液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定牛奶中金剛烷胺殘留的方法

張 佳，張慧利，柴 磊，關(guān)婷婷，成林林，秦 娜

（焦作市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，河南焦作 450000）

1 前言

金剛烷胺是一類用于預(yù)防和治療病毒感染的三環(huán)胺類抗病毒藥物，主要用于雞、豬流感的預(yù)防和早期治療以及豬傳染性胃腸炎的防治。農(nóng)業(yè)部規(guī)定除經(jīng)批準(zhǔn)生產(chǎn)、使用的疫苗產(chǎn)品外，禁止使用金剛烷胺防治高致病性禽流感等一類病原微生物引起的病毒性疫病。目前主要有氣相色譜法、毛細(xì)管氣相色譜法、高效液相色譜-熒光檢測法、毛細(xì)管電泳法及液質(zhì)聯(lián)用法等，普遍存在著前處理過程繁瑣、檢測靈敏度低和專屬性差等缺點(diǎn)。本方法根據(jù)金剛烷胺的分子結(jié)構(gòu)、化學(xué)性質(zhì)，以現(xiàn)有文獻(xiàn)為基礎(chǔ)采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法進(jìn)行金剛烷胺殘留的測定。經(jīng)試驗(yàn)，該方法檢測靈敏度高、專屬性強(qiáng)、適用于牛奶中金剛烷胺殘留的檢測。

2 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

2.1 原理

試樣用1%甲酸乙腈提取，濃縮后用20%乙腈溶解，經(jīng)正己烷去除脂肪，高速離心去除蛋白質(zhì)等雜質(zhì)后過濾膜，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定，同位素內(nèi)標(biāo)法定量。

2.2 儀器設(shè)備與材料

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源）Waters UPLC TQ-S.；分析天平（精度0.00001g）；電子天平（0.01g）；高速冷凍離心機(jī)；多管渦旋振蕩器；氮吹儀；移液器（5mL，1mL，200μl，50μl）；聚四氟乙烯離心管（50ml）；一次性注射器（1ml）；一次性針頭過濾器（有機(jī)系，0.22μm）

2.3 試劑與溶液

甲酸（色譜純）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；正己烷（色譜純）；無水硫酸鈉；（鹽酸）金剛烷胺、鹽酸金剛烷胺-D15對照品，純度≥99%；1%甲酸乙腈溶液：量取1ml甲酸，加乙腈至100ml，搖勻即得；20%乙腈溶液，量取乙腈20ml，加水至100ml，搖勻即得；20%乙腈溶液飽和的正己烷：取20%乙腈溶液適量，與正己烷混合，搖勻后靜置使分層。

2.4 實(shí)驗(yàn)步驟

2.4.1 樣品添加：取空白試樣2g，添加100ng/ml的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液100μl，制得濃度為5μg/kg的陽性添加試樣，與待測試樣同步處理。

2.4.2 提?。悍Q取已混勻的牛奶試樣2±0.02g，置于50mL離心管中，加內(nèi)標(biāo)中間工作液（4.13）100μl，再加無水硫酸鈉3g，1%甲酸乙腈溶液10ml，渦旋混勻，渦旋振蕩20min。10000r/min離心10min，取上清液于50℃下氮?dú)獯蹈伞?/p>

2.4.3 凈化：加入20%乙腈溶液1.0ml，充分渦旋溶解，再加入20%乙腈溶液飽和的正己烷2 ml，充分渦旋混合，8000r/min離心5min。吸取下層溶液至1.5ml離心管中，20000r/min離心5min，取下層清液過0.22μm濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

2.4.4 系列標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備：準(zhǔn)確量取適量的混合標(biāo)準(zhǔn)中間工作液，用20%乙腈溶液稀釋成濃度分別為1、2、5、10、20、50ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

2.4.5 儀器參數(shù)與測定：色譜柱：Waters Acquity、UPLCTMBEH C18（1.7μm，2.1×100mm）；柱溫：30℃；流動相：A：乙腈；B：0.1%甲酸溶液；進(jìn)樣量：2μL；電噴霧ESI；正離子掃描；多反應(yīng)監(jiān)測MRM；定性、定量離子對及對應(yīng)錐孔電壓和碰撞能量見表1。

表1 金剛烷胺及內(nèi)標(biāo)定性、定量離子對及對應(yīng)錐孔電壓和碰撞能量

3 結(jié)果與分析

采用單點(diǎn)校正，按下式計(jì)算：

校正因子按下式計(jì)算

供試樣品中金剛烷胺殘留量按下式計(jì)算

4 結(jié)論

本方法在2～5 0μg/k g添加濃度的回收率為70%～120%，檢測限為1μg/kg，定量限為2μg/kg，在批內(nèi)相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%，批間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差≤20%。本方法具有很高的靈敏度與準(zhǔn)確度，適用于牛奶中金剛烷胺殘留的檢測分析。