李斯文腹水方對(duì)H22肝癌小鼠腫瘤干預(yù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

李東鴿

云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650021

癌性腹水，又稱惡性腹腔積液，是指惡性腫瘤累及腹膜引起的腹水，占腹水的30%左右。癌性腹水多見于消化系統(tǒng)腫瘤，以肝癌和胃癌最為常見，其中肝癌約占82%，胃癌約占16%，女性多見于卵巢癌，據(jù)統(tǒng)計(jì)，三分之一以上的卵巢癌同時(shí)合并腹水，其它如惡性淋巴瘤、間皮瘤、子宮癌、乳腺癌也可引起癌性腹水[1]。癌性腹水發(fā)病機(jī)制是多方面的，不同腫瘤引起腹水的機(jī)制也不盡相同。腹水的出現(xiàn)嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量，患者出現(xiàn)腹脹、腹痛、食欲下降、甚則無法進(jìn)食，憋氣，呼吸困難等。癌性腹水病情較之良性腹水，其量較大，生長快，病情反復(fù)，目前沒有特效的治療方法和藥物，預(yù)后較差?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)于癌性腹水的治療緩解率雖然較高，但穩(wěn)定性較差，且其使用的藥物多為細(xì)胞毒藥物或生物制劑，毒副作用較大，患者常常難以承受。而癌性腹水患者一般體質(zhì)虛弱，腹腔穿刺引流腹水雖可一時(shí)緩解癥狀，但腹水常在短期內(nèi)迅速積聚生成。患者常出現(xiàn)腹水明顯，排尿困難，少尿或無尿，反復(fù)使用利尿劑，常產(chǎn)生抗藥性，使常規(guī)利尿難以奏效，而且容易引起電解質(zhì)紊亂。中醫(yī)藥在腫瘤的治療方面，尤其是在中晚期腫瘤的姑息治療方面，具有較好的療效，在提高患者生活質(zhì)量，延長生存期方面發(fā)揮了獨(dú)特的作用。

腹水方是李斯文教授多年臨床防治腫瘤的實(shí)踐中，依據(jù)中醫(yī)整體觀念及辨證論治的特點(diǎn)和臨床用藥經(jīng)驗(yàn)研制出的治療肝癌的中藥復(fù)方，以扶正抑癌為原則。在臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)，腹水方能夠改善肝癌腹水患者的臨床癥狀并提高生活質(zhì)量。能較好地延緩了癌變及轉(zhuǎn)移的進(jìn)程，提高機(jī)體的免疫功能，配合放化療，減輕放、化療的毒副反應(yīng)，從而提高了機(jī)體的耐受性。祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腫瘤系人體正氣虧虛，邪氣客聚體內(nèi)所致。腫瘤在機(jī)體內(nèi)的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移以及預(yù)后，既與人體正氣的強(qiáng)弱有關(guān)，又與客邪之輕重及其毒性強(qiáng)弱有關(guān)。所以腫瘤的治療及預(yù)后，取決于人體內(nèi)部正邪雙方斗爭的結(jié)果。

腹水方由白術(shù)、茯苓、土茯苓、葫蘆、黑丑、炒枳實(shí)、大腹皮、厚樸、甲珠等組成，具有清熱解毒、健脾、軟堅(jiān)散結(jié)、利水通淋等作用。李斯文教授認(rèn)為腫瘤患者固護(hù)脾胃后天之本極為重要，本方根據(jù)《景岳全書》茯苓湯的化裁，處方中白術(shù)、茯苓為君藥，共奏通利小便，實(shí)脾的功效，土茯苓、葫蘆、黑丑為臣藥利濕消腫，炒枳實(shí)、大腹皮、厚樸共為佐藥除痰、除脹滿，甲珠為使藥活血散結(jié)，腫瘤腹水患者多有痰瘀互結(jié)癥狀，故加甲珠。本實(shí)驗(yàn)通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，探討腹水方抗腫瘤的可能機(jī)制。

1 材料

1.1 藥品及試劑

實(shí)驗(yàn)藥物：中藥腹水方由云南省中醫(yī)醫(yī)院制劑研究中心提供，將上藥加水后反復(fù)的濃煎，棄去藥渣，然后再將藥液混勻至濃縮為濃度為1.5 g/ml的藥液，置入4℃的冰箱中保存以備用。根據(jù)中藥人、鼠計(jì)量換算的標(biāo)準(zhǔn)換算后，按小鼠0.2 ml/20 g的標(biāo)準(zhǔn)給藥。注射用順鉑：凍干型。按小鼠0.2 mg/ml，0.2 ml灌胃。生理鹽水（0.9%NS）：按小鼠0.2 ml/20g灌胃。實(shí)驗(yàn)試劑：羊抗兔VEGF（19003-1-AP）、羊抗兔 HER2/ErbB2（18299-1-AP）來自proteintech；即用型快捷免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑購自，福建邁新；其他為國產(chǎn)分析醇。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)昆明小鼠55只，7～8周齡，體質(zhì)量18～22 g，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為：SCXK（湘）2016-0002，腹水型肝癌H22細(xì)胞株由云南省中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法

2.1 H22荷瘤小鼠模型的建立、分組和給藥

取接種8天H22腹水瘤小鼠，酒精消毒后，注射器抽取腹水，離心后，調(diào)細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/ml，小鼠右側(cè)腋部皮下接種0.2ml，按照隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組：荷瘤病理模型組、陽性組、低劑量組、中劑量組和高劑量組。荷瘤模型組灌胃等體積的生理鹽水。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

從荷瘤次日起，中藥組以腹水方0.2 mL/10 g灌胃；對(duì)照組以生理鹽水0.2 mL/10 g灌胃；西藥組以順鉑0.2 mg/mL，0.2 ml灌胃；以上4組，每日一次，連續(xù)給藥14天。將50只健康的小鼠隨機(jī)分為5個(gè)組，每組10只。分別為：空白組對(duì)照組（A組），順鉑組（B組），腹水方低劑量組（C組），腹水方中劑量組（D組），腹水方高劑量組（E組）。75%酒精消毒接種小鼠右腋部的皮膚，用0.25 ml注射器抽取0.2 ml瘤細(xì)胞懸液，然后注入B-E組小鼠的右腋部皮下接種，接種24 h后給藥，隨機(jī)分組：A組（0.9%NS，90 mg/Kg），B組（順鉑組0.2 mg/ml，0.2 ml），C 組（腹水方低劑量組 1.5 g/ml，0.2 ml）灌胃，D、E組（分別以3 g/ml和4.5 g/ml，0.2 ml）灌胃，各組每日用藥一次，連用藥14天，第15天脫臼處死小鼠。

在實(shí)驗(yàn)過程中，觀察小鼠的飲水、進(jìn)食、活動(dòng)情況，對(duì)刺激的反應(yīng)，毛色變化，有無腹瀉、消瘦及死亡，并做好記錄。比較腫瘤組織中HER-2，VEGF的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)過程中，第10天，高劑量中藥組死亡1只小鼠，考慮小鼠因腫瘤負(fù)荷過重死亡。

2.3 免疫組化實(shí)驗(yàn)方法

石蠟切片脫蠟至水，3%H2O2室溫10min后，蒸餾水洗3次。微波熱復(fù)修后滴加5%山羊血清室溫封閉20 min。滴加一抗，室溫孵育1 h，PBS洗2 min×3次。滴加酶標(biāo)羊抗鼠、兔IgG聚合物二抗，室溫孵育30 min，PBS洗2 min×3次。滴加試劑SABC，20～37℃ 20 min，PBS洗5 min× 4次。DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染。脫水，透明，封片，顯微鏡觀察，計(jì)算陽性率。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 中藥對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織VEGF表達(dá)水平的影響

表1結(jié)果顯示，與荷瘤模型組比較，陽性組、低劑量組、中劑量組和高劑量組瘤組織VEGF表達(dá)水平顯著增加，其中陽性組、低劑量組和高劑量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織VEGF表達(dá)水平的影響 （±s，n=5）

表1 對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織VEGF表達(dá)水平的影響 （±s，n=5）

注：與荷瘤模型比較，①P＜0.05，②P＜0.01

組別荷瘤模型組陽性組高劑量組中劑量組低劑量VEGF陽性個(gè)數(shù)51±9 73±8②76±9②67±15 75±15①

圖1 中藥對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織VEGF表達(dá)水平的影響

3.2 對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織HER2表達(dá)水平的影響

表2免疫組化結(jié)果顯示，與荷瘤模型組比較，陽性組和高劑量組瘤組織HER2表達(dá)水平低于荷瘤模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3脾指數(shù)、胸腺指數(shù)結(jié)果表示中藥中劑量組脾指數(shù)和胸腺指數(shù)明顯高于其他組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示：在H22小鼠腫瘤組織中，腹水方對(duì)VEGF表達(dá)的影響，不及化療藥物順鉑，但中劑量組較高、低劑量組有明顯差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。腹水方對(duì)HER2表達(dá)的影響隨藥物濃度的遞增而增強(qiáng)，結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表2 中藥對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織HER2表達(dá)水平的影響 （±s，n=5）

表2 中藥對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織HER2表達(dá)水平的影響 （±s，n=5）

注：與荷瘤模型比較，①P＜0.05，②P＜0.01。

組別荷瘤模型組陽性組高劑量組中劑量組低劑量HER2陽性個(gè)數(shù)69±10 49±10①54±3①62±14 72±12

圖2 中藥對(duì)H22荷瘤小鼠瘤組織HER2表達(dá)水平表達(dá)的影響

4 討論

腹水方中各藥物的功效及現(xiàn)代藥理研究：

白術(shù)：苦、甘，溫。歸脾、胃經(jīng)。健脾益氣、燥濕利水、止汗、安胎。用于脾虛食少、腹脹泄瀉、痰飲眩悸、水腫、自汗、胎動(dòng)不安。白術(shù)中的芹烷二烯酮、蒼術(shù)酮和白術(shù)內(nèi)醋I、Ⅱ、Ⅲ均具有一定的抗炎活性[2，3]。李翠琴[4]等發(fā)現(xiàn)白術(shù)石油醚部位以及白術(shù)內(nèi)醋I等為其抗炎有效部位和活性成分。白術(shù)能有效抑制腫瘤細(xì)胞的生長，其中的白術(shù)內(nèi)酯和揮發(fā)油是抗腫瘤的活性成分。白術(shù)中的蒼術(shù)酮、白術(shù)內(nèi)酯I和白術(shù)內(nèi)酯Ⅲ可誘導(dǎo)HL-60和P-388腫瘤細(xì)胞凋亡發(fā)揮細(xì)胞毒作用[5]。Huang等[6]發(fā)現(xiàn)白術(shù)甲醇提取物能夠誘導(dǎo)人T淋巴瘤Jurkat細(xì)胞、U937和HI-60白血病細(xì)胞凋亡，而達(dá)到抗腫瘤的作用。Lee等[7]研究發(fā)現(xiàn)白術(shù)能刺激Thl型淋巴細(xì)胞增值，產(chǎn)生抗體，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。

表3 脾指數(shù)、胸腺指數(shù)

茯苓：首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，味甘、淡，性平。歸心、肺、脾、腎經(jīng)。利水滲濕，健脾和胃，寧心安神的功效。茯苓中的主要成分茯苓多糖既可增強(qiáng)細(xì)胞免疫，又可增強(qiáng)體液免疫，是很好的免疫增強(qiáng)劑。茯苓多糖的免疫抑癌作用是多靶點(diǎn)的，幾乎遍及非特異性免疫和特異性免疫應(yīng)答的多個(gè)環(huán)節(jié)[8]。談新堤[9]實(shí)驗(yàn)顯示，茯苓多糖治療組的小鼠脾臟脾小體數(shù)量增多明顯，脾中央動(dòng)漫周圍淋巴鞘增寬，淋巴細(xì)胞密集，表現(xiàn)出茯苓多糖對(duì)脾臟的保護(hù)作用。茯苓多糖[10]能增強(qiáng)細(xì)胞免疫，調(diào)整T細(xì)胞亞群比值，同時(shí)激活B淋巴細(xì)胞，增強(qiáng)其活性，尤其是細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性。茯苓多糖通過增強(qiáng)腫瘤壞死因子（TNF）基因的轉(zhuǎn)錄而增強(qiáng)巨噬細(xì)胞釋放TNF，并增強(qiáng)其活性，增強(qiáng)NK細(xì)胞活化，促使其分泌白細(xì)胞解讀IL-2、TNF-2等形成殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫系統(tǒng)。能增強(qiáng)基因Fas、Bax的表達(dá)，增強(qiáng)其對(duì)自身或免疫細(xì)胞FasL的凋亡敏感性，下調(diào)腫瘤細(xì)胞FasL的表達(dá)而降低其對(duì)Fas/Fasl系統(tǒng)的反擊能力，防止腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[11，12]。茯苓在《金匱要略》中的配伍運(yùn)用規(guī)律：常用劑量為四兩和三兩，主要發(fā)揮利濕和健脾寧心得作用。茯苓-白術(shù)：主治口渴、小便不利、目眩、心下脹滿者[13]。茯苓多糖能增強(qiáng)基因Fas、Bax的表達(dá)，增加其對(duì)自身或免疫細(xì)胞Fasl的凋亡敏感性，并下調(diào)腫瘤細(xì)胞FasL的表達(dá)而降低其對(duì)Fas/Fasl系統(tǒng)的反擊能力，防止腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸[14，15]。

土茯苓：性味：甘淡，平。歸肝經(jīng)、胃經(jīng)、脾經(jīng)。功能：解毒，除濕，利關(guān)節(jié)。主治：治梅毒，淋濁，筋骨攣痛，腳氣，療疔瘡，癰腫，瘰疬，梅毒及汞中毒所致的肢體拘攣，筋骨疼痛。白麗等[16]以左旋咪唑?yàn)殛栃詫?duì)照組，觀察赤土茯苓苷對(duì)小鼠的胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)、血清溶血素、溶血空斑形成細(xì)胞數(shù)、腹腔吞噬細(xì)胞吞噬中性紅和超敏反應(yīng)的影響。發(fā)現(xiàn)赤土茯苓苷可使小鼠的胸腺、脾臟指數(shù)增加，其中劑量為30 mg/kg時(shí)作用最顯著（P＜0.001），赤土茯苓苷的各劑量組均使小鼠血清溶血素和溶血空斑形成細(xì)胞數(shù)明顯增加（P＜0.001），能增加小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬中性紅的能力。吳麗明等[17]觀察到土茯苓的提取物落新婦苷可使大鼠的尿量增加而且該作用呈劑量-反應(yīng)關(guān)系，同時(shí)通過小鼠扭體反應(yīng)試驗(yàn)和熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)表明，落新婦苷能顯著提高小鼠的熱板痛閾值，表明落新婦苷有明顯鎮(zhèn)痛作用。張白嘉等也[18]研究土茯苓中的落新婦甙能明顯增加大鼠尿量。楊曉鯤等[19]發(fā)現(xiàn)土茯苓提取物可通過誘導(dǎo)Eca-109和SGC-7901細(xì)胞凋亡和阻滯細(xì)胞周期抑制其增殖，最終發(fā)揮抗腫瘤作用，其對(duì)COLO206結(jié)腸癌細(xì)胞也有一定的抑制作用。

葫蘆：甘，平。利尿，消腫，散結(jié)。用于水腫，腹水，頸淋巴結(jié)結(jié)核。Wakimoto等[20]用乳腺癌動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，腹腔注射給予葫蘆素B6周后，腫瘤體積較對(duì)照組縮小55%，器官和組織并未見明顯損傷。Thoennissen等[21]研究表明，葫蘆素B可明顯抑制胰腺癌生長。Sun等[22]報(bào)道，葫蘆素B對(duì)人肺腺癌A549裸鼠移植瘤的抑制率為53.6%。

黑丑：性寒，味苦歸肺、腎、大腸經(jīng)；有小毒；瀉水，驅(qū)蟲。張虹等[23]發(fā)現(xiàn)黑丑可以有效的穩(wěn)定G-四鏈體結(jié)構(gòu)，進(jìn)而可以通過抑制端粒酶的活性的途徑，破壞腫瘤細(xì)胞的永生化，最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。

枳實(shí)：最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》苦；辛；寒。歸脾；胃；肝；歸心經(jīng)。積滯內(nèi)停；痞滿脹痛；大便秘結(jié)；瀉痢后重；結(jié)胸；胃下垂；子宮脫垂；脫肛。有研究表明，柑桔黃酮可誘導(dǎo)白細(xì)胞抑制HL260白血病細(xì)胞的生長[24]。Sergeev I等[25]研究表明多甲氧基黃酮能夠誘導(dǎo)Ca2+介導(dǎo)的乳腺腫瘤細(xì)胞的凋亡，Manthey J A等[26，27]表明陳皮中的多甲氧基黃酮對(duì)人體肺、結(jié)腸、乳腺ER+、乳腺ER-、前列腺、黑素瘤6種癌細(xì)胞群有很強(qiáng)的抗增殖活性。

厚樸：味苦辛，性溫，歸脾經(jīng)、胃經(jīng)、大腸經(jīng)。行氣消積；燥濕除滿；降逆平喘?！搬t(yī)圣”張仲景，在其所著《金匱玉函方》的210個(gè)古方中，有厚樸配伍的處方多達(dá)25個(gè)，占了11.9%，可見厚樸在我國傳統(tǒng)中藥的重要地位?，F(xiàn)代研厚樸中的主要成分究厚樸酚與和厚樸酚在體內(nèi)和體外均被發(fā)現(xiàn)可以抑制新生血管及腫瘤生長，并且在有效劑量范圍內(nèi)能夠被宿主很好的耐受，其作用機(jī)制是在人的內(nèi)皮細(xì)胞通過干擾血管內(nèi)皮生長因子受體 2（VEGFR2）的磷酸化來抑制血管生成[28，29]。鄧俊芳研究發(fā)現(xiàn)和厚樸酚作為厚樸的主要有效成分之一，在體外能以劑量和時(shí)間依賴方式明顯地抑制PANC-1細(xì)胞生長，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞G1期阻滯是其主要機(jī)制。

甲珠：味咸，性涼，入肝胃經(jīng)。具有消腫潰癰，搜風(fēng)活絡(luò)，通經(jīng)下乳的功效。穿山甲的鱗片主要成分是蛋白質(zhì)，含硬脂酸，膽甾醇，N-丁基-二十三（碳）酰胺，環(huán)L-絲氨酰-L酪氨酰）二肽[cyclo（L-seryl-L-trosyl）]和環(huán)（D-絲氨酰-L-酪氨酰）-L-酪氨酰二肽[cyclo（D-seryl-L—tyrosyl），又含鋅、鈉、鈦、鈣等18種元素。水溶液含多種游離氨基酸，還含揮發(fā)油和水溶性生物堿（穿山甲堿）等。穿山甲具有降低血液粘度，抗炎，提高小白鼠常壓缺氧的耐受能力，穿山甲堿能升高白細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體的免疫[30]。王英[31]研究穿山甲蛋白提取物在體外抑制K562細(xì)胞的影響中發(fā)現(xiàn)，穿山甲蛋白提取物在體外可抑制K562細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡的抗白血病細(xì)胞效應(yīng)。

中醫(yī)藥對(duì)腫瘤的治療作用越來越受到重視，中藥腹水方對(duì)H22小鼠腫瘤組織有一定的抑制作用，可能通過調(diào)節(jié)VEGF的蛋白表達(dá)，來抑制腫瘤血管的生成，中劑量組與低劑量組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且高劑量組可明顯降低腫瘤組織內(nèi)HER-2的表達(dá)，今后應(yīng)進(jìn)一步深入研究腹水方對(duì)腫瘤抑制的機(jī)制。