葉酸修飾磁性氧化石墨烯載體的制備、表征及其磁性研究Δ

趙鵬慧，王彥，劉雪穎，王永利，劉家園，王立華#

（1.河北北方學院應用化學研究所，河北張家口075000；2.陸軍第八十一集團軍醫(yī)院藥劑科，河北張家口 075000）

自二維炭材料被發(fā)現(xiàn)以來，備受各領域研究人員的關注[1]，如碳納米管、富勒烯、石墨烯及其衍生物等，其中石墨烯的一種衍生物——氧化石墨烯（GO）作為新型材料，具有廉價、易得、性能優(yōu)良的優(yōu)點[2]。GO有大的表面積，且含有—COOH、—OH、—O—等含氧官能團[3]，具有良好的親水性和生物相容性，可通過π-π共軛和靜電作用與藥物分子結(jié)合[4-5]，因具有被動靶向性[6]，而使其成為理想的藥物載體。研究者們利用GO上的官能團與其他小分子進行各種化學反應，對GO進行各種功能化修飾，以改善GO的分散性、生物相容性，降低其細胞毒性，增強其作為藥物載體對病灶部位的靶向性等。

近年來，對于功能化GO載體的研究取得了很大的進展，如沈俊海等[7]采用原位化學共沉淀法制備磁性氧化石墨烯（GO-Fe3O4）復合材料，并研究了其對鹽酸多柔比星的負載和釋放性能，在新型藥物載體領域有可觀的利用率；Kooti M等[8]研究發(fā)現(xiàn)，GO-Fe3O4在磁性環(huán)境下可以把負載的藥物運輸?shù)教囟ú∽儾课?，提示GO-Fe3O4具有磁靶向性，在藥物傳送中具有潛在價值。由于單獨的磁性粒子容易聚沉[9]，所以磁化后的GO-Fe3O4分散液易產(chǎn)生聚沉現(xiàn)象，分散性差，從而使復合載體的穩(wěn)定性降低。據(jù)報道，葉酸（FA）受體是一種糖蛋白，在許多腫瘤細胞表面高度表達，而在正常細胞表面低表達[10]，具有一定的生物靶向性，如張蛟龍等[11]制備FA修飾的GO載體（FA-GO），裝載鹽酸多柔比星后，F(xiàn)A-GO對鹽酸多柔比星的載藥效率高，且具有一定的緩釋性能及細胞靶向性。

為了改善GO-Fe3O4的穩(wěn)定性，增加靶向性，本研究以GO、六水合氯化鐵（FeCl3·6H2O）、四水合氯化亞鐵（FeCl2·4H2O）以及FA為主要原料，采用水熱共沉淀法制備了FA修飾磁性氧化石墨烯（FA-GO-Fe3O4）復合材料，利用復合材料中Fe3O4納米粒子的磁靶向性和FA的生物靶向性，為抗腫瘤藥物“雙重”靶向載體研究與開發(fā)提供新方法和新思路。

1 材料

1.1 儀器

S4800-Ⅱ型場發(fā)射掃描電鏡（日本日立公司）；FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀（天津港東科技發(fā)展股份有限公司）；XRD-7000型X射線衍射儀（日本島津公司）；Zetasizer Nano ZS90NEW型粒度及Zeta電位分析儀（英國Malvern公司）；PPMS DynaCool型磁滯回線儀（美國Quantum Design公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Exceed-Cd-16型艾柯超純水機（成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司）；pHS-3C型pH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；T-214型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；DF-101S型集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；DZF-6020型真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；FD-1-50型真空冷凍干燥機（北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司）；2XZ（C）型直聯(lián)旋片式真空泵（臨海市譚氏真空設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

GO原料藥（湖北豐化材料發(fā)展有限責任公司，批號：20121218，純度：99.0%）；FeCl3·6H2O（天津市福晨化學試劑廠，分析純）；FeCl2·4H2O（天津市巴斯夫化工有限公司，分析純）；FA原料藥（上海麥克林生化科技有限公司，批號：C10058442，純度：97%）；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，上海思域化工科技有限公司，批號：A1512061，純度：99%）；1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20170927，純度：95%）；HCl、NH3·H2O、CH2ClCOOH、NaOH等均為市售分析純。

2 方法

2.1 GO-Fe3O4的制備

取GO 100.0 mg，加適量蒸餾水，常溫下以頻率40 kHz、功率500 W超聲分散30 min，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的GO分散液，用HCl調(diào)節(jié)體系pH至3.00；加入0.300 0 g FeCl3·6H2O和0.300 0 g FeCl2·4H2O，常溫下以頻率40 kHz、功率500 W超聲至溶解，置于密閉容器中，氮氣保護，30℃密閉熟化4 h；再用NH3·H2O調(diào)節(jié)pH至11.00，氮氣保護，80℃密閉熟化4 h，利用磁性分離產(chǎn)物，并用蒸餾水洗滌至洗液pH至7.00，得到黑色固體，60℃干燥至恒質(zhì)量，即得GO-Fe3O4，約140.0 mg。

2.2 FA-GO-Fe3O4的制備

取“2.1”項下制備的GO-Fe3O4100.0 mg，加蒸餾水配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的GO-Fe3O4分散液，常溫下以頻率40 kHz、功率500 W超聲溶解2 h，加入5.000 0 g CH2ClCOOH，溶解后加入5.000 0 g NaOH，常溫下以頻率40 kHz、功率500 W超聲3 h，用6 mol/L鹽酸調(diào)pH至中性，轉(zhuǎn)入透析袋中，30℃恒溫透析48 h，透析液為水，24 h換一次，冷凍干燥48 h，即得到羧基化GO-Fe3O4材料，約80.0 mg。精密稱取羧基化GO-Fe3O4材料50.0 mg，加蒸餾水，常溫超聲分散1 h，配制成質(zhì)量濃度為1.00 mg/mL的羧基化GO-Fe3O4分散液，加入45.50 mg NHS、31.25 mg EDC，常溫下以頻率40 kHz、功率500 W超聲2 h，然后邊攪拌邊加入25.0 mg FA，30℃攪拌3 h，轉(zhuǎn)入透析袋中，30℃恒溫透析48 h，24 h換一次，冷凍干燥，即得FA-GO-Fe3O4，約50.0 mg。

2.3 FA-GO-Fe3O4的表征

2.3.1 外觀和微觀結(jié)構 采用S4800-Ⅱ型場發(fā)射掃描電鏡觀察GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的外觀和微觀結(jié)構。

2.3.2 紅外結(jié)構特征 采用FTIR-650型傅里葉變換紅外光譜儀分析FA、GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的紅外結(jié)構特征，先用115℃干燥3 h的溴化鉀與60℃干燥6 h的樣品均勻混合后，壓片，在分辨率為4 cm－1，掃描范圍為400～4 000 cm－1的條件下進行測試。

2.3.3 X射線衍射分析 采用XRD-7000型X射線衍射儀分析GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的晶型結(jié)構特征，管電壓為40 kV，管電流為30 mA，2θ為5 °～80 °。

2.3.4 Zeta電位 采用Zetasizer NanoZS90NEW型粒度及Zeta電位分析儀測定GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的Zeta電位，分散劑為蒸餾水，散射角為90°，溫度為25℃，測試3遍，取平均值。

2.4 性能測試

2.4.1 外加磁場的作用 取質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的FA-GO-Fe3O4水分散液2 mL，置于樣品瓶中，在瓶外放置一塊磁鐵，觀察制備的FA-GO-Fe3O4在外加磁場作用下的分布變化。

2.4.2 磁滯回線 采用PPMS DynaCool型磁滯回線儀，在室溫（300 K，即27℃）下測量FA-GO-Fe3O4的磁滯回線，掃描范圍為－20 000～20 000 Oe。

3 結(jié)果

3.1 表征

3.1.1 掃描電鏡圖 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的掃描電鏡圖見圖1。

由圖1顯示，GO呈薄層鱗片狀，表面較光滑。由于GO-Fe3O4是按照共沉淀法制備的，在GO連接Fe3O4的過程中Fe3O4吸附于GO表面或內(nèi)部，破壞了GO的片層結(jié)構，因此GO-Fe3O4掃描電鏡圖顯示其表面有突起出現(xiàn)。當GO-Fe3O4與FA復合后，雖然同樣破壞了GO的片層結(jié)構，但由FA-GO-Fe3O4掃描電鏡圖顯示其破壞似乎并不完全，部分片層呈彎曲狀，且表面有粒子團附著，呈現(xiàn)出與GO和GO-Fe3O4皆不同的結(jié)構。初步表明FA-GOFe3O4復合材料制備成功。

3.1.2 紅外光譜圖分析 GO、FA、Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的紅外光譜圖見圖2。

圖1 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的掃描電鏡圖Fig 1SEM image of GO，GO-Fe3O4and FA-GO-Fe3O4

圖2 GO、FA、Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的紅外光譜圖Fig 2 IR images of GO，F(xiàn)A，F(xiàn)e3O4and FA-GO-Fe3O4

由圖2顯示，F(xiàn)A-GO-Fe3O4在3 400～3 500 cm－1附近有一個明顯的吸收峰，屬于—OH伸縮振動峰，由于此處峰形較大，除—OH的伸縮振動峰外，還可能是因為干燥過的樣品在測定時吸收了空氣中的少量水分形成的；與GO的紅外光譜圖對比，F(xiàn)A-GO-Fe3O4紅外光譜圖中增加了574 cm－1吸收峰，結(jié)合Fe3O4的紅外吸收峰，該峰可能是Fe-O鍵的吸收峰[12]；且FA-GO-Fe3O4在1 640 cm－1處有吸收峰，屬于—CONH—特征吸收峰，該峰可能是由羧基化GO-Fe3O4的—COOH與FA的游離—NH2發(fā)生酰胺反應形成的；由于FA分子內(nèi)部有酰胺鍵的存在，所以在1 642 cm－1處能觀察到很弱的吸收峰，由于FA與GO-Fe3O4的連接形成了更多的酰胺鍵，透過率更小，吸收強度更大，峰尖也就越接近橫軸，對比FA，F(xiàn)A-GOFe3O4中的該吸收峰更強；在FA-GO-Fe3O4紅外光譜圖中，3 412 cm－1和3 320 cm－1處沒有吸收峰，表明游離胺基反應完全；在1 600～1 700 cm－1附近，F(xiàn)A-GO-Fe3O4的吸收峰多且雜，對應的可能是GO中—COOH的C＝O以及CO—H的伸縮振動峰[13]；GO紅外光譜圖中的1 723 cm－1吸收峰[14]出現(xiàn)在了FA-GO-Fe3O4紅外光譜圖中的1 694 cm－1處，表明GO中的—COOH發(fā)生了反應，從而產(chǎn)生了位移。

3.1.3 X射線衍射分析 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的X射線衍射圖見圖3。

圖3 GO、GO-Fe3O4和FA-GO-Fe3O4的X射線衍射圖Fig 3XRD images of GO，GO-Fe3O4and FA-GO-Fe3O4

由圖3顯示，GO在11.87°處的衍射峰的衍射強度最大，表明GO具有很好的晶體結(jié)構[15]；GO-Fe3O4有6個特征峰，分別在31.5 °、36.47 °、44.09 °、53.4 °、58.62 °、63.75°處，與Fe3O4標準衍射峰[16]位置近乎一致；與GO衍射圖對比，F(xiàn)A-GO-Fe3O4的11.87°處沒有特征峰，表明FA-GO-Fe3O4在形成過程中破壞了GO的晶體結(jié)構[17]，與圖1觀察的結(jié)果和文獻報道[17]一致；FA-GO-Fe3O4衍射圖中顯示在15°～30°之間出現(xiàn)了一個大的隆起，即非晶相峰，該峰的形成可能是由于GO-Fe3O4表面包覆了非晶相的FA引起的。

3.1.4 Zeta電位 結(jié)果顯示，GO、GO-Fe3O4和FA-GOFe3O4的Zeta電位分別為－24、5.62和－22.7 mV。有研究表明，隨著Zeta電位絕對值的增大，體系的穩(wěn)定性也會增強[18]。由此可以得出，F(xiàn)A-GO-Fe3O4的Zeta電位絕對值明顯大于GO-Fe3O4，表明FA通過酰胺鍵與GO-Fe3O4連接后，增加了該體系的穩(wěn)定性。

3.2 性能

3.2.1 外加磁場的作用 外加磁場作用下的FA-GOFe3O4分散液圖見圖4。

圖4 外加磁場作用下的FA-GO-Fe3O4分散液外觀Fig 4 Appearence of water dispersions of FA-GOFe3O4under magnetic field

由圖4可知，在無外加磁場作用下，F(xiàn)A-GO-Fe3O4在水中均勻分散，呈深棕色；在外加磁場作用下，均勻分散在水中的FA-GO-Fe3O4向外加磁場方向移動，聚集在瓶底，呈黑色粉末狀，分散液接近無色透明，說明FA-GOFe3O4具有良好的磁靶向性。

3.2.2 磁滯回線 FA-GO-Fe3O4在室溫條件下的磁滯回線見圖5。

圖5 FA-GO-Fe3O4在室溫條件下的磁滯回線Fig 5 Hysteresis loop of FA-GO-Fe3O4at room temperature

由圖5顯示，在室溫、外加正反磁場條件下，F(xiàn)A-GOFe3O4材料的磁滯回線呈S型回線，飽和磁化強度約為20～25 emu/g；在沒有外在磁場的情況下，該磁滯回線經(jīng)過原點，所以，矯頑力（Hcm）＝剩余磁化強度（M）＝0，且無磁滯現(xiàn)象產(chǎn)生，表明在室溫下，F(xiàn)A-GO-Fe3O4具有良好的超順磁性[19]。

4 討論

近年來，惡性腫瘤極大地危害著人類健康，已成為全球較大的公共衛(wèi)生問題之一[20]，因此抗腫瘤制劑的研究刻不容緩。為了解決傳統(tǒng)腫瘤治療藥物缺乏選擇性的問題，藥物靶向載體已經(jīng)成為醫(yī)藥學領域的研究熱點，如介孔分子篩[21]、功能化GO以及納米膠束等。由于功能化GO具有優(yōu)異的載藥性能，學者們相繼對其進行了各種研究。其中Fe3O4納米粒顆粒小、磁性強、毒性低，具有良好的生物相容性，易穿過生理屏障，這些優(yōu)點解決了抗癌藥物對癌細胞的非特異性攻擊的問題[22-23]。經(jīng)Fe3O4納米粒修飾后的GO在這些方面均得到了改善，如高君[22]制備了功能化GO磁靶向載藥體系，并考察了該載體的體外磁靶向性，證明該體系具有較好的磁靶向性及其優(yōu)良的載藥性能等。

本研究先后用Fe3O4和FA修飾GO，制備FA-GOFe3O4復合載體。通過掃描電鏡、紅外光譜以及X射線衍射測定結(jié)果表明，F(xiàn)e3O4和FA已經(jīng)復合在GO表面，成功制備了FA-GO-Fe3O4復合材料。該復合材料的飽和磁化強度約為20～25 emu/g，具有較好的超順磁性，同時具有較好的穩(wěn)定性，即Zeta電位為－22.7 mV。相較于GO-Fe3O4復合材料，F(xiàn)A-GO-Fe3O4的穩(wěn)定性好，且具有“雙重”靶向性（生物靶向性另文發(fā)表），可以運用于不同情況的臨床患者，如在被動性物理磁靶向性失效或比較弱的情況下，可以利用FA介導的主動性生物靶向性，直接靶向到腫瘤部位起效，增強療效。隨著科學技術的發(fā)展，光動力療法治療癌癥已經(jīng)成為一個新的研究熱點，因GO可吸收紅外光，使其成為了光動力療法的新載體[24-25]，本研究制備的藥物靶向載體也有望應用于該領域，可為癌癥的靶向性治療提供新型納米載體。