10-姜酚對ABL1影響的分子模擬及實驗研究

張競之，鄧波，江小梨，張雙偉，蔡敏，鄧穗暉，陳瑞雪，劉彬

1.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院中醫(yī)科，廣東 廣州 510260；2.廣州醫(yī)科大學中西結合研究所，廣東 廣州 510260

肝癌是我國最常見的消化系統(tǒng)腫瘤，發(fā)病率高、死亡率高，目前針對肝癌治療的藥物效果有限，探索新型有效的抗肝癌藥物的研發(fā)具有重要意義[1]。10-姜酚（10-Gingerol，10-G）是生姜的主要成分之一。研究表明生姜中的姜酚類化合物具有抗腫瘤、抗炎、止嘔、抗氧化、免疫調節(jié)等作用，姜酚類成分抗腫瘤作用及其機制一直是研究的熱點[2]。原癌基因酪氨酸激酶ABL1（Protooncogene tyrosine-protein kinase ABL1，ABL1）屬于非受體蘇氨酸蛋白激酶家族，是調控腫瘤的血管生成、發(fā)展以及轉移的關鍵蛋白，在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，包括有慢性粒細胞白血病、乳腺癌、胃癌、肝癌等[3]。本研究將采用分子對接、分子動力學模擬技術以及細胞實驗研究10-G對ABL1蛋白激活的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料

中藥對照品10-姜酚購自成都曼思特生物科技有限公司（純度＞99.04%，貨號：MUST-17033004，批號：23513-15-7）。胎牛血清購自BI公司。DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco公司。BCA蛋白定量試劑盒、ECL顯影劑購自美國Thermo公司。抗p-ABL1、ABL-1抗體購自美國Affinity公司，抗GAPDH抗體購自美國CST公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

人肝癌細胞株HepG2購自中國科學院細胞庫。用含10%胎牛血清、青霉素（100 U/mL）、鏈霉素（100 mg/mL）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，在37℃，5%CO2以及飽和濕度條件下的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞生長狀態(tài)，細胞生長呈80%-90%融合狀態(tài)時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，隔日換液，每2～3 d傳代一次。

1.3 分子對接與分子動力學模擬

使用AutoDock軟件分析10-G與ABL1之間的關系。從PDB數(shù)據(jù)庫獲得ABL1（PDB ID：2HZI）的空間結構。從ZINC數(shù)據(jù)庫取得10-G（ZINC ID：ZINC43009609）的3D分子結構。采用分子對接軟件Autodock VINA進行分子對接模擬。用ABL1與已知的ABL1抑制劑PD180970的結合位點預測10-G與ABL1之間的關系。將10-G與ABL1進行分子對接，采用結合力評估結合能力的大小。采用Pymol 2.7軟件進行3D作圖。采用YASARA進行分子動力學模擬，將ABL1與10-G之間的最佳構象作為初始構象。在AMBER03力場中進行模擬。將蛋白結構置于立方體中，立方體邊緣與蛋白質最小距離為5 ?，以0.9%的NaCl作為溶劑。在分子動力學模擬之前，對每個體系進行能量最小化，采用2 000步的最小化法和2 000步的共軛梯度法。然后利用Berendsen熱浴控制每個分子的溫度。最后，進行100 ns，步長為2 fs的分子動力學模擬。

1.4 Wesltern Blot檢測

Western blot法檢測相關蛋白的表達。60 mm培養(yǎng)皿培養(yǎng)細胞，PBS漂洗后收集細胞，RIPA裂解液裂解，提取總蛋白用BCA蛋白定量試劑盒定量，加入上樣緩沖液，10%SDS-PAGE電泳，轉膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入一抗4℃孵育過夜，1×TBST液洗滌3次，每次7分鐘，加入二抗，37℃孵育1h，1×TBST液洗滌3次，每次7分鐘。ECL化學發(fā)光試劑盒顯色，膠片曝光。

1.5 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析，實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差（Mean±SD），重復測量數(shù)據(jù)比較采用重復測量方差分析（Repeated measures data of ANOVA），多組比較采用單因素方差（One-Way ANOVA），若方差齊性，各組間多重比較采用LSD法（Least-significant difference test），若方差不齊時，采用Welch穩(wěn)健估計，再采用Dunnett's T3方法兩兩比較。P＜0.05被認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 10-G與ABL1的分子對接

采用分子對接方法評價ABL1與10-G之間的關系。ABL1與10-G的結合力為-7.96 kcal/mol。ABL1與10-G的結合構象見圖1，10-G與ABL1的氨基酸殘基GLU-305形成氫鍵連接，氫鍵的長度為2.1 ?。

2.2 10-G與ABL1復合物的分子動力學模擬

圖1 10-G與ABL1分子對接模擬Figure 1 Molecular docking simulation investigated the interaction between 10-G and ABL1

我們進一步采用分子動力學技術探索ABL1與10-G結合的穩(wěn)定性。ABL1-10-G復合物的表面模擬模型見圖2A-B，圖2A為0ns時的結合構象，圖2B為第100 ns的結合模型。經(jīng)過100 ns的分子動力學模擬，10-G仍位于ABL1的抑制劑結合位點。圖2C展示了重原子均方根偏差（Root-meansquare deviation，RMSD）的變化軌跡。ABL1-10-G復合物的RMSD圍繞2 ?波動，非結合狀態(tài)ABL1在前60 ns上升至4.5 ?后，逐漸降低并波動在3.9 ?。圖2D展示了非結合狀態(tài)ABL1以及ABL1-10-G復合物勢能的變化軌跡，ABL1-10-G復合物的勢能高于非結合狀態(tài)的ABL1。

2.3 10-姜酚抑制肝癌細胞ABL1磷酸化水平

我們將10-G（10、20、30μM）處理肝癌HepG2細胞24小時后，Western blot檢測p-ABL1、ABL1、GAPDH的表達。結果見圖3，低、中、高的10-G顯著降低肝癌細胞p-ABL1的表達，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.001）。

3 討論

圖2 ABL1-10-G復合物的分子動力學模擬Figure 2 Molecular dynamics simulation of ABL1-10-G complex

圖3 10-G抑制HepG2細胞中ABL1的激活Figure 3 10-G inhibited the activation of ABL1

10-G屬于姜酚類化合物，現(xiàn)代藥物藥理學研究發(fā)現(xiàn)，姜酚具有抗腫瘤、降血糖、抗氧化、抗炎等作用[4]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)10-G具有抗黑色素瘤的作用[5]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)10-G能抑制肝癌HepG2細胞的增殖[6]，誘導乳腺癌MDAMB-231細胞[7]以及結腸癌HCT116細胞[8]的凋亡。然而，10-G抗腫瘤的機制尚不完全清楚，本研究對10-G的抗腫瘤機理進行探索。

ABL1是一種非受體酪氨酸激酶，存在于細胞質及細胞核中，具有調節(jié)腫瘤生長、轉移及血管新生的作用[9]。研究發(fā)現(xiàn)ABL1能調控有絲分裂激酶調節(jié)器PLK1的磷酸化，從而抑制PLK1的泛素化與降解，進而調控腫瘤的增殖[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，ABL1具有調控PDGF誘導的腫瘤的遷移的作用，其機制可能于調控αvβ3整合素有關[11]。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)ABL1能介導堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）誘導的腫瘤血管新生[12]。因此，ABL1是腫瘤研究的重要靶點之一，針對ABL1抑制劑具有良好的開發(fā)前景。

近年來，分子對接及分子動力學模擬技術廣泛應用于藥物研發(fā)及篩選中，可以顯著的提高藥物開發(fā)的精準度和效率。本研究通過分子對接技術預測10-G與ABL1進行對接來預測復合物模型，分析表明10-G與ABL1之間具有較強的結合活性。我們還進一步采用了分子動力學技術對10-G與ABL1結合的穩(wěn)定性進行評價，結果顯示10-G與ABL1的結合是穩(wěn)定的。為了進一步驗證10-G與ABL1之間的關系，我們觀察了10-G對肝癌HepG2細胞ABL1激活的影響。結果顯示，10-G能顯著抑制ABL1的激活。此外，ABL1已被證實在白血病、乳腺癌、結腸癌中起了重要作用[9]。這提示10-G可能具有防治這些腫瘤的潛力。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)10-G可能是一個潛在ABL1抑制劑，其抗腫瘤作用與抑制ABL1密切相關。本次研究結果提示抑制ABL1可能是10-G及姜酚抗肝癌的新靶點。