文物蛋白膠料的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法探討

王子銘，王麗琴，馬珍珍，楊 璐

(1.西北大學(xué)文化遺產(chǎn)學(xué)院，陜西 西安 710069；2.文化遺產(chǎn)研究與保護(hù)技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 西安 710069)

中國(guó)古代所使用的膠結(jié)材料主要是天然化合物，如雞蛋、動(dòng)物膠(骨皮、乳汁、血液)及植物膠等，該類物質(zhì)易降解、老化，給分析鑒定工作帶來(lái)了挑戰(zhàn)。目前，文物蛋白膠結(jié)材料(以下簡(jiǎn)稱“膠料”)的分析方法主要有氨基酸分析法[1]、紅外光譜法[2-4]、拉曼光譜法[5-6]、高效液相色譜法[7]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[8-9]等。氨基酸分析法能檢測(cè)蛋白質(zhì)水解后生成的單一氨基酸，測(cè)定膠料中氨基酸總量，但需要樣品量較大[10]；紅外光譜和拉曼光譜同屬振動(dòng)光譜，與色譜技術(shù)相比，檢出限較高[6]，但紅外光譜法只能通過(guò)特征峰鑒別含有多糖和蛋白質(zhì)的膠結(jié)材料，難以細(xì)分膠料種類[2]。色譜法是常見(jiàn)的有機(jī)物分析方法，其中液相色譜法具有優(yōu)異的重現(xiàn)性，適用于不易氣化或受熱易分解的樣品。但測(cè)定文物蛋白膠料時(shí)，由于氨基酸本身在紫外區(qū)吸收很弱，熒光性質(zhì)也較差，需先將其衍生為紫外吸收較強(qiáng)或有熒光性質(zhì)的物質(zhì)以便測(cè)試[11]。與液相色譜法相比，氣相色譜法更適于分析易氣化的樣品，具有較高的分離效能和靈敏度[12]，氣相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用后，在具有高效分離性能的基礎(chǔ)上，兼具特異鑒別能力[13]，這對(duì)測(cè)量復(fù)雜的文物樣品體系十分重要。

國(guó)內(nèi)外學(xué)者已利用GC-MS鑒定文物中的多種膠結(jié)材料。Guttmann等[14]使用GC-MS鑒別了19世紀(jì)特蘭西瓦尼亞玻璃繪畫(huà)中的膠結(jié)材料及其降解產(chǎn)物，其中雞蛋、動(dòng)物膠、牛奶(酪蛋白)和亞麻籽油廣泛應(yīng)用，部分樣品使用了松香和多糖類物質(zhì)；在古羅馬壁畫(huà)膠結(jié)材料中，植物蠟、十字花科植物油及松香等植物提取物比動(dòng)物膠更受偏愛(ài)[15]。GC-MS分析結(jié)合光學(xué)顯微鏡觀察能用于壁畫(huà)工藝研究。例如，Tomasini等[16]采用該技術(shù)確定玻利維亞圣母瑪利亞教堂的壁畫(huà)是先用動(dòng)物膠涂在石膏層上打底，然后將雞蛋和亞麻籽油與顏料混合的繪制工藝。但GC-MS鑒定蛋白膠料的方法學(xué)研究在國(guó)內(nèi)外仍為空白。本研究擬探討文物蛋白膠料的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，測(cè)定丙氨酸、甘氨酸等11種氨基酸的精密度和檢出限，并應(yīng)用于文物蛋白膠料的鑒定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品，配有電子轟擊離子源(EI)及數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；MSD-8G微波消解儀：上海新儀微波化學(xué)科技公司產(chǎn)品；KQ-500E超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司產(chǎn)品；LXJ-ⅡB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；QYN100-2氮?dú)獯祾邇x：上海喬躍電子有限公司產(chǎn)品；Master-S Hitech-Sciencetool實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)：上海和泰儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

AAS18混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(包含L-丙氨酸、甘氨酸、L-纈氨酸、L-亮氨酸、L-異亮氨酸、L-絲氨酸、L-脯氨酸、L-苯丙氨酸、L-天冬氨酸和L-谷氨酸，濃度均為2.5 mmol/L)，L-羥脯氨酸(簡(jiǎn)稱Hyp)，內(nèi)標(biāo)氨基酸為L(zhǎng)-正亮氨酸(簡(jiǎn)稱Nor)，衍生化試劑為N-(叔丁基二甲硅烷基)-N-甲基三氟乙酰胺(簡(jiǎn)稱MTBSTFA)+1%特丁基二甲基氯代硅烷：均為美國(guó)Sigma-Aldrich公司產(chǎn)品；氨水、吡啶：色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所產(chǎn)品；三乙胺：色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；高純氦氣(純度99.999%)：四川梅塞爾氣體產(chǎn)品有限公司產(chǎn)品；鹽酸：優(yōu)級(jí)純，四川西隴化工有限公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：Master-S Hitech-Sciencetool實(shí)驗(yàn)室超純水。

豬皮膠：按照古代動(dòng)物膠的制作工藝制成[17]；全蛋和牛奶：均為市售雞蛋和牛奶。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 色譜柱：HP MS-5毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序：100 ℃保持2 min，以6 ℃/min升至280 ℃，并保持至所有待測(cè)物全部流出；載氣(He)流速1.5 mL/min。

1.3.2質(zhì)譜條件 電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；接口溫度280 ℃；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1標(biāo)準(zhǔn)曲線 (1) 樣品配制：以水為溶劑將上述AAS18混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋10倍，溶液中所分析的11種氨基酸濃度為0.25 mmol/L，該溶液簡(jiǎn)稱為“混標(biāo)”。分別取適量Hyp和Nor粉末，用水配制成1.25 mmol/L Hyp溶液，80 μg/g Nor溶液備用。(2) 取樣、加內(nèi)標(biāo)：共選擇8個(gè)濃度點(diǎn)，取1、3、5、7、9、11、13、15 μL(混標(biāo)和Hyp溶液各1 μL，以下同)，分別加入5 μL 80 μg/g Nor內(nèi)標(biāo)，氮?dú)獯祾邇x吹干。(3) 衍生化處理：在每個(gè)吹干后的樣品中，分別加入40 μL吡啶、10 μL衍生化試劑、2 μL三乙胺，放入烘箱中，于65 ℃下衍生30 min。(4) GC-MS測(cè)試：吸取2 μL樣品，手動(dòng)進(jìn)樣，按照1.3節(jié)條件進(jìn)行測(cè)試，平行測(cè)量6次。

1.4.2檢出限 (1) 萃取：加1 200 μL 2.5 mol/L氨水溶液于樣品瓶中，置于超聲波儀中萃取1.5 h，重復(fù)2次，將離心得到的上層萃取液于氮?dú)獗Ｗo(hù)下吹干。(2) 凈化：采用固相萃取C4柱進(jìn)行樣品凈化，方法同文獻(xiàn)[18]。(3) 水解：微波輔助鹽酸法水解蛋白質(zhì)。在步驟(2)的樣品瓶中加入2滴6 mol/L HCl，置于加有10 mL 6 mol/L HCl的消解罐中，充入氮?dú)獠⒘⒓葱o消解罐蓋子，于微波消解儀中進(jìn)行水解。微波水解條件為：在500 W功率下，100 ℃加熱15 min后升溫至160 ℃，加熱30 min。(4) 衍生化處理：取出樣品瓶，冷卻降溫后加入5 μL 80 μg/g Nor內(nèi)標(biāo)，并于氮?dú)獗Ｗo(hù)下吹干。衍生化處理方法同1.4.1節(jié)中的步驟(3)。(5) GC-MS測(cè)試：方法同1.4.1節(jié)中的步驟(4)，平行測(cè)量12次。

1.4.3現(xiàn)代參考膠料的分析檢測(cè) 分別取豬皮膠、全蛋和牛奶膠料各5 mg，實(shí)驗(yàn)方法同1.4.2節(jié)，僅在步驟(1)中加5 mg現(xiàn)代參考膠料，平行測(cè)量10次。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍

以校正峰面積(y)和濃度(x，μg/g)繪制11種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得相關(guān)系數(shù)和線性范圍，結(jié)果列于表1?？芍?1種氨基酸的線性關(guān)系良好，除羥脯氨酸的穩(wěn)定性略差外，其余氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的相關(guān)系數(shù)均大于0.99。

表1 11種氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍及檢出限Table 1 Linear equations, linearity ranges and limits of detection of 11 amino acids

圖1 豬皮膠(a)、全蛋(b)和牛奶(c)的GC-MS總離子流圖Fig.1 Total ion current chromatograms of pigskin glue (a), egg (b) and milk (c)

2.2 精密度

按照1.4.1節(jié)方法，混標(biāo)進(jìn)樣量11 μL(n=6)時(shí)，11種氨基酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在2.7%～6.3%范圍內(nèi)。絲氨酸、羥脯氨酸由于分子結(jié)構(gòu)中含有羥基，不穩(wěn)定，易被氧化[19]，導(dǎo)致RSD>5%，其他9種氨基酸的RSD均不超過(guò)5%。

2.3 檢出限

儀器檢出限是指在規(guī)定的條件下，當(dāng)儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，儀器本身存在的噪音引起測(cè)量讀數(shù)的漂移和波動(dòng)，其物理含義是在一定的置信范圍內(nèi)能與儀器噪音相區(qū)別的最小檢測(cè)信號(hào)對(duì)應(yīng)的待測(cè)物質(zhì)的量。

根據(jù)表1中各氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，以截距為0的曲線方程式計(jì)算求得空白樣品中每種氨基酸濃度、標(biāo)準(zhǔn)偏差及檢出限D(zhuǎn)L，其中DL計(jì)算公式如下[20]：

式中：k為置信因子；S為空白樣品響應(yīng)值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；b為截距為0時(shí)標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率(也稱“儀器靈敏度”)。取k=3，置信概率為99.7%。

由表1可知，甘氨酸的檢出限最低，為0.066 μg/g；亮氨酸的檢出限最高，為0.676 μg/g。

2.4 現(xiàn)代參考膠料的分析檢測(cè)

豬皮膠、全蛋和牛奶3種現(xiàn)代參考膠料的GC-MS譜圖示于圖1。由圖可見(jiàn)，3種現(xiàn)代參考膠料中的11種氨基酸在該色譜條件下完全分離，峰型基本呈高斯分布，基線平穩(wěn)。由表1標(biāo)準(zhǔn)曲線方程求得10次測(cè)量的氨基酸含量歸一化結(jié)果的平均值，結(jié)果列于表2。由表2可見(jiàn)，3種膠料的氨基酸含量具有特征性，豬皮膠含有的羥脯氨酸是動(dòng)物膠的特征標(biāo)志物，可以同牛奶、全蛋相區(qū)分。

表2 現(xiàn)代參考膠料和文物樣品的氨基酸含量歸一化結(jié)果Table 2 Relative amino acid molar percentage contents of reference samples and cultural relic

2.5 文物蛋白膠料的鑒定

依據(jù)本研究建立的方法對(duì)廣西服飾金線文物樣品進(jìn)行分析，結(jié)果列于表2。由表2可知，文物樣品中含有羥脯氨酸，說(shuō)明膠料中含有動(dòng)物膠。使用SPSS軟件對(duì)文物樣品和2.4節(jié)中現(xiàn)代參考膠料的氨基酸含量進(jìn)行主成分分析(簡(jiǎn)稱PCA)，結(jié)果表明，前兩個(gè)主成分Factor 1和Factor 2的累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到95.58%，說(shuō)明這兩個(gè)成分可以較好地表征原數(shù)據(jù)的信息。前兩個(gè)主成分的因子得分散點(diǎn)圖和主成分因子載荷矩陣圖分別示于圖2和圖3。

圖2 前兩個(gè)主成分的因子得分散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter scores plots of the first two factors

由圖2可知，豬皮膠、全蛋、牛奶3種現(xiàn)代參考膠料在PCA圖上各自呈明顯的聚類效應(yīng)，豬皮膠位于Factor 1軸負(fù)值方向，全蛋和牛奶位于Factor 1軸正值方向，利用Factor 1的差異可將豬皮膠與全蛋、牛奶區(qū)分；全蛋和牛奶分別位于Factor 2軸的正、負(fù)值方向，利用Factor 2的差異可將全蛋與牛奶區(qū)分，實(shí)現(xiàn)3類膠料的鑒別。3類膠料產(chǎn)生這種聚類效應(yīng)的原因可由圖3和表2解釋：高含量的羥脯氨酸和甘氨酸會(huì)導(dǎo)致向Factor 1軸負(fù)向移動(dòng)，高含量的亮氨酸、谷氨酸會(huì)導(dǎo)致向Factor 1軸正向移動(dòng)；結(jié)合表2，豬皮膠含有羥脯氨酸(9.33%)、高甘氨酸(31.74%)、低亮氨酸(4.32%)和低谷氨酸(11.19%)，全蛋、牛奶不含羥脯氨酸，含有低甘氨酸(5.58%、2.84%)、高亮氨酸(11.88%、12.58%)和高谷氨酸(18.59%、27.67%)，導(dǎo)致豬皮膠和全蛋、牛奶分別位于Factor 1軸的正、負(fù)方向。同理，全蛋的高絲氨酸和天冬氨酸、牛奶的高谷氨酸含量，導(dǎo)致兩者分別處于Factor 2軸的正負(fù)方向。根據(jù)圖2，推測(cè)文物樣品成分為動(dòng)物膠和蛋類的混合膠。

圖3 主成分因子載荷矩陣圖Fig.3 Load matrix plot of principal component factor

3 結(jié)論

本研究探討了文物蛋白膠料的氣相色譜-質(zhì)譜分析方法，結(jié)果表明，現(xiàn)代參考膠料中常見(jiàn)的丙氨酸、甘氨酸等11種氨基酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性關(guān)系良好，其中10種氨基酸曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.99，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.7%～6.3%之間，檢出限范圍為0.066～0.676 μg/g。氣相色譜-質(zhì)譜分析結(jié)合主成分分析鑒定出廣西服飾金線文物樣品的膠料為動(dòng)物膠和蛋類的混合膠。該方法適用于文物蛋白膠料的定量分析，可為GC-MS分析蛋白膠結(jié)材料提供方法參考。