，對于基因突變的糾正仍然需要進一步研究，這就為基因編輯技術在遺傳性聾的治療方面提供了更為廣闊的前景。

隨著基因編輯技術的進步和推廣，短短的幾年時間內，研究人員利用基因編輯技術成功的構建了各種遺傳性耳聾的動物模型。小鼠是研究人類遺傳性耳聾的應用最為廣泛的動物模型。2014年，Harms DW建立了基于CRISPR/Cas9構建小鼠模型的標準流程[21]。這些動物模型極大程度地推進了遺傳性耳聾的疾病機理、臨床表現(xiàn)和治療探索等研究。目前相對前沿的幾個突變基因包括Vglut3，Tmc1，WHRN，Ush1C，USH3A，Gjb2等，表1中分別對他們的研究現(xiàn)狀進行了總結。

4 內耳的特點在基因治療中的優(yōu)勢

耳聾的基因治療之所以成為近年來研究的熱點，除了臨床應用中的實際需要外，還得益于內耳在結構上具有的獨特優(yōu)勢。內耳是一個相對容易接觸，卻又封閉且充滿液體的空間。它的天然屏障——血迷路屏障，可以使注入耳蝸的藥物在靶器官內保持高濃度的同時最大限度地減少全身分布，降低了非靶向器官和組織的毒性，這一點已被研究證實[29]。因此，通過何種途徑向內耳輸送基因編輯工具需要進一步研究。目前在實驗動物上已經(jīng)探索了多種向內耳輸送的方法，包括通過圓窗或卵圓窗注入外淋巴系統(tǒng)[29]；或通過耳蝸造孔注入前庭階或鼓階[30]；或通過半規(guī)管造孔術[31]注入中階。這些途徑都在不同程度上完成了藥物向內耳的轉運，然而由于內外淋巴鉀離子濃度的差異，轉運過程中血迷路屏障的破壞也存在兩個潛在的問題。第一，高鉀向外淋巴泄露可能導致基底轉的毛細胞和神經(jīng)細胞的凋亡。第二，對內、外淋巴液之間緊密連接的破壞可造成耳蝸電位80～120 mV的電位下降，進而引起毛細胞感知的驅動力的降低，直接導致聽閾提高。因此，如何有效地保證導入效率的同時減少導入造成的副損傷仍是需要研究探討的問題。從目前的研究結果來看，通過前庭系統(tǒng)導入，即耳蝸內淋巴相連通，又不存在內淋巴電位，可以有效地避免耳蝸電位下降的問題，相對來說具有一定優(yōu)勢[31]。

5 耳聾動物模型的選擇

構建攜帶基因缺陷的動物模型是進行基因治療研究的前提。鼠具有價格經(jīng)濟且繁殖迅速的優(yōu)勢，是應用在醫(yī)學領域最為廣泛的實驗動物，在針對耳聾的基因糾正研究中應用也是最多的，前文總結的耳聾基因治療的成功案例全部是以小鼠為研究模型。然而，鼠和人的進化關系遠，在內耳形態(tài)、物質、能量代謝等基礎生理特征方面差異大，且鼠類在聽力發(fā)育上屬于晚熟種類，其在出生后14天才獲得聽力；而人類在胚胎期5個月就已經(jīng)獲得聽力。這些差異導致很多基因敲除的小鼠并不能完全模擬人類的疾病表型。如SLC26A4基因敲除的小鼠，盡管可以表現(xiàn)出前庭水管擴大的特點，但小鼠模型表現(xiàn)出的是先天性耳聾，不同于人類前庭水管擴大患者中相當比例表現(xiàn)出遲發(fā)性、波動性聽力下降的特點，并且不出現(xiàn)甲狀腺病理改變和功能異常，不能完全模擬人類Pendred綜合征的表型[32]。此外，鼠類體型過小，內耳組織尤其微小，使得一些實驗操作如內耳基因導入操作難度大，精度難以保證。

基于鼠模型的以上缺點，人們在耳聾的動物模型方面也進行了很多探索。靈長類動物因其和人類相近的進化關系首先進入了人們的視野。但應用其實驗往往會涉及倫理問題，且繁殖速度較慢，難已得到純的品系，因此未能大規(guī)模推廣應用。近年來，豬用作耳聾研究的動物模型逐漸受到學者認可。首先豬是醫(yī)學實驗動物中除靈長類以外和人類進化關系最近的物種，且是大型醫(yī)用動物模型中繁殖效率最高、發(fā)育周期最短、最經(jīng)濟易得的。豬被選作耳科疾病及聽力學研究的基礎動物模型絕非偶然。一方面，以往研究表明，盡管豬的顳骨在外耳道的長度和位置上與人類差異較大，但其中耳結構卻與人類的中耳非常相似。另一方面，在聽覺功能方面，早在1990年就有研究報道，野豬與人類具有相似的行為聽覺范圍和最佳聽覺靈敏度。Hansen等人[33]在1992年針對高膽紅素血癥對新生仔豬(2～9天)聽覺誘發(fā)電位波幅的影響的研究中清晰的記錄到了新生豬仔的聽覺腦干反應(ABR)和良好的I-V波，表明豬和人一樣是聽力早熟物種.當然，作為大型實驗動物，豬在其成年后的體重可以超過100公斤，實驗操作不夠便捷。且選用豬進行動物實驗，其購買、飼養(yǎng)、收容、分娩等方面成本也比小型動物昂貴得多，這些方面的缺點嚴重的限制了豬在實驗研究中的應用。基于以上前提，身形和體重只有正常豬的1/5的小型豬便自然地受到了耳科及聽力學學者們的關注。其成年體重在20～30公斤，身體大小約為50厘米長，20厘米高。小型豬耳蝸有三圈半，膜迷路總長度為39毫米，其顳骨解剖已被證實和人類的十分相似[34]。聽閾范圍也和人類非常接近，4 k～32 kHz的ABR的平均閾值為35～45 dB。因此，小型豬既擁有和人類非常接近的內耳結構和聽力學功能，又不像普通豬那樣體型龐大不方便操作，是目前耳科疾病和聽力學研究的最為理想的實驗動物。解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科楊仕明團隊在國際上率先提出并證明了豬是耳科學研究領域的理想實驗動物[35-39]。近年來，成功建立了多種遺傳性狀穩(wěn)定的先天耳聾小型豬模，包括Mitf-M突變耳聾豬模型、Sox10突變內耳畸形聾豬模型以及Kit突變聾豬模型。采用這些遺傳背景清楚、生物學特性明確的耳聾豬模型，將為進一步推進遺傳性耳聾病因及治療的研究提供有力的支持。

表1 前沿的耳聾突變基因研究現(xiàn)狀

綜上所述，內耳基因治療具有恢復或防止聽覺功能衰退的潛力，拓展了人類的聾病治療思路。盡管目前針對耳聾尚無將動物模型中成功的基因治療方法應用于人類的探索記錄，但對于治療其他疾病，全世界有超過1800個已完成，或正在進行的涉及基因治療臨床試驗[40]，可以從這些更先進的基因治療領域吸取經(jīng)驗教訓。在不久的將來，耳聾的基因治療會像人工耳蝸植入一樣，成為遺傳性聾的常規(guī)治療手段之一被廣泛應用于臨床。