頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值檢測的標準品選擇研究

劉昌景，梅宏成，朱 軍，何 亞，何欣龍，蔣 敬，權(quán)養(yǎng)科，王桂強

(1.公安部物證鑒定中心，北京 100038；2.南京森林警察學院，南京 210023；3.國家林業(yè)局森林公安司法鑒定中心，南京 210023；4.中國人民公安大學刑事科學技術(shù)學院，北京 100038)

近年來，穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜分析技術(shù)(stable isotope ratio mass spectrometry, IRMS)廣泛應用于農(nóng)產(chǎn)品溯源[1]、動植物生態(tài)學[2]、環(huán)境學[3]等多個領域，并嘗試運用在公安偵查及法庭科學研究中，以期獲得人的生活時空信息[4]。大量科學研究表明，人類與動物體內(nèi)的碳、氮、硫同位素取決于他們攝取的食物，但是這3種同位素都很難反映地域關系。相比較而言，氫、氧同位素代表著水源，能較好地反映地域關系。頭發(fā)角蛋白中的氫同位素比值是毛囊中一系列合成作用的結(jié)果，包括飲水、飲食和空氣中的氫來源，所以根據(jù)頭發(fā)長度和相應的生長時間，可部分反映出研究對象幾周甚至幾年內(nèi)的活動軌跡[5]，這對公安偵查破案具有重大意義。

在穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜中，樣品的穩(wěn)定同位素比值是相對于工作氣體進行測量的。測得的比值必須在各自的國際穩(wěn)定同位素參考比例尺上進行轉(zhuǎn)換才可以進行實驗室間比對。這種數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換過程通常稱為同位素數(shù)據(jù)歸一化或同位素數(shù)據(jù)校正[2]?，F(xiàn)有的同位素真值校正方法[6]主要有：1) 單點標定法(single-point anchoring)，單一利用工作參比氣，或者利用單個標準品的δ值進行倍率換算；2) 兩點校正法(two-point normalization)，利用兩個標準品的測量δ值和真值之間的差別，繪制線性曲線進行換算；3) 多點校正法(multiple-point normalization)，基于兩點校正法改良，用于繪制標準曲線的標準品多于兩個。單點標定法因其單一性和缺少參照性逐漸不被采納；兩點校正法具有兩個標準品，互為參照，較單點校正法更嚴謹，然而當兩點均出現(xiàn)偏差時則無糾錯能力；多點校正法被廣為采納，大多采用3個標準品，以其測量值為自變量，真值為因變量進行曲線擬合，繪制標準曲線，當3個標準品的測量值精確度和真實性均較高時，標準曲線的R2趨近1，且可以識別出隨機誤差，相比兩點法更為準確[6-7]。但是在多點校正法中，選擇不同的標準品會造成標準曲線的差異，進而導致校正后的真值不同。因此，對于同一種物質(zhì)/樣品，選擇統(tǒng)一的標準品和真值校正算法，可獲得準確性和重現(xiàn)性較高的同位素測定值。在同位素質(zhì)譜分析中，檢測頭發(fā)中的氫同位素相比于碳、氮同位素有更多技術(shù)難點，如空氣中交換氫的影響[8]、標準品選擇的局限性和不同校正方法帶來的誤差[9]，這些都會影響頭發(fā)中氫同位素的測量精度。已有文獻全面討論了如何消除樣品中氫與空氣氫的交換影響[10]，但尚未有對人頭發(fā)中氫同位素比值測量的標準品選擇和真值校正的系統(tǒng)分析。

本研究針對質(zhì)譜檢測氫同位素如何選擇合適的標準品、如何進行數(shù)據(jù)校正進行研究和探討。實驗擬選擇USGS42、USGS43、CBS、KHS、EMAP1和EMAP2 6種備選標準品，對其氫同位素進行多次測量，通過比較多點校正的真值校正算法，甄選出推薦的標準品組合，進行35多次反復驗證(多實驗室，時間跨度4個月)以確定其穩(wěn)定性。本工作確定的標準品組合和校正算法對于提升不同實驗室間測定人頭發(fā)δ2H的可比對性和可溯源性具有重要意義，可為構(gòu)建可供比對的全國頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值數(shù)據(jù)庫提供基本性準入標準。

1 實驗部分

1.1 儀器與參數(shù)

實驗儀器由EA-IRMS聯(lián)機系統(tǒng)組成，包括253Plus穩(wěn)定同位素比值質(zhì)譜儀、Flash EA 2000型元素分析儀、ConFlo Ⅳ連續(xù)流接口裝置，均為美國Thermo Fisher Scientific 公司產(chǎn)品。Flash EA 2000元素分析儀的載氣流速設置為100 mL/min, 吹掃進樣盤的吹掃氣流速為200 mL/min，高溫裂解爐的溫度為1 380 ℃，色譜柱柱溫80 ℃。

1.2 實驗方法

1.2.1標準品備選評測 標準品選擇的通用推薦標準[11-12]包括7個方面：1) 同位素測量時稱樣量較??；2) 穩(wěn)定性和長期保質(zhì)性；3) 易于操作和處理；4) 單一的純化合物(更推薦)；5) 與待測樣品自然組成相似；6) 比待測樣品的穩(wěn)定同位素比值更正或更負，囊括待測樣品的極值；7) 測量穩(wěn)定性高。根據(jù)以上標準，從現(xiàn)有相關文獻[9,13-15]采用的標準品及氫穩(wěn)定同位素比值檢測常用的標準品中選擇USGS42、USGS43、CBS、KHS、EMA-P1和EMA-P2 6種進行評測，結(jié)果列于表1。

USGS42和USGS43滿足上述標準第1、2、3、5、7點，特別是它們與待測樣品自然組成相似原則，應是最符合本次實驗需求的標準品。但USGS42與USGS43不滿足第4和6點，即它們并非單一化合物，且不能囊括所有頭發(fā)樣本的極值，因此有必要對這6種標準品進行系統(tǒng)的數(shù)據(jù)分析。

1.2.2真值校正標準曲線比較 在現(xiàn)有的同位素真值校正方法中，多點線性校正法相比于兩點線性校正法更嚴謹，極值范圍更寬，故本實驗甄選3種標準品，以其測量值為自變量，標準品真值為因變量進行直線擬合，進行三點校正法比對。

為獲得較高的準確性，每次測量均重復3次，即連續(xù)放置3個同一待測樣品。此外，為避免記憶效應[16]對測量值的干擾，間隔放置Empty或Blank進行測量，具體放樣位置列于表2?；诙帱c校正法，選擇3個標準品進行線性擬合，所選標準品應覆蓋待測樣品的范圍。目前已測中國人頭發(fā)樣本300余人份(覆蓋10個城市)，氫穩(wěn)定同位素的δ2H值范圍為-55‰～-80‰。比待測樣品更負的極負值可選CBS(-157)或EMA-P2(-87.8)；極正值可選USGS43(-50.3)、KHS(-35.3)、EMA-P2(-25.3)；中間值為USGS42(-78.5)。因此，可囊括極負值、中間值和極正值繪制標準曲線的組合方式共有6種，即CBS/USGS42/USGS43、CBS/USGS42/EMA-P1、CBS/USGS42/KHS、EMA-P2/USGS42/USGS43、EMA-P2/USGS42/EMA-P1和EMA-P2/USGS42/KHS。通過4次重復驗證實驗，對比以上6種組合獲得的標準曲線R2，以獲得擬合度最高的標準曲線。

表1 待選標準品的同位素信息Table 1 Isotopic information of reference materials

注：結(jié)果均采用平均值±1SD‰表示

表2 待測標準品放樣位置Table 2 Sequences of reference materials in autosampler position

1.2.3實驗室間重復驗證 為了考察選定的標準品及真值校正算法的普適性，選擇上海某穩(wěn)定同位素實驗室進行重復實驗。本實驗建立的方法累計重復驗證達35次，時間跨度為4個月。通過考查其R2來確定本方法選定的標準品及真值校正算法的適合性與穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 中國人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值(δ2H)檢測標準品的適合性評估

依據(jù)現(xiàn)有文獻推薦的方法對USGS42、USGS43、CBS、KHS、EMA-P1和EMA-P2進行評估后發(fā)現(xiàn)，各標準品均具備測量需求量小、穩(wěn)定性和長期保質(zhì)性強、易于操作的特點。與頭發(fā)樣本自然成分接近的USGS42、USGS43、CBS和KHS均不是純化學物質(zhì)，而EMA-P1和EMA-P2雖符合純化學物質(zhì)屬性，但與人頭發(fā)自然屬性不同。對比6種標準品的測量精確度，USGS42、USGS43、CBS和KHS在30次以上重復檢測的標準差小于3‰，且精確程度較EMA-P1和EMA-P2高，結(jié)果列于表3。

2.2 中國人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值(δ2H)測量真值校正曲線論證

根據(jù)目前所得中國人頭發(fā)δ2H值的大致范圍為-55‰～-80‰，囊括其范圍的極負值、中間值和極正值的6種組合為：CBS/USGS42/USGS43、CBS/USGS42/EMA-P1、CBS/USGS42 /KHS、EMA-P2/USGS42/USGS43、EMA-P2/USGS42/EMA-P1和EMA-P2/USGS42/KHS。這6種組合的δ2H真值多點線性擬合曲線示于圖1。經(jīng)比對可以發(fā)現(xiàn)，CBS/USGS42/KHS(圖1a)、CBS/USGS42/USGS43(圖1b)和CBS/USGS42/EMA-P1(圖1c)組合的曲線擬合度較高，R2均超過0.99，其中以CBS/USGS42/USGS43(圖1b)組合的曲線擬合度最高，R2為1。對比不同組合的校正曲線系數(shù)，CBS/USGS42/USGS43(圖1b)最接近1，該系數(shù)越接近1代表測量值與真值校正轉(zhuǎn)換越精確。

表3 待選標準品適合性評估Table 3 Evaluating the six reference materials for appropriateness

注：1.同位素測量時稱樣量較小；2.穩(wěn)定性和長期保質(zhì)性；3.易于操作和處理；4.單一的純化合物(更推薦)；5.與待測樣品自然組成相似；6.標準品的標準差[9, 15, 17]；7.標準品的重復檢測次數(shù)[9, 15, 17]；8.是否為極值；“Y”代表“是”；“N”代表“否”

圖1 不同標準品組合的δ2H真值多點線性擬合曲線(第一次實驗)Fig.1 Multiple-point normalization method utilizing linear regression (δTrue=aδMeasured+b), established on six reference materials (the first test)

為進一步驗證其準確性，對6種組合進行4次重復實驗，結(jié)果顯示，大部分組合的標準曲線均呈現(xiàn)不同程度的波動，以EMA-P2/USGS42/USGS43標準曲線的穩(wěn)定性最差，且擬合度最低(R2=0.875 1±0.041 8)。有3種組合(CBS/USGS42/USGS43、CBS/USGS42/KHS和CBS/USGS42/EMA-P1)的標準曲線R2高于0.99，CBS/USGS42/USGS43標準曲線的4次重復所得R2均為1。校正曲線系數(shù)a方面，CBS/USGS42/USGS43組合(1.061 8±0.006 6)、CBS/USGS42/EMA-P1(0.957 0±0.018 9)和EMA-P2/USGS42/EMA-P1(0.922 1±0.029 7)的4次重復相較于其他組合的測量值校正系數(shù)均更接近1，其中CBS/USGS42/USGS43組合的標準差最小、穩(wěn)定性最佳。根據(jù)標準曲線的擬合度和系數(shù)，選取穩(wěn)定性和準確性最佳的組合，即CBS/USGS42/USGS43組合為中國人頭發(fā)δ2H值檢測的最適標準品，詳細結(jié)果列于表4。

表4 不同標準品組合標準曲線(δTrue=aδMeasured+b)的R2值和校正系數(shù)aTable 4 R2 and coefficient a value of multiple-point normalization utilizing linear regression

2.3 中國人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值(δ2H)測量標準品及真值校正曲線的穩(wěn)定性驗證

選擇CBS/USGS42/USGS43標準品組合及其多點線性校正曲線作為人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值檢測和校正的推薦標準，必須保證該標準品組合和校正方法能夠在不同實驗室、不同時間得到高擬合度R2的重復驗證。為了確證這一點，本研究歷時4個月(2018年8月～2018年12月)在本實驗室(北京)進行了33次重復實驗，并在上海某穩(wěn)定同位素實驗室進行了2次重復實驗。在33次重復實驗中，擬合度R2均高于0.9997；上海某實驗室2次重復實驗的標準曲線擬合度R2均為1。因此，CBS/USGS42/USGS43標準品及其多點線性校正曲線可作為人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素測量的推薦標準方法，并可應用于全國人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值數(shù)據(jù)庫的構(gòu)建。

3 結(jié)論

水中氫穩(wěn)定同位素在不同地域呈規(guī)律性分布，其地域性差異可通過生物代謝在人頭發(fā)中得以體現(xiàn)，對于追溯人的生活時空信息具有重要價值。然而，固體氫穩(wěn)定同位素的測量存在測定精確度較差、不同實驗室數(shù)據(jù)比對重現(xiàn)性較低等問題，不利于構(gòu)建可供比對的全國人頭發(fā)穩(wěn)定同位素比值的數(shù)據(jù)庫。為了探索一套可推廣的人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值測量的標準方法，本研究通過對比適合作為頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值的6種標準品特性，根據(jù)實測的中國人頭發(fā)δ2H范圍值，對不同標準品組合的真值校正曲線進行了分析比對，確定了擬合度最高的CBS/USGS42/USGS43標準品組合，并進一步進行了跨實驗室和時間段重復論證，均獲得穩(wěn)定結(jié)論。該方法可作為全國人頭發(fā)氫穩(wěn)定同位素比值數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)準入的推薦方法，甄選標準品和真值校正曲線的思路亦可為其他穩(wěn)定同位素標準庫的建立提供參考。

致謝：感謝賽默飛世爾科技(中國)有限公司上海研發(fā)中心穩(wěn)定同位素實驗室馬瀟工程師在儀器調(diào)試方面給予的技術(shù)支持，以及對本次驗證實驗研究中給予的幫助。