CACNA1A、APOE基因多態(tài)性與新疆維吾爾族人群剝脫綜合征發(fā)病的相關(guān)性研究

溫鑫，陳雪藝

剝脫綜合征 (exfoliation syndrome，XFS)是一種與年齡相關(guān)的系統(tǒng)性疾病,以細(xì)胞外基質(zhì)中剝脫物質(zhì)的沉積為特征，表現(xiàn)為灰白色頭皮屑樣的物質(zhì)在眼部組織中堆積。沉積物可出現(xiàn)在眼的所有前段結(jié)構(gòu)，包括晶狀體囊、虹膜、纖毛體、細(xì)帶和小梁網(wǎng)，但最常見的部位為瞳孔緣和晶狀體前囊[1]。1917年，林德伯格在慢性開角型青光眼的患者的瞳孔周圍首次發(fā)現(xiàn)并描述了這一物質(zhì)，然后提出了XFS[2]的概念，人們才逐漸開始對(duì)其展開相應(yīng)的研究。

剝脫綜合征在世界范圍內(nèi)均可發(fā)病，但其發(fā)病情況卻不盡相同。XFS在世界范圍內(nèi)好發(fā)于斯堪的納維亞半島地區(qū)[3]。在中國地區(qū)，新疆維吾爾族人群較為高發(fā)。庫車地區(qū)研究表明，60歲左右或大于60歲以上的維吾爾族人群中，XFS有2.2%的發(fā)生率；而在大于80歲的人群中，這一數(shù)字達(dá)到9.5%[4]。這充分提示了XFS發(fā)病與種族、年齡密切相關(guān)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象

收集2012年3月至2013年5月在新疆喀什地區(qū)、庫車地區(qū)以及新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院確診為剝脫綜合征的維吾爾族人群作為研究組（XFS組），共216例，與研究組生活背景等相匹配并且經(jīng)嚴(yán)格檢查確定無血緣關(guān)系的維吾爾族健康人群作為對(duì)照組，共297例納入本研究。所有研究對(duì)象均簽署知情同意書，并且歷經(jīng)詳細(xì)的眼科檢查（視力、裂隙燈、眼壓、前房角鏡檢查、視野、間接眼底鏡等），通過新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的倫理審查資格。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

XFS診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]：（1）眼前段有典型 XFS物質(zhì)存在于晶體囊，瞳孔緣出現(xiàn)灰白色頭皮屑樣剝脫物質(zhì)。晶狀體前囊中央有密集粉塵狀灰白色膜樣小盤或周邊部有鋸齒狀或花邊樣灰白色顆粒樣混濁環(huán)帶；（2）小梁網(wǎng)色素沉著增多和瞳孔緣虹膜色素花邊脫失；（3）視盤和標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)化視野檢查正常；（4）Goldman壓平眼壓計(jì)測量IOP≤21 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：對(duì)照組 （1）沒有異常物質(zhì)聚集于眼前段或瞳孔緣；（2）眼壓≤21 mm Hg；（3）視野和視盤正常;（4）無青光眼家族史的人群；（5）生活背景與研究組相匹配且無血緣關(guān)系的維吾爾族對(duì)照組；（6）除了輕微屈光不正外沒有其他眼部疾病。XFS組（1）符合 XFS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）維吾爾族人群；（3）同意參加臨床研究并簽署知情同意書。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）其他原因引起的繼發(fā)性青光眼（葡萄膜炎、色素上皮綜合征、虹膜角膜內(nèi)皮綜合征）；（2）強(qiáng)烈紅外線接觸史；（3）自身免疫性疾??；（4）高血壓病等心腦血管疾??；（5）惡性腫瘤；（6）糖尿?。唬?）肝炎；（8）不能配合完成本研究者。

1.3 方法

每組均取EDTA Na2抗凝的外周血5 ml，立即放入-80℃冰箱備用，用全血基因組DNA提取試劑盒抽提基因組DNA，通過蛋白/核酸比色儀對(duì)提取的全基因組DNA進(jìn)行定量和純度分析。針對(duì)rs4926244，rs429358，rs7412位點(diǎn)，合成其相應(yīng)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，取5 μlPCR產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳陽性PCR產(chǎn)物送測序。電泳陽性PCR產(chǎn)物送（北京六合華大基因科技股份有限公司）ABI-PRISM3730測序儀測序分析，測序峰圖用Chromas軟件和DNAMAN軟件分析等位基因、單倍體多態(tài)性。明確新疆維吾爾族XFS患者與對(duì)照組間外周血CACNA1A基因rs4926244位點(diǎn)、APOE基因rs429358、rs741位點(diǎn)是否存在多態(tài)性，是否與新疆維吾爾族人群XFS發(fā)病相關(guān)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)來表示，采用 χ2檢驗(yàn)比較 XFS組和對(duì)照組間基因位點(diǎn)的差異性，是否符合Hardy-Weinberg平衡 （Hardy-Weinberg equilibrium，HWE），采用χ2檢驗(yàn)，比較的參數(shù)是XFS組與對(duì)照組之間各SNPs位點(diǎn)的基因型。利用雙重Logistic回歸模型計(jì)算基因型及等位基因比值比（oddsratio，OR）及95%置信區(qū)間（confidence interval，CI）所有的統(tǒng)計(jì)分析采用雙側(cè)概率進(jìn)行檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證明基因位點(diǎn)與疾病的發(fā)生具有相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 一般資料

研究組共納入216例患者，對(duì)照組共納入297人。研究組患者年齡為（69.90±8.47）歲，對(duì)照組研究對(duì)象年齡為（62.46±9.94）歲，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.13，P＜0.01)，在后面行基因位點(diǎn)分析時(shí)已用Logistic回歸矯正年齡帶來的誤差。研究組中男146例，女70例，對(duì)照組中男159人，女138人，研究組和對(duì)照組中性別差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=10.25，P＜0.01)。

2.2 各研究SNPs位點(diǎn)的Hardy-Winberg(HWE)平衡

用卡方檢驗(yàn)來驗(yàn)證HWE平衡，XFS組CAC-NA1A基因 rs4926244及 APOE基因 rs429358、rs7412的研究組及對(duì)照組均符合HWE平衡（表1）。

表1 XFS組與對(duì)照組3個(gè)SNP位點(diǎn)的HWE檢驗(yàn)比較

2.3 CACNA1A、APOE基因與XFS的關(guān)系

CACNA1A基因的rs4926244位點(diǎn)在研究組及對(duì)照組中各分型比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示CACNA1A基因的rs4926244位點(diǎn)可能與新疆維吾爾族XFS發(fā)病無關(guān)。APOE基因的rs429358、rs7412位點(diǎn)在研究組及對(duì)照組中各分型比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），提示 APOE 基因的 rs429358、rs7412 位點(diǎn)可能與新疆維吾爾族XFS發(fā)病無關(guān)(表2)。

為了進(jìn)一步探究基因與疾病的關(guān)聯(lián)性，按照rs4926244位點(diǎn)、rs429358位點(diǎn)、rs7412位點(diǎn)分型結(jié)果分別建立了不同的遺傳模型，包含了Dominant(頻率低的allele為顯性)，Recessive(頻率低的allele為隱性)，Log-additive(疊加作用)。因變量代表參選人群是否患病（否=0，是=1），自變量代表顯性模型、隱性模型和加性模型等不同遺傳模型，對(duì)獲得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，結(jié)果表明：無論在年齡矯正前還是年齡矯正后，rs4926244位點(diǎn)、rs429358位點(diǎn)、rs7412位點(diǎn)的P值均＞0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。故基因多態(tài)性與XFS并無關(guān)聯(lián)（表3）。

表2 3個(gè)SNP位點(diǎn)在研究組和對(duì)照組中的各模型分析結(jié)果（單位：例）

表3 基因單倍體多態(tài)性與XFS的關(guān)聯(lián)性分析

3 討論

盲和視力損害是世界范圍內(nèi)的共同難題，XFS是白內(nèi)障、青光眼的病因之一。XFS發(fā)病隱匿，患者常并發(fā)白內(nèi)障、青光眼嚴(yán)重影響視力才來就診，失去最佳治療時(shí)機(jī)而致盲，國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道 XFS分布有明顯種族及地域特征[6-12]，患病率：0～20%，芬蘭[12]：22%，冰島[12]：29%，而格陵蘭島愛斯基摩人[8]：0，在我國漢族人群中XFS屬于少見眼病，香港報(bào)道[9]60歲以上患病率為0.4%；新加坡[9]也證實(shí)XFS在當(dāng)?shù)厝A人中較為少見，患病率為0.7%。

為了更好的了解XFS的病因，Tin Aung等[13]開展了GWAS研究，在日本選取了研究組1484例和對(duì)照組1188例，并在后續(xù)工作中從來自6個(gè)洲的17個(gè)國家選取了對(duì)照組6901例，研究組20727例進(jìn)行Meta分析，發(fā)現(xiàn)了新的基因CACNA1A的rs4926244與剝脫綜合征發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。這是自LOXL1基因以來的又一新的基因位點(diǎn)。

CACNA1A編碼P/Q型電壓依賴的鈣通道的α1A亞單位。鈣通道運(yùn)送鈣離子穿過細(xì)胞膜，并在產(chǎn)生和傳送電信號(hào)中扮演重要作用。之前關(guān)于剝脫綜合征的電鏡研究表明：高濃度鈣離子與形成剝脫纖維物質(zhì)直接相關(guān)。另外，原纖維蛋白利用鈣離子形成穩(wěn)定的聚集[14]。我們可以假設(shè)鈣通道的改變作用可以導(dǎo)致鈣離子聚集的改變，這種作用也許更容易形成剝脫物質(zhì)聚集[15]。關(guān)于CACNA1A基因在眼部組織的表達(dá)的信息很缺乏，我們從許多人類的眼部組織及癌細(xì)胞株中分別發(fā)現(xiàn)了mRNA的表達(dá)輪廓及蛋白表達(dá)。我們發(fā)現(xiàn)除了視神經(jīng)節(jié)，CACNA1A基因的mRNA在所有眼部組織中都有所表達(dá)，例如睫狀體、虹膜、晶狀體前上皮、視神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和視網(wǎng)膜感光細(xì)胞[16]。

APOE位于19q13.2染色體上，編碼APOE蛋白。該蛋白是一種富含精氨酸的堿性蛋白，由299個(gè)氨基酸殘基組成，相對(duì)分子質(zhì)量為3,4000，含32個(gè)精氨酸和12個(gè)賴氨酸[15]。APOE的合成是由位于一個(gè)基因位點(diǎn)上的3個(gè)等位基因，即e2、e3、e4所控制，每個(gè)等位基因?qū)?yīng)1個(gè)主要異構(gòu)體，產(chǎn)生3種純合子(E2／2、E3／3、E4／4)和 3 種雜合子(E2／3、E2／4、E3／4)共6種常見的表型。在自然人群中，e3基因頻率最高，APOE E3／3 表型分布約占 70%[17-19]。 AI—Dabbagh等[20]的研究表明在沙特阿拉伯人群中，APOE可能是XFS的一個(gè)危險(xiǎn)因子，而等位基因￡3可能起到保護(hù)作用。Yilmaz等[21]則報(bào)道APOE的等位基因e2與土耳其人群的XFS有密切聯(lián)系，XFS患者人群中￡2基因頻率約為50%。也有關(guān)于APOE和青光眼關(guān)聯(lián)性的研究，早期的研究資料主要是關(guān)于澳大利亞白人[22]、瑞典[23]、英國[24-25]等人群，日本[26]、中國[27]較少有關(guān)于這方面的報(bào)道，且研究結(jié)果并不一致。在德國和挪威的XFS患者中，APOE基因型和基因頻率與正常人群沒有明顯的區(qū)別[28-29]。

上述研究表明，CACNA1A基因的rs4926244位點(diǎn)及與APOE基因的rs429358、rs7412位點(diǎn)新疆維吾爾族XFS的發(fā)病無關(guān)，也許是樣本量還不夠大?；诹餍胁W(xué)調(diào)查卻發(fā)現(xiàn)XFS高發(fā)于新疆維吾爾族，而新疆維吾爾族為相對(duì)隔離群體，遺傳背景較為單一，居住相對(duì)集中和固定，是研究XFS的理想人群[30-32]。本研究中研究組和對(duì)照組樣本均來自于同一地區(qū)、同一個(gè)遺傳上相對(duì)均質(zhì)的相對(duì)隔離群體，因此本研究結(jié)論是相對(duì)可信的。此外，XFS是多基因變異共同作用所致，每一個(gè)基因的單個(gè)位點(diǎn)變異對(duì)疾病有所影響，對(duì)于XFS的發(fā)病機(jī)制還有待于進(jìn)一步研究。