響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取桂北金槐米中蕓香苷工藝

姚昕利 舒文將 李鶴

摘要：以桂北金槐（Sophora japonica）為原料，優(yōu)選出蕓香苷的提取工藝，為該藥材的資源開發(fā)提供參考。選取蕓香苷含量為因變量，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取料液比、甲醇濃度、超聲功率為自變量，通過響應(yīng)面法優(yōu)選超聲波輔助提取金槐米蕓香苷的工藝并進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定蕓香苷含量：流動(dòng)相甲醇溶液（A）-0.5%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。最佳提取工藝條件為超聲功率250 W;甲醇濃度88.87%;超聲時(shí)間60 min;料液比1 g ∶ 50 mL，蕓香苷在此提取預(yù)測(cè)值、驗(yàn)證值分別為35.32%、33.19%，兩者相差不大。結(jié)果表明，優(yōu)選的提取工藝穩(wěn)定可行、預(yù)測(cè)性良好，能提高金槐槐米資源的合理利用，能為槐米蕓香苷制劑開發(fā)提供參考。

關(guān)鍵詞：金槐;超聲波輔助提取;響應(yīng)面法;蕓香苷;提取;HPLC

中圖分類號(hào)： R284.2 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號(hào)：1002-1302（2019）02-0197-04

金槐（Sophora japonica）屬槐樹的栽培品種，以金黃色的槐米得名[1];相較其他地區(qū)的槐米，金槐含有豐富的蕓香苷，其蕓香苷含量可達(dá)25%～28%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高出普通槐米[2]。蕓香苷不僅藥理性強(qiáng)，具有抗病毒、抗炎、抗氧化等作用，還能強(qiáng)化機(jī)體抵抗力、提升毛細(xì)管的彈性，因此在臨床上主要被用于治療腦出血、高血壓、心血管類疾病[3]，且被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、保健品、功能性食品中，而金槐作為廣西壯族自治區(qū)全州縣特有的品種，蕓香苷含量較高，具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。目前對(duì)于金槐蕓香苷的提取優(yōu)化方案不是很明確，因此制定出規(guī)范高效的提取方法對(duì)現(xiàn)代藥學(xué)研究是非常有必要的。

蕓香苷的提取方法主要有堿提取酸沉淀法、熱水提冷析出法、大孔樹脂分離法、超聲輻射法、乙醇浸提法等，多存在提取效率低、成本高、工藝流程長(zhǎng)、提取蕓香苷的純度差等問題[3-6]。近年來(lái)的研究表明，超聲波輔助提取蕓香苷的效果較好，提取率高且需時(shí)較少[7-8]。通過優(yōu)化、合理選擇提取工藝可以提高蕓香苷提取率，其中最常用的方法主要為（1）正交試驗(yàn);（2）響應(yīng)面法[9]。響應(yīng)面法試驗(yàn)具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、操作方便、精確度高等優(yōu)點(diǎn)[10-12]。本研究以蕓香苷含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在等因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化蕓香苷提取工藝，用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定其含量，為金槐槐米的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槐槐米（廣西壯族自治區(qū)全州縣，經(jīng)廣西植物研究所蔣運(yùn)生研究員鑒定為槐米）、蕓香苷對(duì)照品（上海如吉生物科技有限公司，批號(hào)150706，純度≥95%），磷酸、甲醇為色譜純，水為超純水。試驗(yàn)時(shí)間為2016年9月至2017年5月;地點(diǎn)為桂林醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平[賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司生產(chǎn)];四兩裝高速中藥粉碎機(jī)（浙江省瑞安市永歷制藥機(jī)械有限公司生產(chǎn)）;DL-360D智能超聲波清洗器（上海之信儀器有限公司生產(chǎn)）;高效液相色譜儀（島津制作所生產(chǎn)）。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取蕓香苷工藝 將槐米去雜，用高速中藥粉碎機(jī)粉碎成末后過60目篩，精確稱取1.00 g置于具塞錐形瓶中，分別加入不同濃度的甲醇溶液，在不同的料液比下于不同的超聲時(shí)間、超聲功率下提取，放冷后過濾。用相應(yīng)濃度的甲醇溶液定容至50 mL容量瓶中，取0.1 mL至100 mL容量瓶中，再次定容至刻度線，備用。

1.3.2 單因素分析 參考相關(guān)文獻(xiàn)[13]，以超聲時(shí)間（40 min）、料液比（1 g ∶ 25 mL）、甲醇濃度（60%）、超聲功率（400 W）為參考依據(jù)，為進(jìn)一步剖析各因素與蕓香苷提取率的關(guān)系，確定試驗(yàn)各單因素水平。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn) 確定自變量，具體依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，主要包括超聲功率、甲醇濃度、料液比;其中蕓香苷提取率為響應(yīng)值。結(jié)合Box-Behnken法，設(shè)計(jì)分析試驗(yàn)，表1為各因素水平情況。

1.3.4 蕓香苷含量測(cè)定

1.3.4.1 色譜條件的選擇 采用C18柱，設(shè)定30 ℃柱溫，流速選取1 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)定為260 nm，流動(dòng)相采用甲醇溶液（A）-0.5%磷酸水溶液（B）梯度洗脫，試驗(yàn)洗脫條件見表2。

1.3.4.2 蕓香苷含量標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 取50 mL容量瓶，精確加入蕓香苷對(duì)照品4 mg，用甲醇溶液定容至刻度線后搖勻，備用。精密吸取對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容。按“1.3.4.1”節(jié)中的色譜條件進(jìn)樣并測(cè)定其峰面積。試驗(yàn)結(jié)果：在0.8～7.2 μg 范圍內(nèi)，蕓香苷的峰面積與濃度呈線性關(guān)系?；貧w方程為y=63 663x-4 754.5，R2=0.999 8。

1.3.4.3 精密度試驗(yàn) 取“1.3.4.2”節(jié)中的對(duì)照品溶液，并結(jié)合“1.3.4.1”節(jié)中的色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次。每次進(jìn)樣量為 10 μL，分別記錄峰面積值，結(jié)果表明，蕓香苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.032%，精密度高。

1.3.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取適量金槐槐米樣品細(xì)粉，配制供試品溶液（5份），按照“1.3.4.1”節(jié)中的色譜條件分別測(cè)定峰面積。金槐槐米樣品蕓香苷提取率平均值為22.62%，RSD值為0.942%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 在室溫下放置一供試品溶液，并分別在0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h內(nèi)進(jìn)樣，分別記錄相應(yīng)的峰面積值。結(jié)果蕓香苷峰面積的RSD值為1.201%，表明供試樣品溶液在18 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.3.4.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的金槐樣品粉末5份，并向其中分別加入蕓香苷對(duì)照品，按供試品測(cè)定方法測(cè)定，算得平均加樣回收率為99.45%，RSD值為1.54%。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 不同甲醇濃度對(duì)蕓香苷提取率的影響 在固定料液比為1 g ∶ 10 mL、超聲時(shí)間為60 min、超聲功率為350 W的條件下，考察甲醇濃度為60%、70%、80%、90%、100%時(shí)蕓香苷提取率的變化。由圖1可知，甲醇濃度為70%～90%時(shí)，隨甲醇濃度增大，蕓香苷提取率增加，當(dāng)濃度達(dá)到90%后提取率不再增加，說明此時(shí)蕓香苷能溶于甲醇溶液中的含量達(dá)到最大。這可能是因?yàn)榧状既芤簼舛冗^高時(shí)，會(huì)增加甲醇溶液的揮發(fā)，使得一些脂溶性物質(zhì)溶出，影響了蕓香苷的提取，致使蕓香苷提取率下降。所以確定最佳的甲醇濃度為90%。

2.1.2 不同超聲時(shí)間對(duì)蕓香苷提取率的影響 在甲醇溶液濃度為80%、料液比為1 g ∶ 10 mL、超聲功率為350 W條件下，考察超聲時(shí)間為30、40、50、60、70 min時(shí)蕓香苷提取率的變化。由圖2可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，蕓香苷提取率呈現(xiàn)小幅度波動(dòng)，但整體變化不大，其中提取率最大值出現(xiàn)在超聲時(shí)間為60 min 時(shí)。因此本試驗(yàn)固定超聲時(shí)間為60 min。

2.1.3 不同料液比對(duì)蕓香苷提取率的影響 在固定甲醇溶液濃度為80%、超聲時(shí)間為60 min、超聲功率為350 W條件下，分別考察料液比為1 ∶ 10、1 ∶ 20、1 ∶ 30、1 ∶ 40、1 ∶ 50、1 ∶ 60 （g ∶ mL）時(shí)蕓香苷提取率的變化。由圖3可知，蕓香苷提取率隨溶劑體積的增加而增加，這是因?yàn)槿軇┖褪|香苷的接觸面積增大使蕓香苷更易溶出;但當(dāng)料液比達(dá)到 1 g ∶ 50 mL 之后，隨著料液比繼續(xù)增加提取率趨于穩(wěn)定。因此確定最佳料液比為1 g ∶ 50 mL。

2.1.4 不同超聲功率對(duì)蕓香苷提取率的影響 在固定甲醇溶液濃度為80%、料液比為1 g ∶ 10 mL、超聲時(shí)間為 60 min 條件下，考察超聲功率200、250、300、350 W時(shí)蕓香苷提取率的變化。由圖4可知，蕓香苷提取率在250～350 W范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)，且在 350 W 時(shí)達(dá)到最大，即本試驗(yàn)選取 350 W 為最佳超聲功率。

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

2.2.1 回歸方程的建立與分析 依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以料液比、甲醇溶液濃度、超聲功率為主要因素，根據(jù)Box-Behnken Design試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，對(duì)考察因素和其水平進(jìn)行設(shè)計(jì)，其中分析因子12個(gè)、零點(diǎn)5個(gè)，共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)進(jìn)行5次，以估計(jì)誤差，結(jié)果見表3。

多元擬合分析，主要運(yùn)用Design-Expert 8.0軟件及表3獲得的相關(guān)數(shù)據(jù)，得出如下擬合方程：Y=22.62+4.62A+0.57B-1.03C+0.75AB-2.91AC-1.20BC-4.68A2-0.58B2+0.80C2;Y表示提取率。由表4可知， 試驗(yàn)?zāi)Ｐ惋@著性值小于0.01，說明試驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械亩?xiàng)式方程較符合實(shí)際提取情況，較好地反映了料液比、甲醇溶液濃度和超聲功率與蕓香苷提取率間的關(guān)系，并且表明甲醇溶液濃度和料液比間、甲醇溶液濃度和超聲功率間以及料液比和超聲功率間的交互作用對(duì)蕓香苷提取率的影響極顯著。

2.2.2 響應(yīng)面分析因素之間的交互作用 圖5為超聲功率300 W條件下，甲醇溶液濃度和料液比的交互作用與蕓香苷提取率間關(guān)系的等高線圖和三維曲面圖。由圖5可知，當(dāng)甲醇溶液濃度和料液比較小時(shí)，提取率變化較大;且甲醇濃度和料液比逐漸增大到較大值時(shí)，提取率也逐漸增大;當(dāng)增大到一定水平時(shí)，提取率卻逐漸下降，說明甲醇溶液濃度和料液比2個(gè)因素交互作用明顯。當(dāng)料液比一定時(shí)，增加甲醇溶液濃度不一定會(huì)提高提取率，可能是因?yàn)榧状紳舛仍龃笫沟媒鸹敝械闹苄晕镔|(zhì)溶解量增多，從而抑制了蕓香苷的溶解。

圖6為甲醇溶液濃度和超聲功率的交互作用與蕓香苷提取率間關(guān)系的等高線圖和三維曲面圖，固定料液比為 1 g ∶ 40 mL。蕓香苷提取率在甲醇溶液濃度、超聲功率較小時(shí)變化較大;當(dāng)超聲功率處于低水平，而甲醇溶液濃度處于高水平時(shí)，蕓香苷提取率達(dá)到最高;當(dāng)超聲功率一定時(shí)，隨著甲醇濃度的增加，蕓香苷提取率的變化較大，說明這2個(gè)因素間的交互作用明顯。

圖7為料液比和超聲功率的交互作用與蕓香苷提取率間關(guān)系的等高線圖和三維曲面圖，固定甲醇濃度為80%。由圖7可知，當(dāng)料液比較大時(shí)，蕓香苷提取率隨著超聲功率的增大逐漸減小;而當(dāng)超聲功率一定時(shí)，蕓香苷提取率隨著料液比的增大卻不一定增加，說明2個(gè)因素間的交互作用明顯，且當(dāng)料液比處于高水平，超聲功率處于低水平時(shí)達(dá)到最大值。

2.2.3 最佳提取條件的確定和驗(yàn)證 結(jié)合Design-Expert 8.0，綜合分析與試驗(yàn)可操作性、蕓香苷提取率有關(guān)的各個(gè)因素，得出最優(yōu)超聲工藝為甲醇濃度88.87%，料液比 1 g ∶ 50 mL，超聲功率250 W，此時(shí)蕓香苷提取率的預(yù)測(cè)值為35.32%。采用上述最優(yōu)工藝進(jìn)行驗(yàn)證， 重復(fù)試驗(yàn)3次， 得到蕓香苷提取率為33.19%，與預(yù)測(cè)值相差無(wú)幾，說明該超聲輔助工藝準(zhǔn)確性和可靠性高。

3 討論

選擇全面試驗(yàn)中最具代表性的部分，結(jié)合試驗(yàn)、極差分析，并獲得最優(yōu)因素組合的方法即為正交試驗(yàn)法，此法具有簡(jiǎn)單易行的特點(diǎn)，但不能對(duì)各個(gè)因素效應(yīng)、交互作用進(jìn)行分析[9]。而響應(yīng)面法則針對(duì)具體范圍利用爬坡試驗(yàn)得出可代表各因素交互關(guān)系的條件組合，此法更具直觀性、精確性[10-11]。

本研究以廣西壯族自治區(qū)桂北金槐槐米為試驗(yàn)對(duì)象，甲醇超聲為提取方法優(yōu)選出金槐槐米中蕓香苷的最佳提取方法。超聲提取具有操作簡(jiǎn)單、提取效率高的優(yōu)勢(shì)，且超聲提取為物理方法，在提取過程中能避免有效成分被破壞。同時(shí)采用Design-Expert 8.0軟件，對(duì)超聲波輔助提取法提取蕓香苷工藝進(jìn)行優(yōu)化，與傳統(tǒng)的優(yōu)化方法——正交試驗(yàn)法或均勻設(shè)計(jì)法相比，能通過直觀的圖形、精確度較高的數(shù)學(xué)模型對(duì)最佳工藝進(jìn)行優(yōu)化，具有信息量大、直觀、數(shù)據(jù)處理能力較高且能反映各個(gè)因素之間交互作用的優(yōu)點(diǎn)。本研究得到響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助法提取槐米的最佳工藝為料液比 1 g ∶ 50 mL、超聲功率250 W、甲醇濃度88.87%。擇優(yōu)選取的提取工藝不僅操作簡(jiǎn)單而且提取效率更高，有利于縮短提取時(shí)間，為進(jìn)一步開發(fā)金槐中的蕓香苷提供了科學(xué)合理的理論和試驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]蔣運(yùn)生. 金槐規(guī)范化種植技術(shù)（一）[J]. 廣西林業(yè)，2013（5）：48-49.

[2]李 鋒，唐 輝，韋 霄，等. 廣西全州縣金槐生產(chǎn)存在的問題及發(fā)展對(duì)策[J]. 廣西科學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，25（2）：130-134.

[3]謝 鋒. 金槐槐米品質(zhì)及規(guī)范化種植關(guān)鍵技術(shù)研究[D]. 成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[4]胡斌杰，陳金鋒，王宮南. 超聲波法與傳統(tǒng)熱水法提取靈芝多糖的比較研究[J]. 食品工業(yè)科技，2007，28（2）：190-192.

[5]Zhao C J，Lu Z C，Li C，et al. Optimization of ionic liquid based simultaneous ultrasonic- and microwave-assisted extraction of rutin and quercetin from leaves of velvetleaf（Abutilon theophrasti） by response surface methodology[J]. Scientific World Journal，2014，28：3024-3025.

[6]劉金玉，吳秀華，商雪嬌，等. 不同大孔吸附樹脂對(duì)苦蕎蘆丁分離純化效果的研究[J]. 食品研究與開發(fā)，2008，29（7）：22-24.

[7]王 筠，李全良，劉 芳. 超聲輔助提取紅棗中蘆丁的工藝研究[J]. 現(xiàn)代食品科技，2013（1）：115-117.

[8]王勝利，孫金香，席改卿，等. 槐花中蘆丁超聲輔助提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究[J]. 食品工業(yè)科技，2012，33（18）：306-308.

[9]黃 菊，翟淑敏. 正交設(shè)計(jì)和響應(yīng)面法優(yōu)化蕎麥中蘆丁提取工藝的比較[J]. 糧食與油脂，2014（9）：45-48.

[10]王振強(qiáng)，李孝坤，王 浩. 響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取番茄皮渣中番茄紅素工藝及其HPLC-MS測(cè)定[J]. 食品科學(xué)，2015，36（12）：70-75.

[11]夏 季，鄭 炯，陳光靜，等. 響應(yīng)面法優(yōu)化超聲輔助提取野木瓜多酚工藝[J]. 食品工業(yè)科技，2014，35（21）：253-258.

[12]Liao J Q，Qu B D，Liu D，et al. New method to enhance the extraction yield of rutin from Sophora japonica，using a novel ultrasonic extraction system by determining optimum ultrasonic frequency[J]. Ultrasonics Sonochemistry，2015，27：110-116.

[13]王省超，孫 穎，王瑞英，等. 超聲提取-高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定新疆羅布麻茶中綠原酸和蘆丁的含量[J]. 分析科學(xué)學(xué)報(bào)，2016，32（3）：431-434.