雌二醇通過(guò)上調(diào)M-CSF表達(dá)促進(jìn)乳腺癌教化單核細(xì)胞

季秋蘭　丁景弦

【摘要】 目的：研究雌二醇對(duì)MCF-7細(xì)胞教化單核細(xì)胞分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的影響。方法：分別用10 nM雌二醇及10 nM雌二醇+1 μM他莫昔芬處理雌激素受體陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞株MCF-7，48 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，利用細(xì)胞因子芯片檢測(cè)不同處理組單核細(xì)胞活化相關(guān)蛋白與空白對(duì)照組MCP-1及M-CSF的表達(dá)差異，利用細(xì)胞Transwell niche檢測(cè)其對(duì)單核細(xì)胞活化功能的影響。結(jié)果：Bio-Rad細(xì)胞因子芯片檢測(cè)發(fā)現(xiàn)空白對(duì)照組、雌二醇組及雌二醇+他莫昔芬組細(xì)胞上清中CSF1濃度分別為（1.83±0.18），（29.71±8.06）及（10.90±2.38）pg/mL，MCP-1分別為（31.33±2.40），（75.37±5.50）和（41.97±5.80）pg/mL，比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。雌二醇處理組CD163的mRNA水平是對(duì)照組（76.83±12.80）倍，他莫昔芬加雌二醇組是對(duì)照組的（6.5±1.71）倍，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96，P<0.01）。對(duì)照組、雌二醇處理組及他莫昔芬加雌二醇處理組每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)U937細(xì)胞數(shù)目分別為（28±6）、（188±16）及（82±9）個(gè)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=160，P<0.05）。結(jié)論：雌二醇通過(guò)上調(diào)激素依賴型乳腺癌細(xì)胞株MCF-7表達(dá)M-CSF從而增強(qiáng)其對(duì)單核細(xì)胞的教化，而他莫昔芬可部分阻斷其發(fā)揮效應(yīng)。

【關(guān)鍵詞】 激素依賴型乳腺癌; 雌二醇; 他莫昔芬; MCP-1; M-CSF

【Abstract】 Objective：To investigate the effect of Estradiol on educating monocyte differentiation into tumor associated macrophage in MCF-7 coculture system.Method：48 h after treated with 10 nM Estradiol or10 nM Estradiol+1 μM Tamoxifen，MCP-1 and M-CSF in human breast cancer cell line MCF-7 culture supernatant were detected，they were given Transwell niche to further explore their effects on the recruitment and activation of monocyte.Result：Bio-Rad cytokine chip assay showed that the M-CSF concentration in the supernatant of blank control group，Estradiol group and Estradiol+Tamoxifen group were （1.83±0.18），（29.71±8.06） and （10.90±2.38） pg/mL，and the MCP-1 concentration were （31.33±2.40），（75.37±5.50） and （41.97±5.80） pg/mL respectively，the differences were statistically significant（P<0.05）.The level of CD163 mRNA in estradiol treatment group was （76.83±12.80） times higher than that in control group，and that in Estradiol+Tamoxifen group was （6.50±1.71） times higher than that in control group （F=96，P<0.01）.The number of U937 cells in the control group，the Estradiol treatment group and the Estradiol+Tamoxifen treatment group were （28±6），（188±16） and （82±9） respectively，the difference was statistically significant （F=160，P<0.05）.Conclusion：Estradiol may promote hormone dependent breast cancer cell lines MCF-7 to secrete MCP-1 and M-CSF，thereby educate monocyte differentiation into tumor associated macrophage，while Tamoxifen may partially block the effect.

【Key words】 Hormone dependent breast cancer; Estradiol; Tamoxifen; MCP-1; M-CSF

First-authors address：The Fourth Affiliated Hospital of Nanchang University，Nanchang 330001，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.01.007

乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤，美國(guó)癌癥統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示女性一生中患上乳腺癌的概率約1/8[1]。盡管與其他實(shí)體瘤相比乳腺癌患者預(yù)后較好，然而不同類型乳腺癌之間預(yù)后差異較大。根據(jù)乳腺癌細(xì)胞雌激素和/或孕激素受體表達(dá)情況可分為激素依賴型乳腺癌和激素非依賴型乳腺癌，其生存復(fù)發(fā)模式相差很大。Saphner等[2]研究發(fā)現(xiàn)激素受體陽(yáng)性乳腺癌總體年復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較激素受體陰性者低，且復(fù)發(fā)時(shí)限呈現(xiàn)雙峰分布，即在術(shù)后3年及術(shù)后7年各有一復(fù)發(fā)高峰，而激素受體陰性患者復(fù)發(fā)高峰主要是在手術(shù)后2年。病理學(xué)之父Stephen Paget醫(yī)生于1889年首次提出了腫瘤起源的“種子與土壤”理論，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為微環(huán)境可以影響腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[3]。近年來(lái)，越來(lái)越多的學(xué)者將關(guān)注點(diǎn)轉(zhuǎn)移到腫瘤細(xì)胞賴以生存的微環(huán)境上。腫瘤微環(huán)境即腫瘤中的非腫瘤細(xì)胞成分，主要包括細(xì)胞外基質(zhì)和各種基質(zhì)細(xì)胞，它們?yōu)榘┘?xì)胞發(fā)生發(fā)展提供養(yǎng)分和支撐。腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAMs）是微環(huán)境中的主要細(xì)胞成分之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。文獻(xiàn)[4-7]報(bào)道TAMs豐度是乳腺癌獨(dú)立的預(yù)后因素并有望成為乳腺癌治療的新靶點(diǎn)。

TAMs是由血液中的單核細(xì)胞游出進(jìn)入組織后在MCP-1、M-CSF、IL-6及IL-10等相關(guān)細(xì)胞因子的作用下分化而成，通常具有M2表型。TAMs在組織修復(fù)、基質(zhì)重塑和血管生成等方面起到重要促進(jìn)作用，并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。乳腺癌細(xì)胞可通過(guò)分泌MCP-1及M-CSF進(jìn)而招募單核細(xì)胞并教化其分化為M2型TAMs，TAMs增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的合成，從而為腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)提供養(yǎng)分促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)。研究表明激素非依賴型乳腺癌細(xì)胞通常高表達(dá)MCP-1及M-CSF，而且MCP-1及M-CSF的表達(dá)水平與乳腺癌的高侵襲和高轉(zhuǎn)移成正相關(guān)[8]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞在體外常規(guī)培養(yǎng)時(shí)具有高增殖能力，免疫細(xì)胞化學(xué)顯示其Ki67陽(yáng)性比例高，然而在移植瘤模型中不添加雌激素時(shí)MCF-7細(xì)胞株卻不能在SCID小鼠形成移植瘤。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上闡述雌激素對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞教化單核細(xì)胞活化分化的影響，結(jié)合臨床為他莫昔芬內(nèi)分泌治療提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7細(xì)胞原購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，U937細(xì)胞株由復(fù)旦大學(xué)馬端教授饋贈(zèng)。GFP-PURO雙標(biāo)穩(wěn)定表達(dá)U937細(xì)胞系及RFP-NEO雙標(biāo)穩(wěn)定表達(dá)MCF-7細(xì)胞系由本人攻讀博士學(xué)位期間建立[9]。

1.2 藥物和試劑 RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液（Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），雌二醇及他莫昔芬（Sigma公司），RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒均購(gòu)自日本TaKaLa公司，細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒由Bio-Plex公司專門制備。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Thermo公司，Transwell板購(gòu)自康寧公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購(gòu)自Bio-Rad公司。

1.4 方法

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將含5×103個(gè)MCF-7細(xì)胞的完全培養(yǎng)基200 μL接種于96孔板中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)后吸出培養(yǎng)上清，向其中分別加入100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基、10 nM雌二醇及10 nM雌二醇+1 μM他莫昔芬無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集上清，200 g離心5 min除去細(xì)胞碎片，相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作參考查錫良及沈祥春等發(fā)表文獻(xiàn)[10-11]，收集上清放置于-80 ℃冰箱保存待做細(xì)胞因子檢測(cè)。

1.4.2 細(xì)胞因子芯片檢測(cè)MCP-1及M-CSF濃度本實(shí)驗(yàn)預(yù)訂的Bio-plex細(xì)胞因子芯片是利用磁珠吸附原理檢測(cè)不同培養(yǎng)上清中單核細(xì)胞分化相關(guān)細(xì)胞因子MCP-1及M-CSF濃度，實(shí)驗(yàn)操作按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)操作流程進(jìn)行。

1.4.3 MCF-7乳腺癌細(xì)胞與U937細(xì)胞共培養(yǎng) 將不同實(shí)驗(yàn)組中5×105個(gè)MCF-7細(xì)胞接種于Transwell板（6孔，孔徑0.4 μm）上室中，下室種5×105個(gè)U937細(xì)胞，共培養(yǎng)48 h后觀察空白對(duì)照組、10 nM雌二醇處理組及10 nM+1 μM他莫昔芬處理組乳腺癌MCF-7細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞教化分化為M2型TAMs的差異。

1.4.4 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證雌激素對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞教化單核細(xì)胞分化 U937細(xì)胞與不同處理組MCF-7細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后，利用總RNA提取試劑盒Trizol按實(shí)驗(yàn)流程提取總RNA，利用TaKaLa試劑盒反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。利用real-time PCR檢測(cè)不同處理組U937細(xì)胞CD163表達(dá)差異。GAPDH作為內(nèi)參基因，擴(kuò)增片段引物系列見(jiàn)表1，PCR反應(yīng)條件參考既往發(fā)表文獻(xiàn)[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雌二醇對(duì)MCF-7細(xì)胞MCP-1及M-CSF表達(dá)的影響 空白對(duì)照組、雌二醇處理組及雌二醇+他莫昔芬處理組乳腺癌細(xì)胞株MCF-7培養(yǎng)上清中單核細(xì)胞分化相關(guān)細(xì)胞因子MCP-1及M-CSF蛋白濃度分別為（31.33±2.40）、（75.37±5.50）及（41.97±5.80）pg/mL，（1.83±0.18）、（29.71±8.06）及（10.90±2.38）pg/mL，不同處理組間MCP-1及M-CSF濃度差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=68，P<0.01）。雌二醇可促進(jìn)MCF-7細(xì)胞分泌MCP-1及M-CSF，而他莫昔芬可部分阻斷該效應(yīng)。見(jiàn)圖1。

2.2 雌二醇處理MCF-7細(xì)胞對(duì)共培養(yǎng)體系中U937細(xì)胞教化影響 MCF-7細(xì)胞與U937細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后U937細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，由光滑小圓形懸浮細(xì)胞部分轉(zhuǎn)變成為不規(guī)則形細(xì)胞，并有部分細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁生長(zhǎng)特性，見(jiàn)圖2?？瞻讓?duì)照組、雌二醇處理組及雌二醇+他莫昔芬處理組MCF-7細(xì)胞與U937細(xì)胞共培養(yǎng)，雌二醇處理組與U937細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后CD163的mRNA水平經(jīng)RT-qPCR檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞較對(duì)照組明顯提高，而他莫昔芬可以部分阻斷其效應(yīng)，雌二醇處理組CD163的mRNA水平是對(duì)照組（76.83±12.80）倍，他莫昔芬加雌二醇組是對(duì)照組的（6.50±1.71）倍，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=96，P<0.01）。見(jiàn)圖3。對(duì)照組、雌二醇處理組及他莫昔芬加雌二醇處理組每個(gè)高倍鏡視野內(nèi)U937細(xì)胞數(shù)目分別為（28±6）、（188±16）及（82±9）個(gè)，比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=160，P<0.05），表明雌二醇能增強(qiáng)MCF-7細(xì)胞對(duì)U937細(xì)胞的教化作用，而他莫昔芬可部分阻斷這種效應(yīng)，見(jiàn)圖4。

3 討論

雌二醇在激素依賴型乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，是癌細(xì)胞賴以生存的有利“土壤”[13]。研究表明，雌二醇主要通過(guò)與雌激素受體結(jié)合來(lái)發(fā)揮促腫瘤效應(yīng)，然而具體下游信號(hào)通路機(jī)制尚不明確。他莫昔芬作為一種雌激素受體調(diào)節(jié)劑，是一種臨床上常見(jiàn)的激素依賴型乳腺癌患者內(nèi)分泌治療藥物。他莫昔芬通過(guò)與雌二醇競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合雌激素受體，從而阻斷雌二醇對(duì)激素依賴型乳腺癌細(xì)胞的促進(jìn)作用，可有效降低激素依賴型乳腺癌患者的復(fù)發(fā)死亡風(fēng)險(xiǎn)[14-15]。TAMs是腫瘤微環(huán)境中的重要細(xì)胞組成成分，主要通過(guò)促進(jìn)新血管生成和瘤旁炎性反應(yīng)等來(lái)發(fā)揮其在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移的作用。