基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路的艾拉莫德對(duì)白介素1β誘導(dǎo)的大鼠退變軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響研究

彭?xiàng)钴缱?，孔瑞娜，張?zhí)m玲，趙東寶

本研究創(chuàng)新點(diǎn)：

本研究闡明艾拉莫德對(duì)白介素1β誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響，為今后研究艾拉莫德防治骨關(guān)節(jié)炎提供理論依據(jù)。關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的修復(fù)一直是骨關(guān)節(jié)炎疾病研究的熱點(diǎn)，本研究揭示艾拉莫德可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin信號(hào)通路，調(diào)控軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝，修復(fù)軟骨損傷，為艾拉莫德增加抗骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。

骨關(guān)節(jié)炎（OA）是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性變和繼發(fā)骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。軟骨細(xì)胞退變?cè)贠A發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。近年來研究發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路廣泛存在于軟骨細(xì)胞中，表現(xiàn)為異常活化的狀態(tài)，從而影響軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡失衡［1］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt通路中最經(jīng)典的信號(hào)通路，在Wnt/β-catenin信號(hào)通路中起著重要作用的蛋白有Wnt、β-catenin、Axin、Frz、糖原合成酶激酶3β（GSK-3β）及活化蛋白（APC）等。此通路下游基因和蛋白表達(dá)可影響關(guān)節(jié)軟骨生長代謝，在OA發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。艾拉莫德作為一種新的抗炎和免疫調(diào)節(jié)性質(zhì)的小分子藥物，不僅具有抗風(fēng)濕藥物（DMARDs）的免疫調(diào)節(jié)、抑制關(guān)節(jié)破壞功能，前期研究還證實(shí)艾拉莫德可以影響骨代謝［2-3］，但尚未見艾拉莫德作用于軟骨細(xì)胞相關(guān)機(jī)制的研究。本研究基于Wnt/β-catenin信號(hào)通路，從細(xì)胞、分子水平探討艾拉莫德對(duì)白介素1β（IL-1β）誘導(dǎo)的大鼠OA軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 2017年2—12月選取SPF級(jí)雄性2月齡健康Wistar大鼠10只，體質(zhì)量約300 g，由上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑和儀器 RT2 First Strand Kit（QIAGEN）、Anti-β-catenin antibody〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司〕、Anti-GSK-3βantibody〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司〕、Anti-基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-3 antibody〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司〕、Anti-MMP-13 antibody〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司〕、Anti-Ⅱ型膠原antibody〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司〕、Anti-蛋白聚糖antibody〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司〕、Anti-beta actin antibody〔艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司〕、Trizol（美國英杰生命技術(shù)有限公司）、RNeasy mini kit（美國英杰生命技術(shù)有限公司）、Eclipse TE-2000U倒置顯微鏡〔尼康儀器（上海）有限公司〕、Labofuge 4008離心機(jī)〔賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕、二氧化碳培養(yǎng)箱〔賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕、Nanodrop 2000分光光度計(jì)〔賽默飛世爾科技（中國）有限公司〕、9700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）。

1.3 方法

1.3.1 模型制備 將所有大鼠頸部脫臼處死后，取關(guān)節(jié)軟骨組織，在超凈工作臺(tái)內(nèi)以磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗3次，刮取關(guān)節(jié)軟骨層，剪切成約1 mm3碎塊，放入0.25%胰蛋白酶37 ℃消化30 min，0.2%膠原酶37 ℃消化1 h，吸取上清用DMEM沖洗2次，1 500 r/min離心10 min，離心半徑為10 cm，收集軟骨細(xì)胞，以5×105個(gè)/瓶移入DMEM培養(yǎng)瓶（含10%胎牛血清），置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。殘余軟骨顆粒繼續(xù)消化，每1 h收集細(xì)胞1次，直至軟骨組織塊消化完全。將大鼠軟骨細(xì)胞培養(yǎng)至第2代軟骨細(xì)胞，予10 μg/L IL-1β的1%胎牛血清DMEM誘導(dǎo)處理24 h，獲得退變軟骨細(xì)胞模型。采用甲苯胺藍(lán)染色法鑒定軟骨細(xì)胞。

1.3.2 確定藥物濃度 應(yīng)用四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測不同濃度的艾拉莫德、塞來昔布對(duì)大鼠軟骨細(xì)胞活性的影響，從而確定藥物濃度，具體方法參照MTT法試劑盒說明書，選擇對(duì)細(xì)胞無明顯毒性作用的0.3、3.0、30.0 μg/ml濃度梯度進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)，軟骨細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理72 h，最終確定藥物濃度：艾拉莫德濃度梯度為10.0、1.0、0.1 μmol/L，塞來昔布濃度梯度為1.00、0.10、0.01 μmol/L。

1.3.3 干預(yù)及分組 將分離培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞分為12組：空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組、IL-1β組、艾拉莫德A組、艾拉莫德B組、艾拉莫德C組、塞來昔布A組、塞來昔布B組、塞來昔布C組、IL-1β+Dickkopf-1（DKK-1）組、艾拉莫德+DKK-1組、塞來昔布+DKK-1組?？瞻讓?duì)照組不進(jìn)行任何干預(yù)；除空白對(duì)照組外，其他組采用0.1%二甲基亞砜（DMSO）溶劑處理；除空白對(duì)照組、溶劑對(duì)照組外，其他組選用IL-1β誘導(dǎo)的退變軟骨細(xì)胞模型；艾拉莫德A、B、C組分別采用10.0、1.0、0.1 μmol/L艾拉莫德處理；塞來昔布A、B、C組分別采用1.00、0.10、0.01 μmol/L塞來昔布處理；IL-1β+DKK-1組、艾拉莫德+DKK-1組、塞來昔布+DKK-1組均采用100 ng/ml的DKK-1處理；艾拉莫德+DKK-1組采用10.0 μmol/L艾拉莫德處理；塞來昔布+DKK-1組采用1.00 μmol/L塞來昔布處理。

1.3.4 指標(biāo)測定 各組軟骨細(xì)胞干預(yù)24 h后，培養(yǎng)0、12、24、48、72 h時(shí)，分別采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-qPCR）和Western blotting法檢測各組β-catenin、MMP-13、Ⅱ型膠原a1（Col2a1）、GSK-3β mRNA和蛋白表達(dá)水平。

1.3.4.1 mRNA表達(dá)水平測定 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)皿，棄去培養(yǎng)基，用預(yù)冷無菌PBS沖洗2次，采用Trizol法提取RNA，每10 cm平皿加入1 ml Trizol，室溫放置5 min，并輕搖培養(yǎng)皿，用離心管吸取裂解液。用微量移液器吸取0.2 ml氯仿，輕搖混勻，室溫放置5 min，4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm），用移液器吸取水相至新的離心管，重復(fù)上一步驟。加入0.5 ml異丙醇，輕搖混勻，室溫放置10 min，4 ℃離心機(jī)，12 000 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm）后棄上清液，4 ℃預(yù)冷，加入1 ml的75%乙醇溶液〔含焦炭酸二乙酯（DEPC）水〕，7 500 r/min離心15 min（離心半徑為10 cm）后棄上清液，重復(fù)上一步驟。根據(jù)沉淀的量加入20～100 μl的DEPC水融解RNA，-80 ℃保存?zhèn)溆?。采用超微量分光光度?jì)檢測RNA濃度，選擇測量RNA的界面，用DEPC水調(diào)整2次，擦鏡紙擦凈后加樣本3 μl，出現(xiàn)數(shù)值后記錄濃度和A260/A280值。采用凝膠電泳檢測RNA完整性，1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，出現(xiàn)兩條電泳條帶，即18S和28S rRNA，只要18S和28S rRNA帶亮，且28S rRNA大約為18S rRNA的兩倍，說明提取RNA未發(fā)生降解。按照試劑盒說明書合成cDNA，將制備好的cDNA進(jìn)行RT-qPCR，RT-qPCR反應(yīng)引物見表1。采用9700型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件：第一階段95 ℃ 3 min；第二階段95 ℃變性30 s、60 ℃退火34 s、72 ℃延伸60 s，共40個(gè)循環(huán)；第三階段95 ℃15 s、60 ℃ 1 min、95 ℃ 15 s。各mRNA和內(nèi)參分別進(jìn)行RT-qPCR，每個(gè)樣品重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.4.2 蛋白表達(dá)水平測定 采用Western blotting法測定蛋白表達(dá)水平。細(xì)胞消化離心后加入適量含蛋白酶抑制劑混合物的組織裂解液，冰上勻漿直至無可見組織塊，冰上裂解20 min。懸液吸入離心管中，4 ℃離心機(jī)，12 000×g離心15 min，取上清液，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?6孔板中加入不同濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品或按一定倍數(shù)稀釋的樣品10 μl，每個(gè)樣品2個(gè)復(fù)孔，加入混合好的BCA反應(yīng)液（A液:B液=50:1）200 μl，37 ℃孵育30 min。在570 nm波長檢測光密度（OD）值，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)OD值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品蛋白濃度。按照測定的蛋白濃度計(jì)算，取相同質(zhì)量的總蛋白（每次實(shí)驗(yàn)20～50 μg），加入總體積1/5的5×蛋白上樣緩沖液、總體積1/10的10×還原劑（DTT）、裂解液，各體積相等，混合均勻。100 ℃水浴10 min完全變性，冰上冷卻后12 000×g離心15 min，取上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳，以80 V恒壓電泳直至不同大小蛋白分子量分離可見，電壓增加到120 V繼續(xù)電泳直至上樣緩沖液中的染料跑膠時(shí)停止。分離后轉(zhuǎn)膜，浸入轉(zhuǎn)膜緩沖液，以130 mA恒流半干轉(zhuǎn)膜60 min，取出聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，用TBST緩沖液漂洗1次，封閉液震蕩封閉1 h。PVDF膜置于封閉液稀釋的一抗中，4℃孵育過夜，用TBST緩沖液漂洗3次，10 min/次。PVDF膜置于封閉液稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記二抗中，室溫孵育1 h，用TBST緩沖液漂洗3次，10 min/次。PVDF膜吸干多余液體，置于塑封膜上，滴加預(yù)先混合好的ECL發(fā)光底物，使液體覆蓋均勻，蓋上塑封膜，采用GeneGnome化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯示結(jié)果。

表1 RT-qPCR反應(yīng)引物Table 1 RT-qPCR primer sequences

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism 5.0軟件進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 IL-1β+DKK-1組與IL-1β組β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA、Col2a1 mRNA表達(dá)水平比較 IL-1β組12、24、48、72 h的β-catenin mRNA表達(dá)水平高于0 h（見圖1）；MMP-13 mRNA表達(dá)水平12、24、48 h低于0 h，72 h時(shí)高于0 h（見圖2）；Col2a1 mRNA表達(dá)水平12、24、48 h低于0 h，72 h時(shí)高于0 h（見圖3）。IL-1β+DKK-1組12、24、48、72 h的β-catenin mRNA表達(dá)水平均低于IL-1β組（見圖1）；IL-1β+DKK-1組0、12、24、48、72 h的MMP-13 mRNA表達(dá)水平均低于IL-1β組（見圖2）；IL-1β+DKK-1組12、24、48、72 h的Col2a1 mRNA表達(dá)水平均高于IL-1β組（見圖3）。

圖1 IL-1β+DKK-1組與IL-1β組β-catenin mRNA表達(dá)水平Figure 1 Expression level of β-catenin mRNA inchondrocytes in IL-1β+DKK-1 group and IL-1βgroup

圖2 IL-1β+DKK-1組與IL-1β組MMP-13 mRNA表達(dá)水平Figure 2 Expression levelof MMP-13 mRNA inchondrocytes in IL-1β+DKK-1 group and IL-1βgroup

圖3 IL-1β+DKK-1組與IL-1β組Col2a1 mRNA表達(dá)水平Figure 3 Expression level of Col2a1 mRNA inchondrocytes in IL-1β+DKK-1 group and IL-1βgroup

2.2 IL-1β+DKK-1組與IL-1β組β-catenin、MMP-13、Col2a1表達(dá)水平比較 IL-1β組0～48 h的β-catenin表達(dá)水平呈下降趨勢，72 h β-catenin表達(dá)水平高于48 h；12 h的 MMP-13表達(dá)水平高于 0 h，12～72 h的MMP-13表達(dá)水平呈下降趨勢；12 h的Col2a1表達(dá)水平高于0 h，12～72 h的Col2a1表達(dá)水平呈下降趨勢；IL-1β+DKK-1組12、24、48、72 h的β-catenin 表達(dá)水平均低于IL-1β組；12、24、48、72 h的MMP-13表達(dá)水平均低于IL-1β組；12、24、48、72 h的Col2a1表達(dá)水平均高于IL-1β組（見圖4）。

注：Col2a1=Ⅱ型膠原a1

2.3 不同藥物組β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA、Col2a1 mRNA、GSK-3βmRNA表達(dá)水平比較 加入試驗(yàn)藥物艾拉莫德和塞來昔布24 h后，艾拉莫德A組、塞來昔布A組的β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA表達(dá)水平均低于IL-1β組、IL-1β+DKK-1組，Col2a1 mRNA、GSK-3βmRNA表達(dá)水平均高于IL-1β組、IL-1β+DKK-1組。艾拉莫德+DKK-1組的β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA表達(dá)水平均低于艾拉莫德A組，Col2a1 mRNA、GSK-3βmRNA表達(dá)水平高于艾拉莫德A組；塞來昔布+DKK-1組的β-catenin mRNA、MMP-13 mRNA表達(dá)水平低于塞來昔布A組，Col2a1 mRNA、GSK-3βmRNA表達(dá)水平高于塞來昔布A組（見圖 5～8）。

2.4 不同藥物組β-catenin、MMP-13、Col2a1、GSK-3β表達(dá)水平比較 加入艾拉莫德和塞來昔布24 h后，艾拉莫德A組、塞來昔布A組的β-catenin、MMP-13、Col2a1表達(dá)水平均低于IL-1β組、IL-1β+DKK-1組，GSK-3β表達(dá)水平高于IL-1β組、IL-1β+DKK-1組。艾拉莫德+DKK-1組的β-catenin、Col2a1、GSK-3β表達(dá)水平均高于艾拉莫德A組，MMP-13表達(dá)水平低于艾拉莫德A組；塞來昔布+DKK-1組的β-catenin、MMP-13、Col2a1 、GSK-3β表達(dá)水平均高于塞來昔布A組（見圖9）。

3 討論

OA是最常見的關(guān)節(jié)疾病，是成年人致殘的主要原因，在關(guān)節(jié)病變中主要累及關(guān)節(jié)軟骨，逐漸喪失軟骨，并發(fā)生鈣化、骨贅形成、軟骨下骨重塑、滑膜輕中度炎癥。目前的臨床治療藥物多關(guān)注患者疼痛和功能恢復(fù)，而關(guān)于有無改善骨關(guān)節(jié)炎性細(xì)胞學(xué)特征方面研究較少。

目前，《骨關(guān)節(jié)炎診療指南（2018年版）》［4］根據(jù)病情不同程度建議：（1）行為干預(yù)，（2）對(duì)乙酰氨基酚，（3）非甾體消炎藥包括環(huán)氧合酶（COX）-2抑制劑［5］，（4）關(guān)節(jié)內(nèi)注射透明質(zhì)酸或糖皮質(zhì)激素，（5）人工關(guān)節(jié)置換術(shù)。止痛藥物包括阿片類藥物和中樞作用藥物如鹽酸度洛西汀，但存在不良反應(yīng)。

由于目前的治療手段普遍療效較差，未能滿足目前的醫(yī)療需求，因此，臨床上迫切需要靶點(diǎn)明確、療效顯著的治療藥物［6］。盡管促炎因子如IL-1β在體外可以模仿建立OA細(xì)胞模型，但抗細(xì)胞因子療法并未被證實(shí)能有效治療OA［7-8］。動(dòng)物和細(xì)胞水平研究表明阻斷MMP-13的表達(dá)能減輕軟骨侵蝕［9-10］，然而，直接抑制MMP等組織分解酶或信號(hào)通路的治療可能有效，但存在不可預(yù)知的不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用受到限制［1，11］。

注：DMSO=二甲基亞砜

圖6 不同藥物組MMP-13 mRNA表達(dá)水平比較Figure 6 Expression levels of MMP-13 mRNA in chondrocytes in different groups after drug intervention

圖7 不同藥物組Col2a1 mRNA表達(dá)水平比較Figure 7 Expression levels of Col2a1 mRNA in chondrocytes in different groups after drug intervention

圖8 不同藥物組GSK-3βmRNA表達(dá)水平比較Figure 8 Expression levels of GSK-3βmRNA in chondrocytes in different groups after drug intervention

圖9 不同藥物組β-catenin、MMP-13、Col2a1、GSK-3β的表達(dá)Figure 9 Expression levels of β-catenin，MMP-13，Col2a1 and GSK-3βproteins in chondrocytes in different groups after drug intervention

Wnt/β-catenin信號(hào)通路在軟骨和骨的發(fā)育和病理學(xué)中扮演重要角色。研究顯示W(wǎng)nt拮抗劑DKK-1和分泌型卷曲相關(guān)蛋白1（SFRP1）可以緩解關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞肥大［2-3］，全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了獨(dú)特多態(tài)性編碼SFRP1的FRZB基因與髖關(guān)節(jié)炎有關(guān)，可能通過抑制MMP，抑制血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，從而對(duì)OA軟骨細(xì)胞產(chǎn)生一定的保護(hù)作用［12］。

骨硬化蛋白同樣作為Wnt拮抗劑，最初確定為骨細(xì)胞特異性，目前發(fā)現(xiàn)在軟骨和軟骨組織中低水平表達(dá)。在OA患者和/或動(dòng)物模型中，骨硬化蛋白作為抑制劑，可減少骨贅形成［13-14］，但其也能導(dǎo)致半月板撕裂［15］。這些結(jié)果與Wnt配體在不同的組織中表達(dá)不一致有關(guān)［16］，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路誘導(dǎo)或促進(jìn)的Wnt3a/WISP1開關(guān)信號(hào)參與了轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）/活化素受體樣激酶1（ALK1）、Smad1/5/8［17］和機(jī)械負(fù)荷介導(dǎo)的骨硬化蛋白抑制［18］。此外，氯化鋰可通過抑制GSK-3β使得β-catenin在胞內(nèi)積聚，從而抑制手術(shù)引起的OA。

本研究結(jié)果提示IL-1β可以增強(qiáng)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)，增加細(xì)胞基質(zhì)合成和分解代謝能力。而DKK-1通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路減弱IL-1β對(duì)大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞基質(zhì)代謝的作用；大劑量艾拉莫德（10.0 μmol/L）和大劑量塞來昔布（1.00 μmol/L）均可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的大鼠退變軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的表達(dá)，增加軟骨細(xì)胞基質(zhì)合成代謝，抑制軟骨細(xì)胞分解代謝能力。而且這一作用在Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制后仍存在，提示艾拉莫德和塞來昔布對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠退變軟骨細(xì)胞影響還存在其他作用機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

本研究驗(yàn)證了IL-1β可誘導(dǎo)激活大鼠退變軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路，加重軟骨細(xì)胞損傷；Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制劑DKK-1阻斷了這一作用；藥物艾拉莫德、塞來昔布通過阻斷Wnt/β-catenin信號(hào)通路，部分修復(fù)了軟骨細(xì)胞合成和分解代謝功能，發(fā)揮了DKK-1類似的作用。軟骨細(xì)胞退變過程主要反映了軟骨細(xì)胞增殖和凋亡比例失衡，導(dǎo)致軟骨組織損失難以恢復(fù)；所以還需要完善軟骨細(xì)胞的增殖和凋亡能力檢測，其不僅能體現(xiàn)軟骨細(xì)胞損傷的嚴(yán)重程度，還可以驗(yàn)證藥物對(duì)軟骨細(xì)胞最終影響。本研究闡明了艾拉莫德對(duì)軟骨細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的調(diào)控作用，為今后研究艾拉莫德調(diào)節(jié)骨代謝作用開辟一條新途徑。

作者貢獻(xiàn)：孔瑞娜進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，研究的實(shí)施與可行性分析，數(shù)據(jù)收集；彭?xiàng)钴缱舆M(jìn)行數(shù)據(jù)整理，結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文，論文的修訂；張?zhí)m玲、趙東寶負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對(duì)文章整體負(fù)責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。