稻花香2號SSR反應(yīng)體系優(yōu)化及引物篩選

潘天旭，張宇鵬，趙家慧，楊祥波

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，生物與制藥工程學(xué)院，吉林吉林 132101）

眾所周知“泰國香米出福水，中國香米出五?！保宄４竺字凶钬撌⒚?，最受人們歡迎的品種便是“稻花香2號”，因為黑龍江省五常市得天獨厚的地理位置，使之在水質(zhì)好、晝夜溫差大、積溫高的良好生態(tài)環(huán)境中得以產(chǎn)出，稻米采夏日驕陽之精華，集寒帶黑土之肥沃，口味口感、營養(yǎng)價值遠高于其他稻米品種[1]，“稻花香2號”與南方兩熟甚至三熟的水稻相比，每年僅能產(chǎn)出一次稻谷，并且稻米產(chǎn)量也僅有其他水稻品種的三分之一，因其高品質(zhì)稀有等特點使之在高端市場不僅頗受人們青睞，而且價格較普通稻米高出數(shù)倍，正因如此成為一些不法商家謀取不法利益的對象，市面上摻假“稻花香2號”種子現(xiàn)象不斷出現(xiàn)，農(nóng)戶挑選種子時稍有不慎，就會損失慘重，農(nóng)戶家傾注一年的心血也將付諸東流，也使國家在知識產(chǎn)權(quán)保護和品種管理上面對面臨巨大的挑戰(zhàn)，因此研究出一種準確高效的品種鑒定技術(shù)，進行對水稻產(chǎn)業(yè)的摻假和售假現(xiàn)象加以監(jiān)督和管理迫在眉睫[2]。

傳統(tǒng)的品種鑒定根據(jù)稻谷的形態(tài)學(xué)性狀和特點進行鑒定區(qū)分，但此方法鑒定周期長，誤差較大，更容易受環(huán)境因素的影響，真實性較低，不能滿足種子管理部門高效準確的新要求。而DNA分子標記技術(shù)應(yīng)運而生便可以克服傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的缺點[3-4]，其中SSR（simple sequence repeats）技術(shù)是近幾年來發(fā)展起來的建立在PCR基礎(chǔ)上的 第二代DNA 分子標記技術(shù)，因為此鑒定方法用友快速，穩(wěn)定，操作簡單，成本低的優(yōu)點，在水稻種子真?zhèn)螜z測起到了不可替代的作用[5-6]。由此技術(shù)建立的“稻花香2號”SSR-PCR反應(yīng)體系在品種鑒別上提供經(jīng)濟，省時，準確的研究基礎(chǔ)，在保護此品種的知識產(chǎn)權(quán)和育種研究者的權(quán)益意義重大。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料選取為 “稻花香2號”和其親本“五優(yōu)稻1號”均由 黑龍江省五常水稻所提供，在恒溫30℃光照培養(yǎng)箱培育5d獲得。

1.1.1 引物

選取農(nóng)業(yè)部行業(yè)標準（NY/T 1433-2014）中的48對引物中篩《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標記》（2014 年 6 月 1日實施）中 8對 SSR引物[7]。

表1 8個水稻 SSR標記引物的基本信息

1.1.2 實驗試劑

（1）plant DNA so 植物基因組快速提取試劑盒（品牌：vastar）；

（2）nastar PCR mix（品牌：vastar）；

以上試劑均選自于長春市華程生物技術(shù)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA提取

選取幼苗期水稻葉片100g，用剪刀剪碎放入研缽中，用液氮充分研磨成粉末快速移入2ml移液管中后，用plant DNA so植物基因組快速提取試劑盒提取水稻全基因組DNA，詳細方法見此試劑盒說明書，提取后的DNA再用紫外分光光度計檢測質(zhì)量濃度，加入適量0.1×TE溶液稀釋成一定濃度并在-20℃冰箱中保存。

1.2.2 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化設(shè)計

10μL的反應(yīng)體系，用模板 DNA 濃度、引物濃度、2×PCR mix 用量（由Taq DNA Polymerase mg2+，dNTPs 以及PCR穩(wěn)定劑和增強劑的混和體系）作為影響因素，以 L16（43）正交試驗設(shè)計優(yōu)化方案（表2），共 16個處理方案，重復(fù)三次。PCR擴增程序為：94℃預(yù)變性5min；94℃變性45s；55℃退火30s；共35個循環(huán)；72℃延伸7min。擴增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶的有無，清晰度及亮度篩選出最優(yōu)的反應(yīng)體系。

表2 SSR反應(yīng)體系的正交試驗設(shè)計

1.2.3 電泳檢測

先用4%的瓊脂糖凝膠電泳檢測8對SSR引物擴增產(chǎn)物多態(tài)性，篩選出其中多態(tài)性高的擴增產(chǎn)物，再用6% SDS變性聚丙烯凝膠電泳分離。電泳結(jié)束后，首先進行冰醋酸（10%）固定20min，硝酸銀溶液（2%）染色30min，ddH2O迅速漂洗5～10s，用顯色液（3%無水碳酸納溶液）顯色10～15min，ddH2O漂洗1～5min，室溫環(huán)境中自然晾干，拍照，觀察并記載帶型，統(tǒng)計結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.2.4 結(jié)果判定

根據(jù)農(nóng)業(yè)部稻米及制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心制定標準[7]得知：兩個品種進行變性聚丙烯凝膠電泳后的條帶存在兩個或兩個以上的位點差異時，表明為不同的品種，當(dāng)僅有一個位點存在差異時，表明為相似品種，若所有位點均相同，則為同一品種。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取的質(zhì)量

品種真?zhèn)蔚蔫b定準確性受DNA的質(zhì)量影響較大，用紫外分光光度計檢測OD260 /OD280 值應(yīng)該在1.8～2.0之間，說明DNA質(zhì)量高，純度高，若OD260 /OD280值小于1.8或大于2.0，說明DNA 質(zhì)量不佳，可能其中含有RNA或蛋白質(zhì)。表2 的 DNA 提取結(jié)果顯示，提取的 DNA 質(zhì)量較高，完全符合PCR擴增的要求。

表3 DNA質(zhì)量檢測結(jié)果

2.2 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化結(jié)果分析

如圖1所示，泳道1～4在2×PCR mix 的濃度比較低反應(yīng)體系中擴增出的條帶十分模糊，其余12條泳道均有明顯的條帶，并整體上隨著 2×PCR mix 的用量的增加條帶亮度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，并在6μl時最為清晰穩(wěn)定，說明此試劑最適用量為6μl。在由9～12泳道可明顯發(fā)現(xiàn)隨著引物濃度的增加條帶亮度增加，逐漸清晰，說明引物在設(shè)計濃度范圍內(nèi)，較高濃度的引物有利于PCR反應(yīng)擴增，模板DNA的用量在15～35之間均能產(chǎn)生較為清晰的條帶，在此范圍內(nèi)對結(jié)果影響不大，從經(jīng)濟節(jié)約的角度考慮，以及高濃度的引物會導(dǎo)致引物二聚體的現(xiàn)象增加，影響試驗結(jié)果，最終確定反應(yīng)體系；引物0.8μmol·L-1，模板8ng，2×PCR mix 6μl。并且由此反應(yīng)體系擴增的第11泳道的條帶亮度最好，最清晰。

圖1 PCR正交試驗擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3 SSR 引物的篩選

為了試驗的準確性，本研究共利用8對引物在“稻花香2號”及其親本“五優(yōu)稻1號”進行初篩和重復(fù)性驗證，均能擴增到清晰條帶，但部分在親本間沒有明顯差異，無多態(tài)性。最后確定引物RM366和引物RM297在親本和雜種F1中存在擴增的譜帶 單一清晰，存在多態(tài)性（圖3），適合用于此品種的真實性檢測。

圖2 8對引物對“稻花香2號”及“五優(yōu)稻1號”多態(tài)性篩選結(jié)果

3 結(jié)論與討論

該研究從NY/T 1433-2014《水稻品種鑒定技術(shù)規(guī)程：SSR標記法》推薦適合東北粳稻的8對引物中篩選出2對可快速準確鑒定出“稻花香2號”的真實性，并且在試驗中采用10 μl的反應(yīng)體系，使引物和其他藥品的用量大大減少，降低了檢測費用；摸索出一套與品種和引物相適應(yīng)的PCR反應(yīng)條件，保證實驗室檢測結(jié)果的穩(wěn)定性、重演性、準確性，真正為農(nóng)業(yè)主管部門、執(zhí)法部門提供最快速、最有利科學(xué)的鑒定技術(shù)。

為水稻品種真實性鑒定室內(nèi)分子檢測方法提供了判定依據(jù)，也能為農(nóng)業(yè)行政執(zhí)法部門開展執(zhí)法工作以及種子市場監(jiān)管工作提供相應(yīng)的技術(shù)支撐，減少假劣種子進入市場的概率，促進黑龍江種業(yè)健康、有序、可持續(xù)發(fā)展。