薄層液基細(xì)胞學(xué)聯(lián)合細(xì)胞DNA定量分析技術(shù)在惡性胸腔積液診斷中的應(yīng)用價(jià)值*

汪少華,李 丹,黃叢改,王潔瓊,萬 宇,昝 瀟,楊 波,楊志惠△

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院：1.病理科；2.腫瘤科,四川瀘州 646000)

胸腔積液是許多疾病常見的臨床體征，許多惡性胸腔積液(MPE)疾病早期發(fā)現(xiàn)和治療能顯著提高患者的生存率[1]。胸腔積液的細(xì)胞學(xué)檢查目前被認(rèn)為是獲得診斷的首選和主要途徑[2]。然而細(xì)胞學(xué)是一種高度依賴形態(tài)學(xué)的檢查方法，需要經(jīng)過嚴(yán)格培訓(xùn)和經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)生及高質(zhì)量的制片技術(shù)。若病理醫(yī)生診斷經(jīng)驗(yàn)不足，或因長期閱片造成的視力疲勞等均會(huì)造成假陽性及假陰性[3-4]。 DNA定量分析技術(shù)(DNA-ICM)是一種建立在基因水平上新興的全自動(dòng)檢查方法[5]。本研究旨在研究薄層液基細(xì)胞學(xué)(TCT)聯(lián)合DNA-ICM技術(shù)來鑒別MPE，減少診斷過程中的人為誤差，探討MPE最佳的檢測方法，為臨床診斷和評估MPE提供依據(jù),現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2016年7月至2018年6月在西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院的678例胸腔積液患者為試驗(yàn)組，其中男372例，女306例，年齡16～91歲。269例MPE患者，其中男152例，女117例，年齡16～91歲，轉(zhuǎn)移性腺癌208例，轉(zhuǎn)移性鱗癌30例，大細(xì)胞癌7例，小細(xì)胞癌12例，間皮瘤6例，淋巴瘤4例，未分型2例。409例良性胸腔積液標(biāo)本作為對照組，所有研究對象均經(jīng)臨床和病理診斷證實(shí)。每例患者胸腔積液標(biāo)本均采用TCT和DNT-ICM檢查。本研究所有研究對象均知情同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2方法

1.2.1制片及染色 取100 mL胸腔積液標(biāo)本,離心機(jī)在室溫下，以1 500 r/min 離心15 min，取沉淀進(jìn)行復(fù)懸，應(yīng)用新柏氏液基細(xì)胞保存，采用膜式薄層液基細(xì)胞學(xué)制片機(jī)(美國豪洛捷醫(yī)療技術(shù)公司)制片，每例制成2張薄層細(xì)胞學(xué)片，1張薄層細(xì)胞片行HE染色進(jìn)行TCT檢查，1張行 Feulgen DNA染色，全自動(dòng)細(xì)胞 DNA圖像定量分析系統(tǒng) (廈門麥克奧迪醫(yī)療診斷有限公司) 作DNA定量分析。

1.2.2TCT診斷 由病理科有豐富細(xì)胞學(xué)診斷經(jīng)驗(yàn)的職稱為中級及以上醫(yī)師完成TCT閱片及診斷，查找惡性腫瘤細(xì)胞。TCT診斷結(jié)果分4級，Ⅰ級：未查見惡性腫瘤細(xì)胞；Ⅱ級：查見異型細(xì)胞；Ⅲ級：查見可疑惡性腫瘤細(xì)胞；Ⅳ級：查見惡性腫瘤細(xì)胞(包括轉(zhuǎn)移性癌和惡性間皮瘤等)。參照文獻(xiàn)[6]以Ⅰ級定為陰性判斷標(biāo)準(zhǔn)，Ⅱ級、Ⅲ級和Ⅳ級定為陽性。

1.2.3DNA-ICM診斷 由全自動(dòng)細(xì)胞圖像掃描分析系統(tǒng)對每例5 000個(gè)以上胸腔積液細(xì)胞核進(jìn)行自動(dòng)聚焦掃描處理[7]。該系統(tǒng)同時(shí)測定每個(gè)細(xì)胞核DNA的132個(gè)參數(shù)特征，自動(dòng)對被檢細(xì)胞進(jìn)行分類和計(jì)數(shù)，自動(dòng)打印DNA倍體分析直方圖和細(xì)胞點(diǎn)陣分布圖，主要通過測定染色體細(xì)胞核積分光密度(IOD)值來判斷細(xì)胞核DNA的含量，并以二倍體細(xì)胞(G1/G0)DNA指數(shù)(DNA index，DI) 為1，正常細(xì)胞 DI 值多為1左右；當(dāng)DI為2時(shí)，多為四倍體細(xì)胞(G2/M期)。DI為1.1～1.9和2.1～2.9的細(xì)胞被認(rèn)為是異倍體細(xì)胞。當(dāng)異倍體細(xì)胞DI在1.1～1.9形成峰值，或有3個(gè)以上的細(xì)胞DI≥2.5時(shí)，可作為DNA-ICM診斷MPE的陽性指征。通常將DNA-ICM診斷結(jié)果分為3級，Ⅰ級：正常標(biāo)準(zhǔn)，無明顯異倍體細(xì)胞峰及異倍體細(xì)胞；Ⅱ級：可疑惡性標(biāo)準(zhǔn)，查見少量DNA倍體異常細(xì)胞 (1～2 個(gè)細(xì)胞，DI≥2.5)；Ⅲ級：惡性標(biāo)準(zhǔn)，查見大量DNA倍體異常細(xì)胞 (3個(gè)或 3個(gè)以上細(xì)胞，DI≥2.5) 及異倍體細(xì)胞峰。 其中DI≥2.5以上的標(biāo)本玻片需經(jīng)有經(jīng)驗(yàn)的細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)生在顯微鏡下閱片，以防系統(tǒng)將深染雜質(zhì)和擁擠重疊的細(xì)胞核誤認(rèn)為惡性細(xì)胞造成假陽性。 在統(tǒng)計(jì)學(xué)分析時(shí)將Ⅰ級定為陰性胸腔積液，Ⅱ級和Ⅲ級定為陽性胸腔積液。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料以率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)。以P<0．05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1TCT和DNA-ICM診斷結(jié)果比較 在TCT診斷結(jié)果為炎性胸腔積液、異型細(xì)胞、可疑惡性及惡性腫瘤對應(yīng)的DNA倍體陽性率分別為7.2%、37.0%、47.6%、55.4%，見表1。

表1 TCT檢查和DNA-ICM分析比較(n)

2.2TCT、DNA-ICM與臨床病理結(jié)果比較 經(jīng)臨床和病理證實(shí)的269例MPE，TCT診斷為Ⅱ～Ⅳ級者214例，DNA-ICM發(fā)現(xiàn)少量異倍體細(xì)胞及以上152例。409例對照組胸腔積液標(biāo)本中，TCT檢測有62例假陽性，而DNA-ICM檢測只有20例出現(xiàn)假陽性，見表2、圖1～2。

2.3TCT與DNA-ICM診斷靈敏度及特異度的比較 TCT在MPE診斷中的總體靈敏度為79.6%，DNA-ICM的總體靈敏度為56.5%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。TCT和DNA-ICM在MPE診斷中的特異度分別為84.8%、95.1%，DNA-ICM特異度雖然高于TCT，但兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4TCT或DNA-ICM與聯(lián)合診斷的比較 TCT單獨(dú)診斷靈敏度遠(yuǎn)高于DNA-ICM，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。進(jìn)一步比較，29例患者在TCT診斷良性積液，而DNA-ICM分析中出現(xiàn)DNA倍體異常細(xì)胞，TCT與DNA-ICM聯(lián)合診斷靈敏度為90.0%，特異度為89.5%,聯(lián)合診斷的特異度雖有所降低，但是靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表2 TCT和DNA-ICM在MPE中檢測中的靈敏度和特異度分析(n)

A：DNA指數(shù)直方圖及散點(diǎn)圖；B：細(xì)胞核圖像及DI值；C：Feulgen DNA染色細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖1惡性胸腔積液標(biāo)本DNA倍體檢測

A：DNA指數(shù)直方圖及散點(diǎn)圖；B：細(xì)胞核圖像及DI值；C：Feulgen DNA染色細(xì)胞形態(tài)(×200)

圖2良性胸腔積液標(biāo)本中DNA倍體檢測

3 討 論

臨床上有胸腔積液的病例很多，為患者抽胸腔積液除了可減輕癥狀外，也可從細(xì)胞病理角度明確胸腔積液的性質(zhì)。判斷是惡性腫瘤還是其他非腫瘤性疾病引起的胸腔積液，是細(xì)胞病理學(xué)診斷的難點(diǎn)[6,8]。MPE的診斷方法有很多種，包括胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查、DNA倍體定量分析、影像學(xué)檢查、腫瘤標(biāo)志物檢查、胸腔積液分子標(biāo)記、胸腔鏡活檢等。其中，胸腔鏡活檢組織病理學(xué)是最準(zhǔn)確的檢查方法，被稱為金標(biāo)準(zhǔn)[9-10]。細(xì)胞病理學(xué)檢查是診斷胸腔積液最常用的經(jīng)典檢查方法，尤其是對于不能耐受胸腔鏡等有創(chuàng)檢查的患者。但是細(xì)胞學(xué)檢查的靈敏度變化與細(xì)胞病理醫(yī)生的經(jīng)驗(yàn)、送檢標(biāo)本的質(zhì)量，腫瘤的分型和分化程度有關(guān)。

DNA倍體定量分析是腫瘤早期檢測中的重要一環(huán)，通過DNA倍體分析進(jìn)行胸腔積液良惡性的診斷在國內(nèi)外已有大量文獻(xiàn)報(bào)道，在北美、歐洲已是常規(guī)臨床檢測方法之一[11-12]。細(xì)胞DNA定量分析目前大多數(shù)是采用流式細(xì)胞儀(FCM)或計(jì)算機(jī)圖像分析儀(ICM)，但FCM的設(shè)備昂貴，必須制備單細(xì)胞懸液，操作更復(fù)雜，不適合基層醫(yī)院開展。DNA-ICM分析通過全自動(dòng)數(shù)碼顯微鏡掃描標(biāo)本玻片的每一個(gè)視野，全自動(dòng)檢測細(xì)胞內(nèi)DNA的含量變化來判定細(xì)胞是否發(fā)生癌變，采用自主分析系統(tǒng)并使用具體數(shù)據(jù)作為描述腫瘤生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的特點(diǎn)，可發(fā)現(xiàn)先于形態(tài)學(xué)改變的惡性細(xì)胞[13-14]。因此測定其細(xì)胞DNA含量可以作為臨床診斷MPE的客觀依據(jù)之一。

本研究發(fā)現(xiàn)，TCT檢查的靈敏度高于DNA-ICM分析，但特異度低于DNA-ICM分析。TCT在MPE診斷中的靈敏度為79.6%、特異度為 84.8%，DNA-ICM分別為 56.5%、95.1%，靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。雖然相比TCT，DNA-ICM可以提供很多更客觀的診斷信息，但是本研究發(fā)現(xiàn)DNA-ICM也有假陽性和假陰性，推測DNA-ICM出現(xiàn)假陽性的原因可能是少數(shù)炎性胸腔積液中的細(xì)胞可出現(xiàn)退變或核固縮，這些細(xì)胞在Feulgen染色時(shí)，可出現(xiàn)DI≥2.5的異倍體細(xì)胞。這時(shí)需要反復(fù)檢查，并且結(jié)合TCT結(jié)果和免疫組織化學(xué)結(jié)果以鑒別炎性或MPE。DNA-ICM出現(xiàn)假陰性的原因主要是對成團(tuán)的癌細(xì)胞不能識別，MPE中以轉(zhuǎn)移性腺癌最為常見，腺癌細(xì)胞常聚集成團(tuán)，DNA-ICM有時(shí)不能識別而造漏診。

進(jìn)一步研究分析發(fā)現(xiàn)如果TCT與DNA-ICM分析聯(lián)合診斷，靈敏度可提高為 90.0%，特異度變?yōu)?9.5%。實(shí)驗(yàn)表明，與單獨(dú)TCT或DNA-ICM分析相比較，聯(lián)合診斷可明顯提高靈敏度，胸腔積液陽性檢出率明顯增多，但是特異度與單獨(dú)DNA倍體分析有所降低。這一結(jié)果與在宮頸的研究報(bào)道一致[4,15]。另外，在對照組的良性胸腔積液中，TCT診斷11例異型細(xì)胞，18例可疑惡性腫瘤，33例惡性腫瘤，而DNA-ICM結(jié)果只有20例假陽性。而且在TCT診斷的402例炎性胸腔積液中DNA-ICM發(fā)現(xiàn)了29例陽性標(biāo)本。這是因?yàn)榧?xì)胞學(xué)診斷主要依賴細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，TCT制片技術(shù)雖然成熟，但是因?yàn)樾厍环e液不僅成分復(fù)雜，更重要的是正常間皮細(xì)胞在炎癥等各種刺激因素的作用下可出現(xiàn)增生，甚至非典型增生，這些增生與的間皮與轉(zhuǎn)移性癌，特別是高分化癌細(xì)胞在鏡下，從形態(tài)學(xué)上細(xì)胞病理學(xué)醫(yī)師很難鑒別。DNA-ICM通過檢測細(xì)胞DNA含量變化來判定細(xì)胞是否發(fā)生癌變，不會(huì)受細(xì)胞形態(tài)改變的影響，因此聯(lián)合診斷有利于MPE的早期準(zhǔn)確診斷。

綜上所述，DNA-ICM在胸腔積液的診斷中有效彌補(bǔ)了TCT診斷可能引起的漏診和誤診。TCT聯(lián)合DNA-ICM較單純TCT或DNA-ICM在胸腔積液診斷方面具有更好的靈敏度和較高的特異度，可以減少TCT診斷中細(xì)胞病理醫(yī)師的人為因素和DNA-ICM固有缺陷造成的漏診和誤診，進(jìn)一步保證胸腔積液診斷工作的質(zhì)量，有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值。