苦參堿誘導K562細胞分化與STAT3基因表達水平研究

王健 林貴斌 曹佳淋

【摘要】 目的：觀察苦參堿對人慢性粒細胞白血病K562細胞的體外增值情況，探索潛在的分子機制。方法：顯微鏡下查看苦參堿對K562細胞的影響，聯(lián)苯胺染色測定K562細胞的分化趨向，采用MTT法測定K562細胞在用藥后的增殖抑制效應(yīng)，通過流式細胞術(shù)以及雙標記法測定K562細胞的周期變化和凋亡作用。結(jié)果：相較于陰性對照組，當苦參堿為0.05、0.10和0.20 mg/mL，K562細胞均呈現(xiàn)紅系分化趨勢，以0.05 mg/mL最為突出。MTT結(jié)果表明0.2、0.5和1.0 mg/mL對K562細胞表現(xiàn)出的生長抑制率依次為26.15%、45.90%和63.52%（P<0.01），有效濃度0.6 mg/mL?？鄥A能夠?qū)562細胞定格于S期，抑制有絲分裂，誘導K562細胞快速地凋亡，0.2、0.5和1.0 mg/mL，對K562細胞的凋亡率依次為5.30%、62.13%與56.73%，明顯高于對照組細胞的1.67%（P<0.01）。結(jié)論：針對體外增殖的人慢粒K562細胞，苦參堿有明顯的抑制效果，可誘導細胞紅系分化，促進早期凋亡。

【關(guān)鍵詞】 苦參堿; 慢性粒細胞白血病; K562細胞; 細胞分化; 細胞凋亡

【Abstract】 Objective：To observe the effect of matrine on human chronic leukemic cell lines K562 in vitro，and to explore the possible mechanism.Method：Morphological changes of K562 cells were observed by light microscopy.The tendency of K562 cells towards erythroid differentiation was detected by benzidine staining.The effect of matrine on the proliferation inhibition and the cell cycle of K562 were determined by MTT assay and flow cytometry，respectively.Annexin V-FITC/PI affinity assay was used to detect the apoptosis of K562 cells induced by matrine.Result：Compared to untreated K562 cells，the cells treated with matrine at the concentration of 0.05，0.10 and 0.20 mg/mL all exhibited erythroid differentiation and the effect of 0.05 mg/mL matrine was the most significant.The proliferation inhibitory rates were 26.15%，45.90% and 63.52% by MTT assay after treated with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine，respectively.The median concentration of matrine was 0.6 mg/ml.Matrine can also block K562 cells cycle at the S stage，prevent the cells division from mitosis and induce the cells into apoptosis.About 5.30%，62.13% and 56.73% K562 cells were induced apoptosis with 0.2，0.5 and 1.0 mg/mL matrine treatment by the Annexin V-FITC/PI affinity assay，respectively，with a significant difference compared with the spontaneous apoptosis（1.67%）of the untreated cells（P<0.01）.Conclusion：Matrine can inhibit the proliferation of human CML K562 cells in vitro，induce erythroid differentiation and promote early apoptosis.

【Key words】 Matrine; Chronic myelocytic leukemia; K562 cell lines; Differentiation; Apoptosis

First-authors address：The Third Peoples Hospital of Huizhou，Huizhou 516000，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.07.006

慢性粒細胞白血病（chronic myelogenous leukemia，CML）作為一種血液惡性腫瘤，發(fā)病率較高。我國青少年中，CML也是最普遍的惡性腫瘤，它呈現(xiàn)高度增生、侵襲性高的生物學特征，慢粒防治長期為臨床的重點?？梢姡业叫滦偷闹委煼椒ㄅc抗癌藥物，對慢粒的臨床治療有深遠的意義[1]?？鄥A（Matrine）最早源于傳統(tǒng)中藥典籍，是從苦參中提取而來的生物堿成分，有消炎、抗病毒、鎮(zhèn)痛和抗心律失常等不同的藥理學作用[2-3]。近年研究表明，它有顯著的抗腫瘤活性，能夠減少腫瘤細胞的過度增殖、惡性轉(zhuǎn)移，加速凋亡或使其分化[4]。不過，苦參堿用于防治慢性白血病的分子機制尚未明確，需有更多的實驗依據(jù)才能用于臨床。本院選取人慢粒白血病K562細胞，通過體外細胞培養(yǎng)、流式細胞術(shù)等實驗室方法評價了苦參堿對K562細胞的增殖效果，總結(jié)了潛在的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器

1.1.1 苦參堿 分子量248.36，純度99.9%，由陜西省科學院化學研究所提供。使用雙蒸水配備10 g/L儲存液，在-20 ℃下進行儲存。

1.1.2 細胞株及培養(yǎng) 人慢性粒細胞白血病K562細胞株，由中國科學院上海細胞所負責提供，在RPMI 1640培養(yǎng)基[10%小牛血清（FCS）+青、鏈霉素（濃度依次為100 U/mL、100 μg/mL）]中，進行傳代培養(yǎng)。

1.1.3 主要試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基：GIBCO產(chǎn)品（美）+三蒸水（ddH2O）進行配備，0.22 μm濾膜抽濾滅菌，于4 ℃下進行存儲。小牛血清（FCS）均由杭州四季青生物研究所提供。溴化-（4，-5二甲基噻唑-2）-2、臺盼藍染液均是由美國Sigma公司提供。Annexin V-FITC Kit，由晶美生物工程公司負責供應(yīng)。細胞培養(yǎng)板：Corning公司（美）。CO2培養(yǎng)箱：Heraeus公司（德）;超凈工作臺：源自蘇州凈化設(shè)備廠;低溫離心機：Hitachi Himal，LF15型，日本;純水儀：Milli-Q Academic Water Purification Sys（美）;全自動酶標儀（Bio-Rad Model 680型）;流式細胞儀：Beckon Dickinson公司（美）。

1.2 實驗方法及檢測指標

1.2.1 形態(tài)學觀察 苦參堿前后，觀察倒置光學顯微鏡下細胞自身的形態(tài)學變化。

1.2.2 聯(lián)苯胺染色 對數(shù)生長期K562細胞，細胞濃度調(diào)至6×104/mL，摻加6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL。實驗組：摻加苦參堿藥液，終濃度依次為0.05、0.10以及0.20 mg/mL;陰性對照組：摻加等體積RPMI 1640培養(yǎng)液。將細胞培養(yǎng)板放入到37 ℃下，濕度飽和，5%比例的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔2～3天對RPMI 1640培養(yǎng)基進行更換，藥物濃度一致。6 d后搜集細胞來完成聯(lián)苯胺染色，以200個細胞為例，在顯微鏡下觀察染色陽性細胞的個數(shù)，計算出聯(lián)苯胺染色陽性率。

1.2.3 苦參堿對K562細胞作用濃度-時間曲線的測定 搜集對數(shù)生長期K562細胞，將細胞濃度調(diào)至1.8×105/mL，摻加到12孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 mL。實驗組：摻加苦參堿藥液，終濃度依次為0.2，0.5以及1.0 mg/mL。陰性對照組：摻入人等體積RPMI 1640培養(yǎng)液，各種濃度均設(shè)計6個平行孔。將細胞培養(yǎng)板放入到37 ℃下，濕度均飽和，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)。每組選擇1孔，運用臺盼藍拒染法來對活細胞數(shù)進行計算，接連6 d，查看不同時段、各種濃度苦參堿對K562細胞生長產(chǎn)生的不同影響。

1.2.4 MTT增殖實驗 搜集對數(shù)生長期K562細胞，將細胞濃度調(diào)至6×104/mL，在96孔板中進行接種，200 μL/孔。實驗組：將苦參堿藥液摻加到細胞中，終濃度依次為0.2、0.5以及1.0 mg/mL。陰性對照組：不摻入苦參堿藥液。空白對照組：摻加等體積RPMI 1640培養(yǎng)基，每個小組設(shè)計8個獨立的平行孔。在37 ℃下擺放培養(yǎng)板，濕度適中，5%濃度的 CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，時間44 h，對細胞上清液150 μL進行離心，每孔摻入RPMI 1640 培養(yǎng)基200 μL;5 mg/mL MTT溶液20 μL，接連培養(yǎng)4 h，將上清150 μL予以倒出，摻加二甲基亞砜200 μL，振蕩5 min確保藍色結(jié)晶可以溶解;充分混勻，利用酶標儀來讀取吸光度值（A570）。細胞生長抑制率（%）=（1-實驗組A570均值/對照組A570均值）×100%

1.2.5 細胞周期分析 搜集對數(shù)生長期K562細胞，將細胞濃度調(diào)至3.5×105/mL，摻加到6孔細胞培養(yǎng)板，每孔1 mL。實驗組：摻加苦參堿藥液，終濃度依次為0.2、0.5以及1.0 mg/mL。陰性對照組：摻入人等體積RPMI 1640培養(yǎng)液，各種濃度均設(shè)計6個平行孔。將細胞培養(yǎng)板放入到37 ℃下，濕度均飽和，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中開始培養(yǎng)。離心處理后搜集細胞，使用PBS進行洗滌，后用70%冷乙醇加以固定。碘化丙啶（PI）在室溫條件下染色30 min，利用流式細胞儀來測定細胞的周期變化和時相，得到細胞增殖指數(shù)（PI）。PI（%）=（S+G2/M）/（G1+S+G2/M）×100%

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 雙標記法檢測細胞早期凋亡 搜集對數(shù)生長期K562細胞，將細胞濃度調(diào)至3.5×105/mL，在6孔板中進行接種，200 μL/孔。實驗組：將苦參堿藥液摻加到細胞中，終濃度依次為0.2、0.5以及1.0 mg/mL。陰性對照組：不摻入苦參堿藥液;空白對照組：摻加等體積RPMI 1640培養(yǎng)基。在37 ℃下擺放培養(yǎng)板，濕度適中，5%濃度的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，時間48 h，離心處理后收集細胞，將其在緩沖液中進行懸浮，F(xiàn)ITC標記Annexin V以及PI在常溫下孵育，大約10 min，利用流式細胞儀來測定細胞的凋亡狀態(tài)。

1.3 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 17.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用（x±s）表示，比較采用t檢驗，行單因素方差分析，比較采用q檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學觀察 未用藥K562細胞，呈現(xiàn)懸浮的生長狀態(tài)，外形圓，胞漿顆粒少，有時可見空泡;經(jīng)處理后，胞體顯著的變小，核染色質(zhì)也開始密閉，核仁逐漸消失，此時細胞成呈現(xiàn)為串珠樣，出現(xiàn)了非常多的細胞碎片或是出芽細胞。

2.2 聯(lián)苯胺染色 經(jīng)過0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦參堿作用，陽性細胞的百分比依次為10%，4%以及3%，不同濃度下K562細胞均呈現(xiàn)了紅系分化的走向，以0.05 mg/mL濃度最為突出。

2.3 苦參堿對K562細胞的增殖抑制作用 從圖1看出，苦參堿濃度變大后，K562細胞自身的增殖率會慢慢地遞減;時間越長，該趨勢也會下降?？梢娍鄥A的抑制作用，對劑量-時間有較強的依賴性。從圖2、表1中看出，0.2、0.5和1.0 mg/mL苦參堿經(jīng)過48 h作用后，K562細胞生長也將明顯地被抑制，抑制率依次為（26.15±5.46）%、（45.9±3.59）%與（63.52±3.12）%，其中有效濃度0.6 mg/mL，基本符合生長曲線。

2.4 不同濃度苦參堿對K562細胞周期的影響 從表2和圖3、4中發(fā)現(xiàn)，0.2 mg/mL苦參堿能夠抑制G0/G1期細胞，使S期細胞明顯地擴增。當苦參堿濃度變大，G0/G1期細胞也會明顯地減少，而S期細胞反倒會增多。說明苦參堿能夠?qū)562細胞的周期明顯地阻滯于S期，延緩G2/M期進程，防止細胞過多地有絲分裂，加速細胞凋亡。

2.5 苦參堿對K562細胞的誘導凋亡的作用 從圖5不難看出，0.2、0.5以及1.0 mg/mL的苦參堿，誘導K562細胞的凋亡百分率依次為5.30%、62.13%以及56.73%，相較于對照組細胞原本的自發(fā)凋亡率1.67%明顯更高，以0.5 mg/mL苦參堿尤為突出。當苦參堿自身的作用濃度及其時間延長后，K562細胞的壞死占比也在提升。但是，凋亡細胞占比并未隨之上升，這可能是由苦參堿的作用時間及其濃度所致。濃度較高或時間較長，細胞更容易壞死，但不是凋亡。

3 討論

腫瘤的出現(xiàn)，是由于多種基因的非正常表達，誘導細胞的過速增殖與凋亡抑制。故而，控制和預防腫瘤細胞的過速增殖、加速凋亡，這是臨床治療腫瘤的可靠方法。近些年，有人嘗試從祖?zhèn)麽t(yī)學中尋找新型的抗癌藥物用于腫瘤的治療?？鄥A，實際上是從苦參根中提取而來的活性成分。按照中國藥典的記載，苦參堿能夠達到抗病毒、消腫以及抗心律失常等多重不同的藥理活性。如今，醫(yī)學各界也開始關(guān)注苦參堿的抗癌效應(yīng)。

研究發(fā)現(xiàn)苦參堿能夠抑制人白血病細胞U937的增殖，誘導其凋亡，且作用呈劑量依賴性關(guān)系[5-7]。

苦參堿可上調(diào)白血病細胞表面部分NKG2D配體分子的表達，也可明顯降低急性白血病患者血清sICAM-1、sVCAM-1水平，改善常規(guī)化療藥物療效，促進患者康復[8-13]。本研究以細胞生長實驗、細胞形態(tài)學以及Annexin V-FITC/PI雙標記法等常見的實驗方法，測定和對比了苦參堿對于在體外人慢粒白血病K562細胞生長特性的不同影響，得知苦參堿可以有效地抑制人K562細胞的過速生長，促使K562沿著紅系方向開始分化，使細胞出現(xiàn)早期凋亡。MTT實驗表明：0.2 mg/mL苦參堿能夠防止K562細胞在體外過快地生長，其中有效濃度0.6 mg/mL。當濃度擴大后，苦參堿對于K562細胞生長表現(xiàn)出來的抑制效應(yīng)與時間、劑量相關(guān)。本研究中0.2 mg/mL或更多的苦參堿，可以將K562細胞成功地阻滯于G1→S期，減小細胞原本的增殖指數(shù)（P<0.01）。在周期轉(zhuǎn)換進程中，該指數(shù)比較關(guān)鍵。研究顯示，多種抗癌藥物均是對細胞周期內(nèi)部的兩個時相轉(zhuǎn)換點G1→S以及G2→M進行阻斷，來調(diào)控細胞周期，這主要是干擾周期蛋白自身的表達水平[14-16]。故而，筆者猜測苦參堿也能夠抑制細胞中DNA的有效合成，減少有絲分裂，使K562細胞無法在體外過速地增殖。

光學顯微鏡下，筆者看到苦參堿應(yīng)用后K562細胞表現(xiàn)出突出的凋亡特點，符合文獻[17-19]報道。聯(lián)苯胺染色法得知：0.05、0.10以及0.20 mg/mL苦參堿時，K562細胞呈現(xiàn)出紅系分化的走向，0.05 mg/mL時尤為突出。研究發(fā)現(xiàn)，苦參堿誘導K562細胞走向分化、上調(diào)p27kipl蛋白表達，均是和減少蛋白依賴激酶（CDK）活性產(chǎn)生關(guān)聯(lián)。p27kipl，是近來新找到的CDK抑制劑，又被叫作細胞凋亡促進因子，能夠參與細胞分化[20-21]。除上述外，Annexin V-FITC/PI結(jié)果也提示：苦參堿處理能夠促進K562細胞走向快速地凋亡（P<0.01）。

綜上所述，誘導凋亡應(yīng)該是苦參堿抑制K562細胞在體外過速增殖的分子機制。筆者從實驗中也得出，當苦參堿自身的作用濃度及其時間增加后，K562細胞的凋亡率仍未變動，呈顯著的劑量效應(yīng)。不過，K562細胞自身的壞死率有所提升。推測原因：苦參堿的濃度及其作用時間，會帶來不同的效應(yīng)，高濃度或是作用時間長，細胞更容易壞死而不是凋亡。與低濃度或是短時間作用相比，細胞結(jié)構(gòu)及其生物學功能更容易變化。如凋亡，而不是整體結(jié)構(gòu)或是功能的完全喪失。本研究對臨床用藥或有一定的指導意義。

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（收稿日期：2018-07-10） （本文編輯：周亞杰）