Nanofat制作、臨床應(yīng)用及作用機(jī)制的研究進(jìn)展

曾茂嬌 （綜述），賀光照（審校）

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院整形燒傷科，重慶，400016）

自Coleman等學(xué)者對(duì)脂肪移植技術(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化以來，顆粒脂肪移植已成為整形外科中非常重要的材料，廣泛應(yīng)用于全身各部位軟組織缺失的修復(fù)、皮膚老化的改善及慢性創(chuàng)面的治療等，療效肯定[1]。顆粒脂肪分為大顆粒脂肪（macrofat）和小顆粒脂肪（microfat）[2]。Macrofat多用于改善因先天性、外傷、疾病或老化引起的局部軟組織缺損，一般采用直徑2mm的鈍針進(jìn)行注射，適用于乳房和臀部等大范圍部位的填充[3]。隨著面部自體脂肪填充的發(fā)展，臨床上逐漸開始使用0.7mm直徑的注脂針來注射更細(xì)的顆粒脂肪，這種直徑的脂肪組織被稱為Microfat[2]。顆粒脂肪移植在容積改善方面作用較大，然而，對(duì)于面部細(xì)小溝槽、皺紋、眼瞼、口周、頸紋、瘢痕組織等精細(xì)區(qū)域的填充，顆粒脂肪難以順利通過細(xì)小注射針，必須使用更微小的脂肪組織進(jìn)行注射[4]。

Tonnard等于2013年報(bào)道通過機(jī)械乳化的過程生產(chǎn)脂質(zhì)乳液，稱之為“nanofat”[5]，直譯為“納米脂肪”。應(yīng)當(dāng)注意，nanofat并非等同于納米技術(shù)，F(xiàn)riji認(rèn)為nanofat一詞有待商榷，因?yàn)榧?xì)胞的大小是微米級(jí)別，乳化過濾后的脂肪難以達(dá)到納米級(jí)別，并建議將nanofat改為supermicrofat[6]，但目前nanofat一詞仍被廣泛使用，已成為約定俗成的名稱。大量研究表明nanofat中含有豐富的脂肪組織來源的SVF細(xì)胞與ADSCs，可以通過旁分泌作用或直接分化成脂肪細(xì)胞來提高脂肪移植物的存活率，對(duì)組織修復(fù)和再生具有重要作用，一經(jīng)報(bào)道就被應(yīng)用于改善皮膚老化狀態(tài)、抑制瘢痕增生及促進(jìn)創(chuàng)面愈合等治療過程，收到了滿意的臨床效果[5，7，8]?，F(xiàn)對(duì)nanofat的制作方法、臨床應(yīng)用進(jìn)展及其作用機(jī)制做一綜述。

1 Nanofat的制作方法

1.1 經(jīng)典Tonnard法[5]

該法由Tonnard提出，具體操作步驟為：使用標(biāo)準(zhǔn)的脂肪抽吸裝置進(jìn)行負(fù)壓吸脂術(shù)，吸脂部位選取為下腹部，吸脂管選擇為具有多口的直徑為3mm的套管，該套管具有直徑為1mm的尖銳側(cè)孔。獲取的脂肪以生理鹽水漂洗，并通過具有0.5mm孔徑的無菌尼龍布過濾，過濾后脂肪組織留取進(jìn)行機(jī)械乳化。脂肪的乳化是通過使用Luer-Lok連接器連接兩個(gè)10mL注射器，借助注射器的對(duì)推使脂肪在注射器間來回轉(zhuǎn)移實(shí)現(xiàn)的。經(jīng)過30次轉(zhuǎn)移后，脂肪變成乳液，并呈現(xiàn)出乳白色的外觀。乳化結(jié)束后再次用無菌尼龍布過濾脂肪液以去除可能阻塞細(xì)針的結(jié)締組織，將流出物收集在無菌接收器中，該流出物即為“nanofat”。

1.2 各種改良技術(shù)

在Tonnard法基礎(chǔ)上，不同學(xué)者對(duì)其進(jìn)行了相應(yīng)的改良。Liang等[9]和Wei等[10]通過使用20mL的注射器來實(shí)現(xiàn)脂肪的乳化，Wei等通過3min的對(duì)推過程獲取乳糜脂肪組織[10]，李聰?shù)葎t進(jìn)行90次的對(duì)推過程獲取乳糜脂肪組織[11]。Gu 等[12]和Kemaloglu[13]在得到乳糜化脂肪后用離心機(jī)以3000 r/min的速度離心3 min，取中層組織進(jìn)行相關(guān)研究，并稱之為“濃縮nanofat”。Bi等對(duì)Tonnard法進(jìn)行了更大的改進(jìn)，采用0.2 mg/ml膠原酶I消化新鮮脂肪組織15min后再以330×g離心7min，收集上清液脂肪細(xì)胞部分并通過細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集流出物稱之為“Vivo nanofat”，其研究顯示Vivo nanofat體內(nèi)移植后的吸收率明顯低于nanofat[14]。Lo Furno等在得到乳糜化的脂肪后，未將脂肪乳液再次擠壓通過紗布過濾，將此乳糜化的脂肪定義為“nanofat 2.0”，并發(fā)現(xiàn)nanofat 2.0中ADSCs的密度高于普通的nanofat[15]。Jan 等也通過類似的方式獲取nanofat，稱之為“未過濾的nanofat”[16]。

2 Nanofat的臨床應(yīng)用

2.1 面頸部年輕化

通過使用新分離的nanofat進(jìn)行移植，或與自體顆粒脂肪相結(jié)合的共同移植是改善皮膚老化狀態(tài)和恢復(fù)皮膚活力的有效途徑，尤其適用于面部細(xì)小溝槽、黑眼圈、皺紋及頸紋等面頸部精細(xì)部位的局部注射治療。李聰?shù)葢?yīng)用nanofat于48例患者眶周凹陷、細(xì)紋及暗沉處進(jìn)行真皮及皮下層內(nèi)注射，絕大多數(shù)患者于1次注射填充后即達(dá)到明顯改善，滿意度高[11]。Tonnard等將nanofat移植用于口周皺紋（38例），眉間凹陷皮膚（15例），曬傷皮膚（8例），疤痕（4例）和黑眼圈（2例）的治療，取得良好的臨床結(jié)果，患者皮膚質(zhì)量有顯著改善，未觀察到如感染、脂肪囊腫等嚴(yán)重的并發(fā)癥[5]。Liang等研究發(fā)現(xiàn)103名接受nanofat和富血小板纖維蛋白（PRF）聯(lián)合注射的患者較128名注射透明質(zhì)酸的患者，面部皮膚紋理得到更大程度的改善，滿意度更高[9]。Wei等采用nanofat、PRF和自體顆粒脂肪共同移植治療62名軟組織缺陷或皮膚衰老的患者，其臨床療效大于單純的脂肪移植組，總體滿意率高于90%[10]。Bi等為一名頸紋突出的患者進(jìn)行局部注射nanofat，隨訪6個(gè)月，該患者頸紋得到顯著改善[14]。

2.2 瘢痕的治療

近來研究發(fā)現(xiàn)通過局部注射nanofat治療各類型的瘢痕可收到滿意的臨床效果。焦虎等將nanofat注射至33例凹陷性瘢痕組織內(nèi)， 3月后可見瘢痕凹陷明顯變淺，顏色變淡、彈性更好、質(zhì)地更柔軟[17]。Gu等使用“濃縮nanofat”結(jié)合小顆粒脂肪聯(lián)合移植治療25例萎縮性面部疤痕，患者術(shù)后在疤痕顏色、硬度、色素沉著、厚度等方面均有明顯改善，術(shù)后還觀察到基底細(xì)胞層中黑色素染色的增強(qiáng)以及發(fā)現(xiàn)新生的皮脂腺和汗腺[12]。Bhooshan等將nanofat注射到34例不同病因的瘢痕組織中，術(shù)后3個(gè)月可明顯緩解疼痛、瘙癢、僵硬度、厚度、顏色、不規(guī)則度等癥狀表現(xiàn)，還可改善血管分布、緩解程度、柔韌性、厚度和色素沉著等瘢痕特征[18]。Jan等將“未過濾的nanofat”注射到48例燒傷后面部瘢痕的皮下或皮內(nèi)層面，隨訪6個(gè)月，發(fā)現(xiàn)瘢痕組織在色素沉著和柔韌性兩方面均具有顯著性的改善[16]。

2.3 其他治療

Nanofat可促進(jìn)創(chuàng)面愈合和皮片成活：在1例左前壁具有創(chuàng)傷性皮膚缺損的病例中，Kemaloglu先對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行自體中厚皮片移植，隨后將nanofat注射入移植皮片下方，隨訪6個(gè)月，皮膚移植物存活良好且具有優(yōu)異的柔韌性，創(chuàng)面的血管分布也令人滿意[13]。有學(xué)者將nanofat用于治療外陰硬化性苔蘚，2次注射后患者外陰形態(tài)明顯改善，皮膚黏膜質(zhì)地及彈性明顯好轉(zhuǎn)，瘙癢、灼燒感消失，性生活質(zhì)量明顯提高[19]。通過關(guān)節(jié)內(nèi)注射Nanofat還可用于顳下頜關(guān)節(jié)病的治療，能有效的改善患者的疼痛、開口度、關(guān)節(jié)彈響等表現(xiàn)[20]。此外，相較于顆粒脂肪，nanofat移植更易注射于需要高精度注射的頭皮區(qū)域，該技術(shù)可用作毛囊移植的補(bǔ)充物或作為脫發(fā)的再生治療[21]。

3 Nanofat作用機(jī)制的探討

3.1 Nanofat含有大量SVF及ADSCs

Nanofat是一種源自脂肪組織的天然乳化懸浮液，研究顯示乳化過程使成熟的脂肪細(xì)胞完全被破壞，但未對(duì)干細(xì)胞的產(chǎn)量、活力、或成脂分化能力等產(chǎn)生顯著性的影響[8]。因此nanofat內(nèi)雖不含有成熟脂肪細(xì)胞，但卻富含大量SVF，SVF中含有不同類型的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞，單核細(xì)胞，粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，還包括大量間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）[5，22]。Tonnard 等 報(bào) 道 nanofat 中 SVF 的 數(shù) 量 為1.98×106個(gè)/ 100mL nanofat，SVF中CD34細(xì)胞數(shù)量為0.1×106個(gè)/100mL nanofat[5]，具有CD34表型的細(xì)胞代表著具有巨大干細(xì)胞增殖能力的細(xì)胞群，在體外這類細(xì)胞具有多向分化潛能。Nanofat中ADSCs所占比例約為3.11%±0.8%，為標(biāo)準(zhǔn)脂肪抽吸物中的3倍[7]。ADSCs不僅具有多項(xiàng)分化功能，還具有旁分泌能力，可分泌血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)、肝細(xì)胞生長因子(HGF)等，進(jìn)而調(diào)節(jié)新血管形成及組織再生，這些因子還具有抗氧化作用，可以抵抗在任何狀態(tài)下自由基形成的皮膚損傷[9，23]。此外，ADSCs能在真表皮細(xì)胞的影響下通過表型轉(zhuǎn)換分化為成纖維細(xì)胞及角質(zhì)形成細(xì)胞直接參與真表皮的組織結(jié)構(gòu)再生[24]。

3.2 Nanofat能促進(jìn)脂肪移植物的存活

MSCs已被證明可提高脂肪移植物的活力，這主要是通過促進(jìn)血管生成來實(shí)現(xiàn)的[7，22，24]。Yu 等將nanofat與顆粒脂肪移植物共同移植入裸鼠皮下，術(shù)后12周結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，共移植組表現(xiàn)出更高的移植物重量和體積保留，更好的組織結(jié)構(gòu)和更高的毛細(xì)血管密度，這表明nanofat可以促進(jìn)新生血管形成并改善脂肪移植物的存活[7]。另一方面，nanofat中含有大量的死亡的脂肪細(xì)胞，已知凋亡細(xì)胞釋放細(xì)胞因子并吸引誘導(dǎo)生長因子的巨噬細(xì)胞[25]，因此，共同注射乳化分解的脂肪細(xì)胞可能對(duì)ADSCs的分化和組織再生具有刺激作用。

3.3 Nanofat含有多種抗纖維化因子

Nanofat較顆粒脂肪組織富有更高濃度的ADSCs，ADSCs可以合成分泌多種抗纖維化因子，如白細(xì)胞介素-10（IL-10）、HGF等[26]。這些物質(zhì)可參與皮膚黏膜創(chuàng)面的修復(fù)過程，抑制瘢痕生長的同時(shí)可改善皮膚質(zhì)地，在面部年輕化、創(chuàng)傷修復(fù)中起到很好的治療效果[27，28]。在傷口愈合的增生期，ADSCs分泌的VEGF-A和bFGF可強(qiáng)而有效地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖及分化，從而利于血管生成及穩(wěn)定[29]。此外，脂肪細(xì)胞外基質(zhì)中還含有抵抗素及腫瘤壞死因子（TNF）等物質(zhì)，可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的的凋亡，抑制其過度分泌致纖維物質(zhì)；同時(shí)還能降低肥大細(xì)胞活性，使瘢痕增生得到一定程度的抑制[30]。近來研究還發(fā)現(xiàn)ADSCs能夠通過旁分泌作用抑制增生性瘢痕來源的成纖維細(xì)胞（HSF）內(nèi)I、III型膠原，轉(zhuǎn)化生長因子-β1（TGF-β1），白細(xì)胞介素-6（IL-6），α-肌動(dòng)蛋白（α-SMA），纖連蛋白（Fibronectin）及結(jié)締組織生長因子（CTGF）等促瘢痕增殖基因的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn)核心蛋白聚糖（Decorin）和基質(zhì)金屬蛋白酶-1（MMP-1）等抗纖維化的基因的表達(dá)[31]。上述多種因素共同作用可有效改善皮膚質(zhì)地，抑制瘢痕的增生。

3.4 其他抗纖維機(jī)制

Nanofat中的ADSCs除可通過分泌抗纖維化因子抑制瘢痕增生外，還可能存在其他抗纖維化的機(jī)制。研究表明，創(chuàng)面的炎癥環(huán)境可激發(fā)MSCs啟動(dòng)免疫調(diào)節(jié)作用，上調(diào)前列腺素E2（PGE2）及環(huán)氧化酶-2（COX-2）的表達(dá)，以減輕炎癥反應(yīng)并抑制炎癥反應(yīng)延長導(dǎo)致的免疫功能紊亂[32]。ADSCs 還可促進(jìn)T細(xì)胞產(chǎn)生誘導(dǎo)性NO，后者可改變ROS/RNS（反應(yīng)活性氮類物質(zhì)）平衡，阻止纖維化形成[33，34]。除此之外，ADSCs還能抑制HSF中TGF-β1及其細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)分子（如p-smad2，p-smad3，p-Stat3和p-ERK）的蛋白質(zhì)表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)抑制HSF的增殖、遷移和收縮等性能[31，35，36]。

4 臨床展望

由于缺乏完整的脂肪細(xì)胞，nanofat的體積效應(yīng)顯然非常有限，與顆粒脂肪移植相比，nanofat移植的適應(yīng)癥是截然不同的。Nanofat的發(fā)明實(shí)際上提供了一種簡(jiǎn)單制備SVF及ADSCs的技術(shù)，更擴(kuò)大了脂肪移植的治療范圍，為改善顆粒脂肪移植的存活率、瘢痕的治療及機(jī)體精細(xì)部位的局部注射提供了新思路，為整形和重建手術(shù)中的脂肪移植物的選擇及補(bǔ)充提供了一種潛在的臨床可行方法。