補陽還五湯聯(lián)合BMSCs移植對脊髓損傷氣虛血瘀證紅核神經元的影響

周彬 范瑜潔 聶穎 夏帥帥 張偉 李亮

〔摘要〕 目的 探討補陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）聯(lián)合骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）移植對保護脊髓損傷（sipnal cord injury， SCI）氣虛血瘀證紅核神經元是否能產生協(xié)同增效作用。方法 將30只雄性SD大鼠隨機分為5組：正常組、氣虛血瘀組、BYHWD組、BMSCs組、BYHWD+BMSCs組，每組6只。采用游泳力竭法聯(lián)合紅核脊髓束（rubrospinal tract， RST）橫斷手術制備氣虛血瘀證大鼠模型，并予以相應干預。通過斜板實驗觀察運動功能恢復情況，尼氏染色觀察紅核神經元胞體形態(tài)及數(shù)量，在RST橫斷點上方注射熒光金（FG）進行神經束路示蹤，觀察紅核神經元胞體形態(tài)及數(shù)量。結果 術后14 d、28 d，BYHWD+BMSCs組斜板實驗評分高于氣虛血瘀組、BYHWD組及BMSCs組（P<0.05或P<0.01）。尼氏染色顯示與正常組相比，氣虛血瘀組尼氏體體積及數(shù)量減少，胞漿染色較淺;BYHWD組、BYHWD+BMSCs組的情況優(yōu)于氣虛血瘀組，尤其是BYHWD+BMSCs組。FG逆行示蹤顯示氣虛血瘀組胞體熒光強度減弱、形態(tài)不規(guī)則、邊緣模糊不清，且紅核正常神經元數(shù)目較正常組明顯減少（P<0.01），BYHWD 組、BMSCs組、BYHWD+BMSCs組較模型組增加（P<0.01），特別是BYHWD+BMSCs組（P<0.01）。結論 BYHWD聯(lián)合BMSCs移植對保護SCI氣虛血瘀證逆行性潰變的紅核神經元能產生協(xié)同增效作用。

〔關鍵詞〕 補陽還五湯;骨髓間充質干細胞;脊髓損傷;氣虛血瘀證;紅核脊髓束

〔中圖分類號〕R285.5 ? ? ? 〔文獻標志碼〕A ? ? ? 〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.05.002

〔Abstract〕 Objective To observe whether Buyang Huanwu Decoction （BYHWD） combined with bone marrow mesenchymal stem cells （BMSCs） transplantation could be cooperative remarkably for protection to red nucleus neurons in spinal cord injury （SCI） with Qi-deficiency and blood-stasis syndrome. Methods Totally 30 male rats were randomly divided into the following 5 groups： a normal group， a Qi-deficiency and blood-stasis group， a BYHWD group， a BMSCs group， a BYHWD+BMSCs group， with 6 rats in each group. The rat model of Qi-deficiency and blood-stasis syndrome was established by swimming exhaustion combined with the transection of rubrospinal tract （RST）， and giving corresponding intervenes. The recovery of motor function was observed by inclined plate test， and the morphology and number of red nucleus neurons were observed by Nissl staining. The nerve tract was traced by injection of fluorescent gold （FG） above the RST transection point， and the morphology and number of red nucleus neurons were observed. Results At 14 d and 28 d after operation， the oblique plate test scores of the BYHWD + BMSCs group were higher than those of the Qi-deficiency and blood-stasis group， the BYHWD group and the BMSCs group （P<0.05 or P<0.01）. Compared with the normal group， Nissl staining showed that the volume and quantity of Nissl body in the Qi-deficiency and blood-stasis group was decreased， and the cytoplasmic staining was shallow; the situation of the BYHWD group and the BYHWD + BMSCs group was better than that of the Qi-deficiency and blood-stasis group， especially the BYHWD + BMSCs group. FG retrograde tracing showed that the fluorescence intensity was weakened， the shape was irregular and the edge was blurred in the the Qi-deficiency and blood-stasis group， and the number of normal neurons in the red nucleus was significantly decreased compared with the normal group （P<0.01）， while the number of normal neurons in the BYHWD group， the BMSCs group and the BYHWD+BMSCs group was increased compared with the model group （P<0.01）， especially in the BYHWD + BMSCs group （P<0.01）. Conclusions BYHWD combined with BMSCs transplantation can cooperate remarkably to protect red nucleus neurons in retrograde degeneration of SCI with Qi-deficiency and blood-stasis syndrome.

〔Keywords〕 Buyang Huanwu Decoction; bone marrow mesenchymal stem cells; spinal cord injury; Qi-deficiency and blood-stasis syndrome; red nucleus spinal tract

脊髓損傷（spinal cord injury， SCI）后受損軸突可通過繼發(fā)逆行性潰變導致神經元胞體發(fā)生死亡與萎縮，因此挽救神經元胞體，維持其正常生理功能，是軸突修復與再生的前提[1]。歷代醫(yī)家認為補陽還五湯（Buyang Huanwu Decoction， BYHWD）可以用來治療偏癱、截癱或肢體痿軟等癥，中醫(yī)學認為SCI屬于督脈受損，瘀血阻絡，加之患者元氣大傷且久臥傷氣，多見氣虛血瘀之證[2]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)[3-4]，BYHWD不僅提高了SCI大鼠軸突橫斷后紅核神經元的存活率，還明顯降低氣虛血瘀型SCI大鼠脊髓冠狀切片傷側面積比率。有研究發(fā)現(xiàn)，骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells， BMSCs）分化成神經元樣細胞后，通過分泌相關因子等改善中樞神經受損區(qū)域的微環(huán)境，促進SCI修復[5]。那么BYHWD聯(lián)合BMSCs移植對氣虛血瘀型SCI大鼠紅核神經元能否發(fā)生協(xié)同效應，發(fā)揮神經保護作用？因此，首先建立SCI氣虛血瘀證大鼠的病證結合模型，在此基礎上，采用行為學檢測、神經示蹤、尼氏染色方法觀察BYHWD聯(lián)合BMSCs移植對SCI氣虛血瘀證紅核神經元的保護能否產生協(xié)同增效作用。

1 材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?動物 ?成年雄性健康Sprague-Dawley大鼠30只，體質量200～220 g（合格證編號：43004700014842），由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供（許可證編號：SYXK[湘]2013-0005），自由飲食進水，分籠喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25 ℃，相對濕度50%～70%。

1.1.2 ?藥物及細胞 ?BYHWD（《醫(yī)林改錯》）處方：黃芪120 g，當歸尾9 g，赤芍4.5 g，川芎3 g，地龍3 g，桃仁3 g，紅花3 g[6]。中藥飲片購于老百姓大藥房連鎖股份有限公司，加水回流提取2次，第一次加10倍水提取2 h，第二次加8倍水提取1.5 h，藥液過濾、合并濃縮成每克浸膏含生藥2 g，蒸餾水溶解成濃度1 g/mL，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩MSCs購于湖南省長沙市盈潤生物技術有限公司（YRBio PC059），細胞濃度為1×106/mL。

1.1.3 ?主要試劑及儀器 ?DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司），BrdU（美國SIGMA公司），熒光金（Fluoro-Gold，美國Fluorochrome公司），ECL發(fā)光試劑盒（美國Pierce公司），BX43型雙目生物攝像顯微鏡（日本OLYMPUS）。

1.2 ?方法

1.2.1 ?SCI氣虛血瘀證復合動物模型造模 ?氣虛血瘀證負荷動物造模參考文獻[4]，采用“游泳力竭法”，力竭指征為游泳動作失調、水淹沒鼻尖、身體下沉超過10 s不能浮出水面。剛從水中撈出的大鼠呈疲憊無力狀，表現(xiàn)為目微閉，以后肢撐地慢慢抬起前肢以立身，大喘，搖晃甚至后倒，多不動或挪步蹣跚，無力抵抗、一觸即倒，時間持續(xù)21 d。21 d在脊髓頸椎C3-C4之間橫斷右側紅核脊髓束（rubrospinal tract， RST），建立局部“血瘀”狀態(tài)。動物蘇醒后右側前肢屈曲，緊貼軀干，運動不協(xié)調，右前爪不能張開，表明造模成功。

1.2.2 ?動物分組及干預 ?將造模成功的24只大鼠隨機分為4組：氣虛血瘀組、BYHWD組、BMSCs組、BYHWD+BMSCs組，每組6只。另取6只正常大鼠為對照。BYHWD組、BYHWD+BMSCs組以BYHWD 1 mL灌胃，1次/d，連續(xù)28 d，其余各組均以等容量生理鹽水灌胃。BMSCs組和BYHWD+BMSCs組在造模2 d后在脊髓損傷點注射10 μL被BrdU標記的BMSCs，其余3組在相同的部位注射等容量的生理鹽水。藥物干預28 d處死所有動物。

1.2.3 ?肢體行為學檢測 ?以RST橫斷術前、術后1 d、14 d、28 d觀察大鼠前肢功能恢復情況。運用改良的Rivlin和Tator法，行斜板實驗[7]。具體方法是將大鼠身體軸線垂直與斜板縱軸放置，檢測停留時間，5 s后增加斜板角度，每次升高5°，以大鼠能夠停留5 s的最大角度為其對應的功能值。每只大鼠測量3次，記錄分數(shù)最高者。

1.2.4 ?動物處理與軸突逆行示蹤 ?藥物干預25 d，每組大鼠麻醉，用微量注射器將0.5 μL特異性軸突示蹤劑2%熒光金（FG）緩慢注入RST橫斷點上方1 mm處，進行RST軸突逆行示蹤。存活3 d后將動物再次麻醉，心臟灌注固定，取腦，去首尾兩端，保留中腦和腦橋部分，4 ℃下再用4%多聚甲醛固定2 h，依次使用10%、20%、30%蔗糖梯度浸泡沉底。做連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm，倒置熒光顯微鏡下觀察紅核神經元形態(tài)，100×鏡下用圖像分析系統(tǒng)計數(shù)被FG標記紅核陽性神經元的個數(shù)。熒光淬滅后繼續(xù)將切片用于尼氏染色。

1.2.5 ?尼氏染色 ?上述切片分別用氯仿1 min、90%酒精l min、70%酒精1 min、自來水洗2 min，10%硫堇染色10 min、自來水洗3 min，85%乙醇脫水20 s、90%乙醇30 s、95%乙醇1 min×2、100%乙醇2 min×2、二甲苯2 min×2，中性樹膠封片。顯微鏡下觀察紅核神經元的形狀，400×鏡下計數(shù)每個視野神經元數(shù)目。

1.2.6 ?統(tǒng)計學處理 ?使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗結果以“x±s”表示，采用One-Way ANOVA。所有數(shù)據(jù)均進行正態(tài)性、方差齊性檢驗，方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett T3。不滿足正態(tài)檢驗則使用秩和檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ?動物一般情況

氣虛血瘀組、BYHWD組、BMSCs組、BYHWD+BMSCs組造模后大鼠出現(xiàn)體質量減輕、攝食量減少，毛發(fā)暗淡，倦怠嗜睡，口唇、爪甲顏色淺淡，雙目無神，喜欠伸等。伴發(fā)右側前肢屈曲，緊貼軀干，運動不協(xié)調，右前爪不能張開，說明SCI氣虛血瘀證造模成功。在造模及干預過程中無動物死亡。

2.2 ?斜板實驗結果比較

RST術后1 d，與正常組相比，其它4組評分大幅下降（P<0.01）。術后14 d、28 d，BYHWD+BMSCs組評分高于氣虛血瘀組、BYHWD組、BMSCs組（P<0.05或P<0.01）。見表1。

2.3 ?FG標記的紅核神經元比較

FG的注射區(qū)為RST橫斷點上方，注射3 d后觀察中腦紅核FG標記神經元，陽性標記神經元在熒光顯微鏡下通過紫外激發(fā)呈藍白色光。正常組紅核處可見大量FG標記的陽性神經元，神經元形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，胞體飽滿，突起明顯;氣虛血瘀組紅核僅見少量的陽性神經元，熒光強度減弱，且細胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣模糊不清，胞體萎縮甚至變性，突起不清晰，與正常組相比有統(tǒng)計學意義（P<0.01）;BYHWD組、BMSCs組、BYHWD+BMSCs組陽性神經元較氣虛血瘀組增多（P<0.01），但前兩組低于正常組（P<0.01）;BYHWD組、BMSCs組陽性神經元數(shù)明顯低于BYHWD+BMSCs組（P<0.01）。見表2，圖1。

2.4 ?中腦紅核尼氏染色比較

正常組可見中腦紅核區(qū)細胞密集，細胞形態(tài)正常，胞體和突起輪廓清晰，尼氏體較大而多，胞漿染色深，著色均一，呈現(xiàn)虎斑樣;氣虛血瘀組細胞密度稀疏，細胞皺縮明顯，部分細胞胞漿空泡樣改變，尼氏體模糊，胞漿染色淺;BYHWD組、BMSCs組、BYHWD+BMSCs組細胞較氣虛血瘀組密集，許多細胞均有明顯的突起，偶見細胞皺縮，尼氏體體積及數(shù)量減少，胞漿染色較淺，而BYHWD+BMSCs組優(yōu)于BYHWD組、BMSCs組。氣虛血瘀組紅核神經元數(shù)目低于正常組（P<0.01）。BYHWD、BYHWD+BMSCs組紅核神經元數(shù)目增多，與氣虛血瘀組相比較有統(tǒng)計學意義（P<0.01），但仍低于正常組（P<0.01），BYHWD+BMSCs組紅核神經元數(shù)量高于BMSCs組（P<0.01）。見表2，圖2。

3 討論

大鼠RST起自中腦紅核，RST纖維交叉到對側，脊髓外側索后部下行，投射到V-Ⅶ板層的中間神經元，負責支配前肢的精細運動[8]。因RST束路清晰，造模簡便易行，創(chuàng)傷小，故RST橫斷模型常用于SCI修復的研究。本研究在病證結合的研究指導思想下，首先以氣虛為切入點，根據(jù)中醫(yī)學“勞則氣耗”理論，采用“游泳力竭法”，通過強迫游泳使大鼠達到力竭程度，持續(xù)力竭導致氣虛，久之“因虛致瘀”達到全身性氣虛血瘀狀態(tài)[9];隨后聯(lián)合RST橫斷手術損傷脊髓局部，造成明確的局部血瘀狀態(tài)，成功復制了SCI氣虛血瘀證復合模型。

研究發(fā)現(xiàn)，SCI后軸突的再生情況并不樂觀，因為軸突的損傷可能通過逆行性潰變，導致遠處的神經元胞體發(fā)生死亡與萎縮[10]。我們前期研究已證實黃芪注射液可改善軸漿運輸能力，提高胞體的存活率，對逆行潰變的紅核神經元具有保護作用[11]; BYHWD拮抗SCI大鼠運動區(qū)皮質神經元凋亡改善SCI 大鼠后肢運動作用[12]。目前BMSCs移植成為治療SCI的理想選擇，但移植的BMSCs活力低，在體內不容易存活、增殖和分化。故本研究運用BYHWD+BMSCs對氣虛血瘀型SCI大鼠進行干預，發(fā)現(xiàn)斜板實驗評分明顯高于氣虛血瘀組、BYHWD組、BMSCs組，證明BYHWD+BMSCs可以改善其運動功能。

Li C等[13]認為有足夠數(shù)量的神經元存活，是SCI后軸突修復的先決條件，因為軸突再生所需的物質只能在神經元胞體內合成，一旦神經元胞體死亡，軸突就難以再生，即神經元胞體存活越多，軸突再生的希望也就越大[14]。本實驗中通過FG逆行示蹤標記神經元及尼氏染色反映神經元胞體恢復情況。FG是一種特異性軸突逆行示蹤劑，當被注射到軸突周圍后，可被軸突緩慢攝取，通過軸漿運輸逐漸流向胞體，因而可以在胞體檢測到FG的存在。實驗結果顯示，正常組可見大量FG標記的紅核陽性神經元，形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，胞體飽滿，突起明顯，說明正常組軸突的軸漿運輸能力正常，可將大量FG運輸?shù)桨w;氣虛血瘀組紅核僅見少量的陽性神經元，熒光強度減弱，且細胞形態(tài)不規(guī)則，邊緣模糊不清，說明RST橫斷后軸突發(fā)生了一定程度的崩解，影響軸漿運輸能力，使得僅有少量FG被輸送到胞體，而細胞形態(tài)的不規(guī)則又進一步說明胞體發(fā)生了逆行性潰變，出現(xiàn)萎縮或壞死;BYHWD組、BMSCs組、BYHWD+BMSCs組的情況優(yōu)于氣虛血瘀組，尤其是BYHWD+BMSCs組，這說明BYHWD或BMSCs的單獨使用可以改善軸突的軸漿運輸能力，挽救逆行性潰變的紅核神經元胞體，而二者的聯(lián)合使用則產生了一定的協(xié)同增效作用。

尼氏體是神經元內特有的物質之一，分布在核周體和樹突內，是細胞內一種呈斑塊狀或顆粒狀的噬堿性物質，能與堿性染液結合并染色。尼氏體的主要功能是合成蛋白質。在正常情況下，尼氏體體積大且數(shù)量多，這反應神經元合成蛋白質的功能較強。一旦神經元受損，其體積縮小，數(shù)量可減少甚至消失[15]。因此尼氏體的形態(tài)及數(shù)量可以提示神經元功能正常與否。尼氏染色結果顯示，正常組可見中腦紅核區(qū)細胞密集，細胞形態(tài)正常，胞體和突起輪廓清晰，尼氏體較大而多，胞漿染色深，著色均一，呈現(xiàn)虎斑樣，說明紅核神經元胞體的形態(tài)和功能均正常;氣虛血瘀組細胞密度稀疏，細胞皺縮明顯，部分細胞胞漿空泡樣改變，尼氏體模糊，胞漿染色淺，說明神經元胞體形態(tài)和功能受損嚴重;BYHWD組、BYHWD+BMSCs組的情況優(yōu)于氣虛血瘀組，特別是BYHWD+BMSCs組，說明BYHWD或BMSCs的單獨使用能保護RST橫斷后的紅核神經元胞體，維持其正常功能，而二者的聯(lián)合使用則產生了一定的協(xié)同增效作用。

由此可見，BYHWD聯(lián)合BMSCs移植對保護SCI氣虛血瘀證逆行性潰變的紅核神經元能產生協(xié)同增效作用，其更深層次的機制還需進一步深入研究。

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