他克莫司濃度在移植患者全血、血漿與血細(xì)胞中的相關(guān)性研究Δ

秦偉，王曉雪，張相林，陳文倩，杜雯雯，張丹，王曉星，劉慧芳，李沭，李朋梅

（中日友好醫(yī)院藥學(xué)部治療藥物監(jiān)測(cè)室，北京 100029）

他克莫司是移植術(shù)后預(yù)防排斥反應(yīng)的重要藥物，但其代謝個(gè)體差異性大、藥物相互作用較復(fù)雜，且治療窗較窄，用藥時(shí)需對(duì)其血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)。他克莫司在血液中的分布比較復(fù)雜，吸收入血后約85%～95%進(jìn)入紅細(xì)胞，僅0.5%進(jìn)入淋巴細(xì)胞發(fā)揮藥理作用[1]。血漿中他克莫司含量較低，游離的僅占0.3%～2%，其中約60%與白蛋白、α-酸性糖蛋白（AGP）結(jié)合，另外分別有約30%、8%、1%與高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）和極低密度脂蛋白（VLDL）結(jié)合[2]。紅細(xì)胞中的他克莫司能夠進(jìn)入血漿，同時(shí)血漿中的游離他克莫司也能夠進(jìn)入紅細(xì)胞，2 min內(nèi)即可達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，他克莫司進(jìn)、出紅細(xì)胞的速率分別為0.276、1.70 mL/min[3]。

由于他克莫司在血液中的分布較復(fù)雜，目前臨床上主要選擇監(jiān)測(cè)全血中他克莫司的谷濃度來(lái)預(yù)測(cè)其藥效或毒性濃度[4]。在血細(xì)胞、血漿蛋白等指標(biāo)正常的情況下，他克莫司全血谷濃度能夠反映其真實(shí)藥效或不良反應(yīng)相關(guān)濃度。然而，在移植狀態(tài)下，患者可能會(huì)發(fā)生貧血[5]、低白蛋白血癥[6]以及術(shù)后繼發(fā)感染等，此時(shí)會(huì)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素等藥物[7-8]以及使用體外膜肺氧合（Extracorporeal membrane oxygenation，ECMO）技術(shù)[9-10]進(jìn)行治療。這些因素均會(huì)影響他克莫司在血液中的分布，可能會(huì)導(dǎo)致他克莫司全血谷濃度無(wú)法真實(shí)反映其藥效或不良反應(yīng)相關(guān)濃度?；诖?，本研究隨機(jī)選取20例本院腎移植或肺移植術(shù)后使用他克莫司抗排異治療的患者，采用化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法檢測(cè)其全血中他克莫司谷濃度，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）檢測(cè)其血漿及血細(xì)胞中他克莫司濃度，應(yīng)用散點(diǎn)圖矩陣、Spearman秩相關(guān)性分析全血與血漿、全血與血細(xì)胞、血漿與血細(xì)胞中他克莫司濃度的相關(guān)性，并分析移植類(lèi)型及年齡對(duì)3者間相關(guān)性的影響，為臨床合理用藥提供參考。

1 資料與方法

1.1 資料來(lái)源

隨機(jī)選擇20例我院肺移植、腎移植術(shù)后使用他克莫司抗排異治療并已進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測(cè)的患者，收集谷濃度監(jiān)測(cè)后的殘血（用藥前0.5 h），同時(shí)收集患者基本信息。在20例患者中，腎移植、肺移植患者各10例。年齡分布分別為20～40歲者4例，41～60歲者9例，61～80歲者7例，分別占20%、45%、35%。男性、女性患者分別有19、1例，分別占95%、5%。

1.2 患者分組

（1）根據(jù)移植類(lèi)型：將20例患者分為腎移植組和肺移植組，各10例。肺移植組患者以60～80歲為主（占70%），20～40歲、41～60歲患者僅占30%。腎移植組患者較肺移植組年輕，20～40歲、41～60歲患者分別占30%、70%，無(wú)61～80歲患者。按移植類(lèi)型分類(lèi)的患者基本信息比較見(jiàn)表1。

表1 按移植類(lèi)型分類(lèi)的患者基本信息比較Tab 1 Comparison of general information of patients in different transplant types

（2）根據(jù)年齡分組：根據(jù)年齡將20例患者分為20～40歲組、41～60歲組和61～80歲組。20～40歲、41～60歲年齡段主要為腎移植患者（占比分別為75%、77.8%），61～80歲年齡段全部為肺移植患者（100%）。按年齡分類(lèi)患者的基本信息比較情況見(jiàn)表2。

表2 按年齡分類(lèi)的患者基本信息比較Tab 2 Comparison of general information of patients in different age

1.3 儀器與試劑

Quattro Premier XE串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀、Acquity Ultra Performance LC高效液相色譜儀（沃特世科技上海有限公司）；ZLS-2真空離心濃縮儀（湖南赫西儀器裝備有限公司）；七水合硫酸鋅（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：F20080326，純度：≥99.5%）；乙酸銨（批號(hào)：160267A）、乙腈（批號(hào)：177798）、甲酸（批號(hào)：172433）、甲醇（批號(hào)：175162）均購(gòu)自美國(guó)Fisher Chemical公司；他克莫司-13CD2（內(nèi)標(biāo)，加拿大Toronto Research Chemicals公司，批號(hào)：F370002，純度：94.49%）；普樂(lè)可復(fù)測(cè)定試劑盒（化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析法）（批號(hào)：85002M800）、ARCHITECT i1000SR全自動(dòng)免疫分析儀均購(gòu)自雅培貿(mào)易（上海）有限公司。

1.4 色譜與質(zhì)譜條件

色譜條件：色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為2 mmol/L乙酸銨-水（含0.01%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含0.01%甲酸），梯度洗脫（0～3 min，55%A；3～5 min，55%→0A；5～8 min，0A；8～8.1 min，0→55%A；8.1～10 min，55%A）；流速為0.2 mL/min；柱溫為55℃；樣品室溫度為10℃；進(jìn)樣量為10 μL；分析時(shí)間為10 min。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（ESI），正離子檢測(cè)模式，毛細(xì)管電壓為3.5 kV，錐孔電壓為25 V，離子源溫度為110℃，脫溶劑溫度為350℃，脫溶劑氣流速為800 L/h，碰撞能為15 eV。多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式定量，他克莫司質(zhì)荷比（m/z）821.7→768.4，內(nèi)標(biāo)他克莫司-13Cd2m/z824.7→771.4。

1.5 樣品前處理及進(jìn)樣分析

取1 mL患者全血樣本于1.5 mL離心管中，在4℃下以12 000 r/min離心1 min（排除紅細(xì)胞破裂樣本），采用200 μL量程移液器緩慢吸取上層血漿，在接近細(xì)胞與血漿交界面時(shí)采用20 μL量程移液器緩慢吸取。在吸取血漿過(guò)程中嚴(yán)格避免吸入下層細(xì)胞，保證血漿中沒(méi)有血細(xì)胞被吸入。分別準(zhǔn)確移取全血、血漿和血細(xì)胞樣本80 μL于1.5 mL 離心管中，加入20 μL他克莫司-13CD2內(nèi)標(biāo)溶液（40 ng/mL），適當(dāng)混勻。加入七水合硫酸鋅溶液（0.4 mol/L）200 μL、乙腈800 μL，渦旋振蕩3 min，在4 ℃下以12 000 r/min離心5 min。將上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，采用離心濃縮儀在55℃下濃縮1 h，至溶劑全部蒸發(fā)。加入初始流動(dòng)相（VA∶VB＝55∶45）80 μL復(fù)溶，渦旋振蕩3 min，在4℃下以12 000 r/min離心5 min，取上清液按“1.4”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

通過(guò)SPSS 22.0軟件繪制箱圖、散點(diǎn)圖矩陣，采用Shapiro-Wilk檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)是否服從正態(tài)分布，然后采用Spearman秩相關(guān)分析方法分析全血與血漿、全血與血細(xì)胞、血漿與血細(xì)胞中他克莫司濃度的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度總體分布情況

全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司的平均濃度分別為（7.91±2.75）、（15.12±6.23）、（0.19±0.13）μg/mL，變異系數(shù)（CV）分別為34.8%、41.2%、68.2%，血漿中他克莫司濃度的變異性最大。Shapiro-Wilk檢驗(yàn)結(jié)果顯示，全血、血細(xì)胞中他克莫司濃度服從正態(tài)分布（P＞0.05），血漿中他克莫司濃度不服從正態(tài)分布（P＜0.05）。全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度箱圖詳見(jiàn)圖1。

圖1 全血、血細(xì)胞和血漿中他克莫司濃度箱圖Fig 1 Box plots of concentrations of tacrolimus in whole blood，blood cells and plasma

2.2 全血、血漿與血細(xì)胞中他克莫司濃度的總體相關(guān)性分析

全血、血細(xì)胞和血漿中他克莫司濃度的散點(diǎn)圖矩陣見(jiàn)圖2。

圖2 全血、血細(xì)胞和血漿中他克莫司濃度的散點(diǎn)圖矩陣Fig 2 Scatter plots matrix of tacrolimus concentrations in whole blood，blood cells and plasma

散點(diǎn)圖矩陣結(jié)果顯示，全血與血細(xì)胞中他克莫司濃度的相關(guān)性較全血與血漿、血漿與血細(xì)胞中他克莫司濃度的相關(guān)性稍強(qiáng)。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果與散點(diǎn)圖略有差異，全血與血漿中他克莫司濃度相關(guān)性（r＝0.623，P＜0.01）略強(qiáng)于全血與血細(xì)胞中他克莫司濃度的相關(guān)性（r＝0.591，P＜0.01），而血漿與血細(xì)胞中他克莫司濃度相關(guān)性相對(duì)較弱（r＝0.497，P＜0.05）。

2.3 移植類(lèi)型對(duì)全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度相關(guān)性的影響

不同移植類(lèi)型患者全血、血細(xì)胞和血漿中他克莫司濃度的散點(diǎn)圖矩陣見(jiàn)圖3。

圖3 不同移植類(lèi)型患者全血、血細(xì)胞和血漿中他克莫司濃度的散點(diǎn)圖矩陣Fig 3 Scatter plot matrix of tacrolimus concentrations in while blood，blood cells and plasma of patients with different transplantation types

散點(diǎn)圖矩陣結(jié)果顯示，肺移植組患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度相關(guān)性均強(qiáng)于腎移植組患者。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果與散點(diǎn)圖一致，腎移植組患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度相關(guān)性較弱（r均＜0.5），基本認(rèn)定為無(wú)相關(guān)性；肺移植組患者全血與血漿中他克莫司濃度相關(guān)性（r＝0.840，P＜0.01）、血漿與血細(xì)胞中他克莫司濃度相關(guān)性（r＝0.842，P＜0.01）略強(qiáng)于全血與血細(xì)胞他克莫司濃度相關(guān)性（r＝0.742，P＜0.01）。

2.4 年齡對(duì)全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度相關(guān)性的影響

不同年齡段患者全血、血細(xì)胞和血漿中他克莫司濃度的散點(diǎn)圖矩陣見(jiàn)圖4。

散點(diǎn)圖矩陣結(jié)果顯示，20～40歲組年輕患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度的相關(guān)性較弱，41～60歲組、61～80歲組患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度的相關(guān)性稍強(qiáng)。Spearman秩相關(guān)分析結(jié)果與散點(diǎn)圖結(jié)果一致，20～40歲組患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度相關(guān)性均較弱（r均＜0.3），可以認(rèn)定為無(wú)相關(guān)性；41～60歲組患者全血與血細(xì)胞（r＝0.783，P＜0.05）、全血與血漿中他克莫司濃度相關(guān)性較強(qiáng)（r＝0.814，P＜0.01），血細(xì)胞與血漿中他克莫司濃度相關(guān)性較弱（r＝0.589，P＞0.05）；61～80歲患者血細(xì)胞與血漿中他克莫司濃度相關(guān)性較強(qiáng)（r＝0.905，P＜0.01）。

圖4 不同年齡段患者全血、血細(xì)胞和血漿中他克莫司濃度的散點(diǎn)圖矩陣Fig 4 Scatter plot matrix of tacrolimus concentrations in while blood，blood cells and plasma of patients with different ages

3 討論

他克莫司是鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶抑制劑，可抑制T細(xì)胞的活化及T輔助細(xì)胞依賴(lài)性B細(xì)胞的增殖，亦可抑制白細(xì)胞介素2（IL-2）、IL-3、γ-干擾素（IFN-γ）等淋巴因子的生成與IL-2受體的表達(dá)。在分子水平上，他克莫司可與細(xì)胞內(nèi)他克莫司結(jié)合蛋白12（FKBP-12）結(jié)合后特異性和競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合并抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性，引起T細(xì)胞內(nèi)鈣依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制，從而阻止一系列淋巴因子的基因轉(zhuǎn)錄[11-13]。因此，淋巴細(xì)胞內(nèi)他克莫司的濃度才能夠真實(shí)反映其藥效濃度。由于外周血淋巴細(xì)胞分離過(guò)程較復(fù)雜，本研究假設(shè)患者移植術(shù)后淋巴細(xì)胞在全血細(xì)胞中的比例未發(fā)生變化，將血細(xì)胞中他克莫司濃度近似為藥效濃度，但并未分析淋巴細(xì)胞比例的變化可能對(duì)他克莫司藥效濃度的影響，關(guān)于這方面的內(nèi)容筆者將在后續(xù)研究中進(jìn)一步考察。

他克莫司在臨床使用過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)毒性、腎毒性、糖尿病傾向、胃腸道紊亂等不良反應(yīng)[14]，在心臟移植和肺移植術(shù)后的前幾天，他克莫司可能誘發(fā)腎小球入球和出球小動(dòng)脈收縮，進(jìn)而導(dǎo)致腎損傷。術(shù)后早期出現(xiàn)的腎損傷會(huì)造成術(shù)后1年慢性腎衰的發(fā)生率增加50%，術(shù)后5年慢性腎衰的發(fā)生率增加70%[15-16]。因此，需要監(jiān)測(cè)他克莫司的血藥濃度以降低腎損傷的發(fā)生率。然而，全血中他克莫司濃度與腎損傷的發(fā)生并無(wú)確切的相關(guān)性，全血濃度在治療窗范圍內(nèi)仍會(huì)發(fā)生毒性反應(yīng)，筆者推測(cè)，血漿中他克莫司濃度可能與腎損傷的發(fā)生具有更確切的相關(guān)性。

UPLC-MS/MS技術(shù)已在體內(nèi)藥物分析領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，其靈敏度高，能夠檢測(cè)出含量較低的藥物。UPLCMS/MS檢測(cè)血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度方法也已成熟，血漿中游離他克莫司濃度檢測(cè)的定量限能夠達(dá)到1 pg/mL[17-18]，單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）、T CD4+細(xì)胞、B CD19+細(xì)胞中他克莫司濃度檢測(cè)的定量限分別能夠達(dá)到0.115、0.109、0.150 ng/mL[19]。因此，本研究利用 UPLCMS/MS技術(shù)檢測(cè)他克莫司在血細(xì)胞及血漿中的濃度能夠滿(mǎn)足檢測(cè)需求。筆者前期也對(duì)比了采用UPLC-MS/MS與化學(xué)發(fā)光微粒子免疫分析兩種方法檢測(cè)他克莫司濃度，發(fā)現(xiàn)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果呈線性相關(guān)且相關(guān)性較強(qiáng)（r＝0.943，P＜0.01），可進(jìn)行結(jié)果間的相互轉(zhuǎn)換。

目前，臨床上用于分離血漿和血細(xì)胞的常規(guī)方法是3 000 r/min離心5 min，移液器或吸管吸取上層血漿，下層剩余部分為血細(xì)胞。但該方法由于離心轉(zhuǎn)速低，細(xì)胞堆積不緊密，在吸取上層血漿時(shí)，血漿層與血細(xì)胞交界面不穩(wěn)定，下層細(xì)胞容易被吸入。本研究增加離心轉(zhuǎn)速、降低離心溫度，采取在4℃下以12 000 r/min離心1 min的方法，離心后血細(xì)胞堆積較之前穩(wěn)定，并且沒(méi)有觀察到紅細(xì)胞破裂（即血漿顏色未變紅）。由于交界面仍有不穩(wěn)定，所以吸取完血漿后，血細(xì)胞上層還會(huì)殘留少量血漿，并非完全的分離，但由于血漿中的他克莫司含量較低，所以忽略了這部分殘留對(duì)其濃度測(cè)定結(jié)果的影響。

本研究結(jié)果顯示，肺移植患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司的濃度相關(guān)性明顯強(qiáng)于腎移植患者。由于按照移植類(lèi)型分類(lèi)患者的年齡分布并不均勻，肺移植主要為61～80歲患者，腎移植主要為41～60歲患者，無(wú)法排除年齡對(duì)相關(guān)性的影響。筆者單獨(dú)分析了41～60歲腎移植患者相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)全血與血細(xì)胞中他克莫司的濃度相關(guān)性（r＝0.536）、全血與血漿他克莫司的濃度相關(guān)性（r＝0.617）、血漿與血細(xì)胞他克莫司的濃度相關(guān)性（r＝0.193）均比41～60歲患者三者間的相關(guān)性弱，這提示肺移植患者的數(shù)據(jù)可能提高了41～60歲患者三者間他克莫司濃度的相關(guān)性，表明肺移植患者全血、血漿與血細(xì)胞中他克莫司濃度的相關(guān)性強(qiáng)于腎移植患者。

按照年齡分組，20～40歲組、41～60歲組均以腎移植患者為主，但41～60歲組患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司濃度的相關(guān)性明顯強(qiáng)于20～40歲組，這表明年齡是影響他克莫司濃度相關(guān)性的重要因素，20～40歲的年輕移植患者的全血中他克莫司濃度可能更難真實(shí)地反映他克莫司的藥效和毒性反應(yīng)。因此，在20～40歲他克莫司使用患者的臨床診療過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)對(duì)排異反應(yīng)或者腎毒性的監(jiān)測(cè)。61～80歲患者的他克莫司濃度相關(guān)性結(jié)果比較特殊，全血與血細(xì)胞、全血與血漿中他克莫司濃度的相關(guān)性不強(qiáng)（r＜0.7）；而血細(xì)胞與血漿中他克莫司濃度的相關(guān)性較強(qiáng)（r＝0.905），并且具有極顯著性差異，導(dǎo)致這一現(xiàn)象的原因還不明確，有待進(jìn)一步研究尋找原因。

本研究采用基于真實(shí)世界的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，避免研究者主觀因素對(duì)研究結(jié)果的影響。由于性別差異較大，僅1例女性，無(wú)法判斷性別對(duì)他克莫司濃度相關(guān)性的影響。因此，還需要擴(kuò)大研究的樣本量和樣本類(lèi)型，在大量試驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上進(jìn)行分析，更準(zhǔn)確地描述他克莫司濃度在全血、血細(xì)胞和血漿三者間的相關(guān)性及各因素對(duì)其相關(guān)性的影響。

綜上所述，他克莫司在移植患者全血、血漿、血細(xì)胞中濃度的相關(guān)性不強(qiáng)，年齡、移植類(lèi)型是影響其相關(guān)性的重要因素，20～40歲患者和腎移植患者全血、血細(xì)胞、血漿中他克莫司的相關(guān)性較弱，應(yīng)加強(qiáng)重視。由于本研究的樣本量較少，可能無(wú)法完全概括患者的整體情況，后續(xù)將擴(kuò)大樣本量，進(jìn)一步研究其他因素對(duì)相關(guān)性的影響以及血漿、血細(xì)胞中他克莫司的濃度與其藥效和毒性的相關(guān)性，為患者提供更加精準(zhǔn)的個(gè)體化治療方案。