基于UHPLC-MS/MS分析痕量芥子氣染毒血樣中血紅蛋白加合物

陳 博，于惠蘭，劉石磊，劉昌財(cái)，梁龍輝，楊 旸，吳姬娜，李曉森

(1.國民核生化防護(hù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205；2.防化研究院分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室，北京 102205)

芥子氣，即2，2’-二氯乙基硫醚，是一種很強(qiáng)的糜爛性毒劑，會(huì)引起炎癥、糜爛等癥狀[1]。芥子氣在一戰(zhàn)中被作為化學(xué)武器使用，在之后的兩伊戰(zhàn)爭、中東沖突仍引起大量的傷亡[2-3]。二戰(zhàn)后，日本在中國境內(nèi)遺棄的化學(xué)武器含有大量的芥子氣[4]，時(shí)至今日，由芥子氣引起的人員傷亡事件仍時(shí)有發(fā)生。因此，芥子氣暴露后的溯源性分析十分必要。

芥子氣進(jìn)入人體后，可以形成芥子氣-蛋白加合物、芥子氣-DNA加合物等大分子加合物，這些生物標(biāo)志物可以在人體內(nèi)存在數(shù)月[5-8]。研究發(fā)現(xiàn)[5,9]，芥子氣-血紅蛋白加合物(HD-HGB)是比較穩(wěn)定的芥子氣染毒生物標(biāo)志物，可在人體內(nèi)存在120天左右。HD-HGB的檢測方法有兩種：一種是通過Edman降解得到N-纈氨酸加合物(HETE-Val)[10-14]，即使用酸性丙酮從血紅蛋白中分離出珠蛋白，溶于甲酰胺之后與異硫氰酸五氟苯酯(PFPITC)發(fā)生Edman降解，使用甲苯萃取得到HETE-Val，經(jīng)水洗、吹干、復(fù)溶后，使用七氟丁酸酐(HFBA)或七氟丁酰咪唑(HFBI)進(jìn)行衍生，隨后再次使用甲苯萃取，經(jīng)水洗、干燥、吹干、復(fù)溶之后，使用氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離源-質(zhì)譜(GC-NCI-MS)檢測。該方法可獲得較低的檢出限(約3 μg/L(20 nmol/L))[11]，但操作復(fù)雜。另一種方法是使用酸水解對(duì)HD-HGB進(jìn)行處理得到芥子氣-組氨酸加合物(HETE-His)，經(jīng)芴甲氧羰基氯(Fmoc-Cl)衍生，采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)分析[15]，該方法條件苛刻，需要使用110 ℃高溫和濃鹽酸，且酸水解后的樣品需用大量的堿進(jìn)行中和，以達(dá)到衍生反應(yīng)所需的pH值。該方法基于一個(gè)離子對(duì)進(jìn)行檢測，檢出限較高(1.5 mg/L)，不能滿足痕量芥子氣暴露染毒的定量分析要求。

本研究擬采用離心法分離芥子氣染毒人全血中的血紅細(xì)胞，去離子水漲裂釋放血紅蛋白，酸性丙酮去除血紅素后得到珠蛋白，經(jīng)鏈霉蛋白酶酶解，固相萃取柱純化，芐氧羰基氯(Cbz-Cl)衍生，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS)痕量溯源分析芥子氣染毒全血，希望為化學(xué)武器核查分析和中毒救治等提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 6460 TripleQuad 液相色譜-質(zhì)譜儀(配有電噴霧電離源)、Masshunter Qualitative Analysis B.05.00數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、固相萃取柱(Bond Elut-PPL：200 mg，3 mL；Bond Elut-NH2：200 mg，3 mL；Bond Elut-PlexaPAX：60 mg，3 mL；Bond Elut-ENV：100 mg，3 mL)、Zorbax Eclipse Plus C18預(yù)柱、Zorbax Eclipse Plus C18反相色譜柱：均為美國Agilent公司產(chǎn)品；Qasis HLB(3 mL)固相萃取柱：美國Waters公司產(chǎn)品；Eppendorf 5424臺(tái)式離心機(jī)、Eppendorf移液槍(0.1～2.5 μL、20～200 μL、100～1 000 μL)、Eppendorf 5350振蕩加熱器：均為德國Eppendorf公司產(chǎn)品。

1.2 主要材料與試劑

甲醇(LC/MS級(jí))、異丙醇(LC級(jí))、水(LC/MS級(jí))：美國Honeywell Burdick & Jackson公司產(chǎn)品；丙酮(LC級(jí))：韓國Duksan公司產(chǎn)品；乙腈(LC/MS級(jí))：美國Fisher Chemical公司產(chǎn)品；碳酸氫銨(98%)、氯甲酸芐酯(純度>95%)、甲酸(純度>98%，LC/MS級(jí))：北京J&K Scientific公司產(chǎn)品；氯化鈉(99.9%)、發(fā)煙鹽酸(37%)：美國Merck Millipore公司產(chǎn)品；鏈霉蛋白酶(貨號(hào)：25551122)：德國Roche公司產(chǎn)品；芥子氣及其模擬劑2-氯乙基乙基硫醚(2-CEES)：由本實(shí)驗(yàn)室合成；未經(jīng)芥子氣暴露的健康人全血樣品：由志愿者提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1色譜條件 Zorbax Eclipse Plus C18預(yù)柱(12.5 mm×2.1 mm×1.8 μm)、Zorbax Eclipse Plus C18反相色譜柱(100 mm×2.1 mm×1.8 μm)；流動(dòng)相：A為0.1%甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈溶液；梯度洗脫條件：0～2 min(5%B)，2～2.5 min(5%～10%B)，2.5～6.5 min(10%B)，6.5～7 min(10%～22.5%B)，7～12 min(22.5%B)，12～12.1 min(22.5%～100%B)，12.1～16 min(100%B)；后運(yùn)行3 min；流速0.3 mL/min；進(jìn)樣體積10 μL；柱溫30 ℃。

1.3.2質(zhì)譜條件 ESI正離子模式檢測；毛細(xì)管電壓4.0 kV；氣體溫度350 ℃；干燥氣：氮?dú)?，流?0 L/min；霧化氣：氮?dú)?，壓?.4×105Pa；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；分辨率：單位分辨。經(jīng)Cbz-Cl衍生后的HETE-His(HETE-His-Cbz)和經(jīng)衍生后的乙基硫乙基-組氨酸(ETE-His-Cbz)的質(zhì)譜參數(shù)列于表1。

1.4 注意事項(xiàng)

芥子氣是一種非?；顫姷拿訝€性毒劑，在處理芥子氣溶液以及芥子氣染毒全血時(shí)，需要專業(yè)人員在通風(fēng)櫥中進(jìn)行操作。任何與芥子氣直接接觸的器具均需要使用漂白液進(jìn)行徹底消毒。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液及質(zhì)量控制樣品的配制

使用異丙醇對(duì)10.0 g/L芥子氣乙腈溶液進(jìn)行梯度稀釋，得到100、70.0、30.0、20.0、10.0、5.00、3.00、1.00 mg/L一系列芥子氣標(biāo)準(zhǔn)溶液。將20.0 μL上述芥子氣標(biāo)準(zhǔn)溶液分別添加至2.00 mL空白血漿中，于37 ℃振蕩12 h，得到8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液樣品的芥子氣濃度分別為10.0、30.0、50.0、100、200、300、700、1 000 μg/L。使用空白全血對(duì)1.00 mg/L芥子氣染毒全血進(jìn)行梯度稀釋，得到染毒濃度為20.0、80.0、500 μg/L的低、中、高質(zhì)量控制(QCL、QCM、QCH)染毒血漿。將20.0 μL異丙醇加至2.00 mL空白血漿中作為空白樣品。標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、質(zhì)量控制樣品以及空白樣品均置于4 ℃冰箱保存。

表1 目標(biāo)物的質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果Table 1 Optimal parameters of mass spectrometry for analytes

注：*表示以產(chǎn)物離子及其前體離子為定量離子對(duì)

1.6 內(nèi)標(biāo)溶液的制備

將20.0 μL 2.00 mg/L 2-CEES的異丙醇溶液加入到2.00 mL血紅蛋白溶液(130 g/L)中，于37 ℃振蕩12 h，制備成內(nèi)標(biāo)溶液，于4 ℃冰箱保存。

1.7 樣品制備

1.7.1珠蛋白提取 采用Bailey等[16-17]報(bào)道的方法對(duì)珠蛋白進(jìn)行富集。首先，取100 μL染毒全血，以1 500 r/min離心10.0 min，棄去上層血漿，分離出紅細(xì)胞，用300 μL 0.9%生理鹽水清洗紅細(xì)胞2次。然后，加入100 μL去離子水，劇烈振蕩后靜置10 min，以漲裂紅細(xì)胞，釋放血紅蛋白，以10 000 r/min離心10 min去除細(xì)胞膜。再加入10 μL內(nèi)標(biāo)溶液、1.0 mL 0.12 mol/L鹽酸丙酮溶液，以分離血紅素與珠蛋白，棄去上層紅色溶液，分別使用1.0 mL 0.12 mol/L鹽酸丙酮溶液、丙酮、乙醚清洗下層沉淀。將得到的珠蛋白置于室溫自然晾干，并使用400 μL 50 mmol/L NH4HCO3水溶液懸浮。

1.7.2鏈霉蛋白酶酶解與固相萃取 在上述珠蛋白懸浮液中，加入100 μL 15 g/L鏈霉蛋白酶，在700 r/min振蕩下，于55 ℃保溫10 h。酶解后，加入1.0 mL乙腈，振蕩混勻，以13 000 r/min離心5.0 min。取上清液，真空離心濃縮至約200 μL，使用去離子水定容至500 μL。

分別用3.0 mL甲醇和3.0 mL水預(yù)先平衡PPL固相萃取柱，將上述酶解液加入平衡好的PPL柱上，先用1.0 mL 5%甲醇水溶液淋洗3次，再用1.0 mL 50%甲醇水溶液洗脫目標(biāo)物。洗脫液真空濃縮至約50 μL，用去離子水定容至100 μL。

1.7.3Cbz-Cl衍生 將上述濃縮后的洗脫液置于冰水浴中冷卻5 min，加入5.0 μL 1 mol/L NH4HCO3溶液，隨后加入2 μL Cbz-Cl，并立即置于4 ℃劇烈振蕩30 min。衍生結(jié)束后，加入1.0 μL 20%甲酸水溶液終止反應(yīng)。將得到的衍生化氨基酸加合物轉(zhuǎn)移至自動(dòng)進(jìn)樣小瓶中，待UHPLC-MS/MS分析。樣品制備操作步驟示于圖1。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

分別使用10 g/L芥子氣溶液與2-CEES溶液對(duì)血紅蛋白溶液進(jìn)行染毒，經(jīng)樣品制備后得待測液，在正、負(fù)離子模式下全掃描，選擇合適的電離方式和MRM母離子。結(jié)果表明，在ESI+模式下，HETE-His-Cbz與ETE-His-Cbz均可獲得豐度較高的[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰，故分別選擇m/z394、378作為HETE-His-Cbz、ETE-His-Cbz的母離子。由于組氨酸的側(cè)鏈有兩個(gè)加合位點(diǎn)，因此[M+H]+準(zhǔn)分子離子峰可能有2種結(jié)構(gòu)(芥子氣對(duì)應(yīng)N1-HETE-His-Cbz與N3-HETE-His-Cbz，2-CEES對(duì)應(yīng)N1-ETE-His-Cbz與N3-ETE-His-Cbz)。

采用子離子掃描進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析，對(duì)子離子進(jìn)行篩選。在扣除背景后，HETE-His-Cbz有2個(gè)豐度較大的子離子，分別為m/z105、61，其中m/z105的峰面積大于m/z61，故選擇m/z394>105為定量離子對(duì)，m/z394>61為定性離子對(duì)。ETE-His-Cbz僅有1個(gè)豐度較大的子離子m/z89，將其作為內(nèi)標(biāo)定量離子。同時(shí)對(duì)碎裂電壓和碰撞能量等條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果列于表1。

圖1 芥子氣暴露染毒樣品制備與分析流程圖Fig.1 Preparation and analysis flow diagram of HD exposed samples

圖2 酶解溫度(a)與酶解時(shí)間(b)對(duì)產(chǎn)物峰面積的影響Fig.2 Effects of digestion temperature (a) and digestion time (b) on peak area of target object

2.2 鏈霉蛋白酶酶解

鏈霉蛋白酶在pH 8左右時(shí)的酶解效率較高，但提取后的珠蛋白在pH 8的酶解液中溶解性較差，酶解體系為懸浮液。因此，酶解過程中需對(duì)體系進(jìn)行振蕩，以確保酶解體系的均一性。為提高鏈霉蛋白酶酶解珠蛋白產(chǎn)生HETE-His的效率，采用1 000 μg/L芥子氣染毒的血紅蛋白溶液(130 g/L)優(yōu)化酶解溫度、酶解時(shí)間和酶的濃度等參數(shù)。酶解溫度(37、45、50、55、60、70 ℃)和酶解時(shí)間(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0 h)對(duì)產(chǎn)物峰面積的影響示于圖2。對(duì)不同濃度、不同批次的鏈霉蛋白酶進(jìn)行考察，結(jié)果表明，3.00 g/L鏈霉蛋白酶就可以進(jìn)行高效酶解，不同批次的鏈霉蛋白酶對(duì)酶解效率無明顯影響(±5%)。因此，最終選擇酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間10.0 h。

2.3 固相萃取條件的優(yōu)化

在芥子氣染毒生物醫(yī)學(xué)樣品的分析中，SPE可以有效去除基質(zhì)干擾，提高液相色譜-質(zhì)譜的分析靈敏度[11,18]。本研究使用固相萃取柱對(duì)經(jīng)酶解后的1 000 μg/L芥子氣染毒血紅蛋白溶液(130 μg/L)體系進(jìn)行純化。考察了2種強(qiáng)度不同的陰離子交換柱(PAX，NH2)與3種非極性固相萃取柱(HLB，ENV，PPL)的純化效果。結(jié)果表明，PPL柱保留目標(biāo)物、去除雜質(zhì)的效果較好，結(jié)果示于圖3，圖中縱坐標(biāo)為經(jīng)SPE純化后目標(biāo)物的峰面積。該固相萃取柱的固定相為官能化苯乙烯-二乙烯基苯，對(duì)非極性化合物的保留具有較好效果。通過對(duì)淋洗、洗脫條件進(jìn)行優(yōu)化，最終確定最佳的淋洗條件為3.0 mL 5%甲醇水溶液(V/V)，最佳洗脫條件為1.0 mL 50%甲醇水溶液(V/V)。

2.4 Cbz-Cl衍生

由于HETE-His的質(zhì)譜響應(yīng)較差，按照文獻(xiàn)報(bào)道[15]，使用Fmoc-Cl對(duì)HETE-His進(jìn)行衍生。結(jié)果表明， Fmoc-Cl衍生后的HETE-His質(zhì)譜響應(yīng)仍較差，不能滿足痕量芥子氣染毒樣品的溯源性分析要求。因此，嘗試使用Cbz-Cl對(duì)HETE-His進(jìn)行衍生，以提高質(zhì)譜響應(yīng)，結(jié)果示于圖4。

圖3 5種固相萃取柱優(yōu)化結(jié)果Fig.3 Optimized results of 5 kinds of SPE column

圖4 100 mg/L芥子氣染毒血紅蛋白中未經(jīng)衍生(a)，經(jīng)Cbz-Cl衍生(b)和經(jīng)Fmoc-Cl衍生(c)后的MRM色譜圖Fig.4 UHPLC-MS/MS MRM chromatograms of 100 mg/L HD-spiked hemoglobin solution after underivatization (a), Cbz-Cl derivatization (b) and Fmoc-Cl derivatization (c)

2.5 2-CEES染毒血紅蛋白溶液作為內(nèi)標(biāo)

使用芥子氣模擬劑2-CEES染毒血漿作為內(nèi)標(biāo)，對(duì)芥子氣-白蛋白加合物酶解后產(chǎn)生的HETE-CPF進(jìn)行檢測，可得到較好的定量結(jié)果[19]。本研究使用2-CEES染毒的血紅蛋白作為內(nèi)標(biāo)，將其加入血紅蛋白溶液中，與血紅蛋白的組氨酸側(cè)鏈發(fā)生反應(yīng)，生成乙基硫乙基-血紅蛋白加合物。乙基硫乙基-血紅蛋白加合物經(jīng)提取、酶解、衍生后，生成ETE-His-Cbz。ETE-His-Cbz的主要碎片離子m/z89為乙基硫乙基離子([ETE]+)形成的硫鎓離子，對(duì)應(yīng)HETE-His-Cbz的主要碎片離子m/z105為羥乙基硫乙基離子([HETE]+)形成的硫鎓離子。另外，HETE-His-Cbz的碎片離子m/z61為[HETE]+的羥乙基以乙烯醇的形式斷裂丟失后形成的碎片，ETE-His-Cbz的碎片離子m/z61為[ETE]+的乙基以乙烯的形式斷裂丟失后形成的碎片，HETE-His-Cbz與ETE-His-Cbz的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖示于圖5。上述結(jié)果表明，二者具有相似的質(zhì)譜碎裂途徑。因此，2-CEES染毒的血紅蛋白可以作為芥子氣-血紅蛋白加合物定量檢測的內(nèi)標(biāo)。

圖5 HETE-His-Cbz(a)與ETE-His-Cbz(b)的產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖Fig.5 Mass spectra of product ion for HETE-His-Cbz (a) and ETE-His-Cbz (b)

2.6 專一性考察

通過分析來自20個(gè)不同的未經(jīng)芥子氣暴露染毒的人空白全血樣品，發(fā)現(xiàn)在HETE-His-Cbz保留時(shí)間的±0.1 min之內(nèi)，m/z394>105和m/z394>61這兩個(gè)離子對(duì)均不存在背景干擾。通過測定目標(biāo)物的兩個(gè)離子對(duì)峰面積比值(CIR，即定性離子對(duì)峰面積/定量離子對(duì)峰面積)對(duì)方法的專一性進(jìn)行考察。結(jié)果表明，所有芥子氣染毒全血樣品的CIR范圍在(15.0±2.4)%之間，表明本方法具有很好的專一性。

2.7 線性曲線與檢出限

通過分析8個(gè)加入內(nèi)標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，表明在芥子氣染毒濃度10.0～1 000 μg/L范圍內(nèi)，HETE-His-Cbz/ETE-His-Cbz峰面積比具有良好的線性關(guān)系，平均標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性方程為y=0.52x-1.47，相關(guān)系數(shù)R2>0.997。對(duì)線性范圍以外的高濃度樣品進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物峰面積的增長速度減緩。根據(jù)定性離子對(duì)的信噪比確定本方法的檢出限為10.0 μg/L(信噪比≈5)，結(jié)果示于圖6，比Edman降解法的檢出限(20 nmol/L，約3.2 μg/L)略高，且Edman降解法的線性范圍略寬(0.1～120 μmol/L，約15.9～1 908 μg/L，R2>0.99)[11]。

注：a.m/z 394>61；b.m/z 394>105圖6 10.0 μg/L HD染毒與空白全血樣品中HETE-His-Cbz加合物的色譜圖Fig.6 MRM chromatograms of HETE-His-Cbz from 10.0 μg/L HD-spiked blood sample and blank sample

2.8 準(zhǔn)確度與精密度考察

本實(shí)驗(yàn)分析了質(zhì)量控制樣品與標(biāo)準(zhǔn)曲線的日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果列于表2。日內(nèi)的準(zhǔn)確度范圍是90.2%～105%，精密度≤10.3%；基于兩周完成了9次分析運(yùn)行數(shù)據(jù)，日間的準(zhǔn)確度范圍是89.8%～113%，精密度≤12.4%，能夠滿足準(zhǔn)確度與精密度的相關(guān)要求[20]。

表2 方法的準(zhǔn)確度與精密度Table 2 Accuracy and precision of this method

注：濃度均為芥子氣染毒濃度

2.9 穩(wěn)定性考察

將QCL、QCM、QCH全血樣品等分3份，分別儲(chǔ)存于4 ℃、室溫以及37 ℃，一周后進(jìn)行處理和分析，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物在所有溫度下放置一周的穩(wěn)定性良好，測得的目標(biāo)物誤差為±15%。

將QCL、QCM、QCH全血樣品在-20 ℃與4 ℃之間反復(fù)凍融10次，分析檢測后，沒有發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物，可能是全血樣品反復(fù)凍融容易導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂發(fā)生溶血現(xiàn)象，使用生理鹽水清洗紅細(xì)胞時(shí)，導(dǎo)致血紅蛋白損失。繼續(xù)考察凍融次數(shù)對(duì)目標(biāo)物的響應(yīng)產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)凍融1次后，僅在QCH中檢測到目標(biāo)化合物，且目標(biāo)物峰面積與QCL初始響應(yīng)相當(dāng)。因此使用該方法分析檢測全血樣品時(shí)，需避免樣品的反復(fù)凍融。

將QCL、QCM、QCH全血樣品經(jīng)樣品制備后，對(duì)目標(biāo)物在進(jìn)樣基質(zhì)中的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)目標(biāo)物在所有溫度下反復(fù)凍融后放置一周仍是穩(wěn)定的，誤差在±15%內(nèi)，示于圖7。

圖7 穩(wěn)定性考察Fig.7 Stability of this method

3 結(jié)論

本研究建立了一種高靈敏度溯源性定性、定量檢測人全血中HD染毒血紅蛋白加合物的方法。通過提取珠蛋白、鏈霉蛋白酶酶解、PPL柱純化，將芥子氣-血紅蛋白加合物轉(zhuǎn)化為HETE-His-Cbz，采用UHPLC-MS/MS進(jìn)行分析檢測。該方法僅需在55 ℃下保溫10.0 h即可實(shí)現(xiàn)HD-HGB的完全水解，條件溫和、操作簡單，且檢出限比傳統(tǒng)酸解法降低大約150倍。通過考察20個(gè)空白的人全血樣品，表明在目標(biāo)物保留時(shí)間±0.1 min內(nèi)無背景與基質(zhì)干擾。對(duì)該方法的線性范圍、檢出限、準(zhǔn)確度與精密度和穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果均能滿足食品藥品監(jiān)督管理局生物分析方法驗(yàn)證指南[20]，適用于臨床樣本的分析。