糖尿病足潰瘍患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白晚期糖化終末產(chǎn)物蓄積研究

劉傳波，楊建飛，陸樹良

糖尿病狀態(tài)下，機體內(nèi)膠原蛋白與葡萄糖等代謝分子間發(fā)生非酶促化學(xué)反應(yīng)，生成晚期糖化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）［1-2］，AGEs是長期甚至數(shù)年內(nèi)的糖化和氧化應(yīng)激“代謝記憶”的載體［3］，可預(yù)測數(shù)十年后糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生［4］。故評估皮膚膠原上AGEs蓄積程度對判斷糖尿病代謝控制及預(yù)測糖尿病并發(fā)癥具有重要作用。目前臨床上可使用AGE ReaderTM儀器無創(chuàng)檢測患者前臂皮膚獲得皮膚自體熒光（skin autofluorescence，SAF）值［5］，反映皮膚組織中蓄積的各種AGEs總含量。本研究擬通過免疫熒光雙標法對糖尿病足潰瘍患者和非糖尿病患者兩組人群皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積進行比較，同時分析兩組患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度與反映皮膚組織中AGEs總含量的SAF值之間的相關(guān)性。

本研究創(chuàng)新點：

本研究通過免疫熒光雙標法對糖尿病足潰瘍和非糖尿病患者皮膚中Ⅰ型膠原蛋白及晚期糖化終末產(chǎn)物（AGEs）熒光強度進行比較，同時用AGE Reader無創(chuàng)檢測患者上臂皮膚自體熒光（SAF）值，以期比較兩者皮膚膠原蛋白AGEs蓄積程度的差異，同時，分析Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度與SAF值的相關(guān)性。結(jié)果表明，糖尿病足潰瘍患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積明顯增加，SAF值明顯升高，而且，皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度與SAF值呈正相關(guān)，提示無創(chuàng)檢測的SAF或許可作為評估局部皮膚AGEs蓄積程度的簡單方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2014年6—8月上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬上海市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院脈管科住院治療的糖尿病足潰瘍患者11例為糖尿病足潰瘍組，同期上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院燒傷科住院治療的小面積燒傷的非糖尿病患者8例為非糖尿病組。所有患者告知研究目的及方法，取得同意后簽署知情同意書。

1.2 主要儀器 Nikon光學(xué)顯微鏡YS100（日本 Nikon），Zeiss熒 光 顯 微 鏡 Axioskop 2 plus（ 德國 Zeiss），Leica組 織 切 片 儀 CM3050 S（ 德 國Leica），-80 ℃Thermo超低溫冰箱Forma -86C ULT Freezer（美國Thermo），數(shù)字式pH測量計inolab pH（德國WTW）。

1.3 主要試劑 小鼠源性抗Ⅰ型膠原蛋白單克隆抗體（英國Abcam），兔源性抗AGEs多克隆抗體（英國Abcam），Alexa Fluor? 488結(jié)合的抗鼠二抗（美國Cell Signaling Technology），Alexa Fluor? 555結(jié)合的抗兔二抗（美國 Cell Signaling Technology），含 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染核的抗熒光防淬滅劑（英國Abcam），OCT冷凍切片包埋劑（美國SAKURA），TritonX-100（碧云天生物技術(shù)研究所），牛血清清蛋白（BSA）（美國Sigma-Aldrich）。

1.4 方法 使用手術(shù)刀于患者下肢創(chuàng)口邊緣0.5 cm或供皮區(qū)切取全層皮膚組織，去除皮下脂肪組織后作皮膚標本，每個皮膚標本切為若干小塊，面積為0.5 cm×0.5 cm，分為兩組，一組用4%多聚甲醛溶液固定，制作組織切片后用于光鏡下組織學(xué)觀察；另一組置于液氮中凍存，轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存，制作為冷凍切片后用于免疫熒光檢測。

1.4.1 皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察 標本切片后，常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡下觀察兩組患者皮膚組織形態(tài)學(xué)特征。

1.4.2 皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度 采用免疫熒光雙標法，分別以綠色熒光及紅色熒光密度表示Ⅰ型膠原蛋白及AGEs含量；以熒光共表達（橙黃色）的光密度總和來衡量Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度。過程：磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌切片，采用4%多聚甲醛溶液固定；經(jīng)0.5% Triton X-100處理后，用5% BSA封閉；加小鼠源性抗Ⅰ型膠原蛋白一抗和兔源性抗AGEs一抗，37 ℃孵育1 h；加Alexa Fluor?488結(jié)合的抗鼠二抗和Alexa Fluor?555結(jié)合的抗兔二抗，37 ℃孵育1 h；加入含DAPI染核的抗熒光防淬滅劑，封固，熒光顯微鏡下觀察比較兩組皮膚組織上Ⅰ型膠原蛋白、AGEs及兩者共表達的熒光強度。然后，使用Image J軟件對熒光顯微鏡下的熒光光密度進行半定量分析，以Ⅰ型膠原蛋白與AGEs免疫熒光共表達（橙黃色）的光密度總和（200倍熒光顯微鏡下）表示Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度。

1.4.3 SAF值檢測 患者將前臂置于AGE ReaderTM儀器上，發(fā)射光垂直照射在前臂正常皮膚上，經(jīng)皮膚反射后獲得激發(fā)光，配套軟件自動測量發(fā)射光與激發(fā)光強度，進行計算并輸出獲得兩者比值即SAF值［6］，其單位為任意單位（arbitrary unit，AU）。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，應(yīng)用Image J進行免疫熒光圖片光密度總和分析，使用GraphPad Prism 5進行統(tǒng)計圖像制作。計數(shù)資料比較采用Fisher's確切概率法；計量資料以（s）表示，兩組間比較采用Student'st檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson直線相關(guān)分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 非糖尿病組與糖尿病足潰瘍組患者一般資料比較非糖尿病組與糖尿病足潰瘍組患者性別、年齡比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。糖尿病足潰瘍組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白水平高于非糖尿病組患者，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表1）。

2.2 非糖尿病組與糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織形態(tài)學(xué)觀察 光鏡下觀察非糖尿病組患者皮膚結(jié)構(gòu)清晰完整，表皮層細胞層次清晰，呈復(fù)層排列，真皮層膠原纖維含量豐富，纖維束交錯排列，呈編織狀，炎性細胞散在分布，數(shù)量較少（見圖1）；糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織萎縮變薄，表皮層細胞層次欠清晰，部分表皮層缺乏復(fù)層排列，真皮層膠原纖維萎縮、纖細，排列稀疏、松散雜亂，部分膠原纖維斷裂、變性，炎性細胞浸潤呈彌散分布，數(shù)量明顯增多（見圖2）。

2.3 非糖尿病組與糖尿病足潰瘍組患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度比較 熒光顯微鏡下，非糖尿病組患者皮膚組織膠原纖維粗大，含量豐富，呈交錯排列，而糖尿病足潰瘍組患者皮膚膠原纖維萎縮，稀疏、纖細，排列松散雜亂，進一步驗證了光鏡下兩組患者皮膚組織HE染色的形態(tài)學(xué)差異（見圖3A、4A）。

表1 非糖尿病組與糖尿病足潰瘍組患者一般資料比較Table 1 Comparison of clinical characteristics between patients with diabetic foot ulcers and those without diabetes

圖1 非糖尿病組患者皮膚組織形態(tài)學(xué)（HE染色，×100）Figure 1 Histomorphological characteristics of the skin section from patients without diabetes

圖2 糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織形態(tài)學(xué)（HE染色，×100）Figure 2 Histomorphological characteristics of the skin section from patients with diabetic foot ulcers

與非糖尿病組患者相比，糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織中代表Ⅰ型膠原蛋白含量的綠色熒光光密度未見明顯下降（圖3A、4A），而糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織中代表AGEs含量的紅色熒光光密度卻升高（見圖3B、4B）。

對同一部位表達的綠色熒光和紅色熒光進行擬合，兩組圖片中均出現(xiàn)橙黃色的雙重?zé)晒鈽擞?，表示存在Ⅰ型膠原蛋白與AGEs的共定位。與非糖尿病組患者相比，糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織標本中雙重標記的橙黃色熒光明顯增多（見圖3D、4D）。

糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織免疫熒光共表達（橙黃色）光密度總和高于非糖尿病組患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義〔（10 900±2 973）與（6 910±1 048），t=4.06，P＜0.05〕。

2.4 非糖尿病組與糖尿病足潰瘍組患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度與SAF值相關(guān)性 糖尿病足潰瘍組患者SAF值為（2.68±0.22）AU，非糖尿病組患者為（2.18±0.27）AU，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.47，P＜0.05）。

相關(guān)性分析顯示，糖尿病足潰瘍組患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度與SAF值呈正相關(guān)（r=0.65，P＜0.05，見圖5）；非糖尿病組患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度與SAF值呈正相關(guān)（r=0.76，P＜0.05，見圖6）。

注：SAF=自體熒光

圖6 非糖尿病組患者患者免疫熒光共表達光密度總和與SAF值相關(guān)性分析散點圖Figure 6 The scatter plot for correlation analysis between total fluorescence intensity and SAF in patients without diabetes

圖3 非糖尿病組患者皮膚組織免疫熒光雙標（×200）Figure 3 Level of AGEs accumulated on the skin section from patients without diabetes detected with double immunofluorescence technique

圖4 糖尿病足潰瘍組患者皮膚組織免疫熒光雙標（×200）Figure 4 Level of AGEs accumulated on the skin section from patients with diabetic foot ulcers detected with double immunofluorescence technique

3 討論

機體內(nèi)含賴氨酸和精氨酸的蛋白質(zhì)均可發(fā)生糖化，蛋白質(zhì)的氨基酸側(cè)鏈與葡萄糖的醛基經(jīng)非酶促化學(xué)反應(yīng)生成早期糖化產(chǎn)物，在氧化作用下最終生成各種不同類型的AGEs，如羧甲基賴氨酸、羧乙基賴氨酸、戊糖素等［2，7］。由于皮膚組織真皮細胞外基質(zhì)中的膠原蛋白［8-10］、彈力蛋白［8-9］、纖維黏連蛋白［8］等t1/2長達數(shù)年，可逆轉(zhuǎn)性低，更容易與葡萄糖等代謝分子發(fā)生非酶促反應(yīng)生成AGEs，對組織產(chǎn)生一系列不良影響［1，10］，在糖尿病并發(fā)癥的病理生理機制中起著重要作用［11］。

本研究表明，與非糖尿病患者相比，糖尿病足潰瘍患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度明顯升高。糖尿病足潰瘍患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs的過多蓄積對血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞及平滑肌細胞等組織修復(fù)細胞產(chǎn)生毒性作用，導(dǎo)致細胞周期紊亂、誘導(dǎo)細胞凋亡和壞死、減少細胞外基質(zhì)合成；同時，AGEs誘導(dǎo)中性粒細胞、巨噬細胞等炎性細胞聚集，并引起氧化應(yīng)激等一系列反應(yīng)，使皮膚組織處于炎性細胞浸潤、氧化損傷及分解代謝過強的微環(huán)境中［12］，糖尿病足潰瘍患者皮膚損傷后組織修復(fù)能力下降，創(chuàng)面愈合能力減緩。而且，膠原蛋白壽命較長，可達10年［10］，其與葡萄糖等分子產(chǎn)生交聯(lián)生成AGEs后，使得膠原蛋白降解更加困難［13］，故蓄積在膠原蛋白上的AGEs對組織產(chǎn)生持續(xù)損害作用。長壽命膠原蛋白上AGEs的蓄積受短期內(nèi)血糖波動的影響較小，即使血糖、糖化血紅蛋白等代謝指標控制良好，糖尿病皮膚“隱形損害”仍持續(xù)存在［14］，在內(nèi)源性或外源性等因素作用下，易發(fā)生皮膚組織破潰。提示，在糖尿病及糖尿病足潰瘍患者的診療過程中，不僅要加強血糖、血脂等整體代謝水平的控制，還應(yīng)該重視皮膚組織的局部護理和治療，防止皮膚破潰，對已形成的潰瘍及時采取相關(guān)的局部創(chuàng)面治療方案，防止再次復(fù)發(fā)。動物實驗證明，氨基胍［15］、吡哆胺［16-17］等AGEs形成抑制劑以及噻唑類衍生物ALT-711［18］等AGEs交聯(lián)裂解劑均可使膠原蛋白上交聯(lián)和蓄積的AGEs減少，提示AGEs抑制劑或裂解劑對糖尿病足潰瘍患者局部創(chuàng)面治療具有潛在的應(yīng)用價值。

糖尿病足潰瘍患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積增多，不僅影響潰瘍局部創(chuàng)面的愈合和復(fù)發(fā)；而且，由于皮膚膠原蛋白等長壽命組織上AGEs的蓄積程度反映了長期血糖及氧化應(yīng)激等代謝控制水平［3］，故與非糖尿病患者相比，糖尿病足潰瘍患者機體整體代謝控制情況均較差，糖尿病血管并發(fā)癥發(fā)生率也較高［19］；因而，評估皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度可預(yù)測糖尿病血管并發(fā)癥及足潰瘍的發(fā)生。但由于測量方法復(fù)雜、醫(yī)學(xué)倫理制約，限制了取組織標本活檢進行皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs定量分析在臨床上的應(yīng)用。目前，利用皮膚組織中的戊糖苷等某些AGEs具有自發(fā)熒光特性，研制并投入臨床應(yīng)用的AGE ReaderTM可無創(chuàng)檢測前臂皮膚而自動獲得SAF值［20］。由于前臂SAF值與同一部位皮膚組織標本取活檢進行定量分析得到的各種AGEs（熒光性和非熒光性）含量均具有相關(guān)性［5，20］，故前臂SAF值能反映人體皮膚組織中蓄積在膠原、血管等組織上的各種AGEs總含量。與其他研究結(jié)論一致［5，20］，本研究證實糖尿病足潰瘍患者及非糖尿病患者中，皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度均與SAF值具有相關(guān)性，提示AGE ReaderTM無創(chuàng)檢測獲得的SAF值或可作為臨床上評估皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度的簡單方法，能反映糖尿病足潰瘍患者較長時期內(nèi)的代謝控制情況，提醒高危并發(fā)癥患者及時采取進一步診療方案。

本研究仍存在一些不足：首先，由于受條件限制，本研究未應(yīng)用氣/液相層析-質(zhì)譜等進行Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度的精確定量分析，而是采用Ⅰ型膠原蛋白和AGEs免疫熒光雙標共表達的光密度總和來表示Ⅰ型膠原蛋白AGES蓄積程度。由于膠原蛋白氨基酸側(cè)鏈基團通過糖氧化反應(yīng)與部分糖基團共價結(jié)合，可能干擾抗體與膠原蛋白上特定位點的結(jié)合，對免疫熒光密度的半定量分析產(chǎn)生影響。此外，本研究中兩組患者病例數(shù)量較少，可能影響統(tǒng)計效力。

綜上所述，本研究表明，糖尿病足潰瘍患者皮膚Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度明顯升高，提示糖尿病足潰瘍患者皮膚易發(fā)生局部破潰，而且皮膚破潰后創(chuàng)面愈合能力差，愈合后潰瘍復(fù)發(fā)率高，還表明機體整體代謝控制水平較差；并且由于Ⅰ型膠原蛋白AGEs蓄積程度與SAF值具有相關(guān)性，提示SAF值的無創(chuàng)檢測或許可作為評估糖尿病患者局部皮膚組織和機體整體代謝控制的簡單方法。為使本研究結(jié)論更具有說服力、適用人群更廣泛，需進一步改進Ⅰ型膠原帶白AGEs蓄積程度分析方法，進行大樣本、多中心的研究。

作者貢獻：劉傳波、陸樹良進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，研究的實施與可行性分析；劉傳波、楊建飛進行數(shù)據(jù)收集、整理，統(tǒng)計學(xué)處理；劉傳波進行結(jié)果的分析與解釋，撰寫論文；陸樹良進行論文的修訂，負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。