青籬柴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)SSR位點的生物信息學(xué)分析

黃建敏 李菲 劉云靜

摘要：為探討青籬柴轉(zhuǎn)錄組中簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）位點信息，開發(fā)青籬柴分子標(biāo)記技術(shù)，采用高通量測序技術(shù)獲得青籬柴轉(zhuǎn)錄組原始試驗數(shù)據(jù)，經(jīng)過生物信息學(xué)軟件Trinity拼接后，獲得66 755條單基因簇（universal gene，簡稱unigene）。進(jìn)一步采用生物信息學(xué)分析軟件MISA對所有的unigene進(jìn)行SSR位點數(shù)據(jù)挖掘。共計搜索出22 542個SSR位點，分布在18 972條unigene中，出現(xiàn)頻率為33.77%，發(fā)生頻率為28.42%，SSR平均長度為15 bp，平均分布頻率是1/3.98 kb，在青籬柴轉(zhuǎn)錄組的SSR中，單核苷酸、三核苷酸和二核苷酸重復(fù)序列為主要重復(fù)類型，分別占總SSR的47.59%、27.95%、23.45%。青籬柴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSR序列共包括161種重復(fù)基元類型。其中出現(xiàn)頻率高的基序主要有A/T、AG/CT、AAG/CTT、AT/AT、C/G、AGG/CTT。重復(fù)序列長度在10～144 bp之間，大多小于24 bp，大于24 bp的僅有0.22%（48個SSR位點）。另外，設(shè)計篩選得到15 425對SSR引物。綜上表明青籬柴SSR位點多態(tài)性潛能較高，具有很大的可開發(fā)性。

關(guān)鍵詞：青籬柴;轉(zhuǎn)錄組;SSR;重復(fù)類型;重復(fù)基元

中圖分類號：Q811.4 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0054-05

簡單重復(fù)序列（simple sequence repeat，簡稱SSR）是指由1～6個核苷酸為重復(fù)單位組成的串聯(lián)重復(fù)序列，隨機、廣泛、均勻地分布于真核生物基因組中，由于重復(fù)次數(shù)不同而造成簡單序列長度多態(tài)性（simple sequence length polymorphism，簡稱SSLP）[1]。不同物種的簡單重復(fù)序列差異很大，主要表現(xiàn)在重復(fù)次數(shù)、基序類型、長度以及在染色體上的分布情況等，從而反映出物種間高度的等位基因多樣性。雖然SSR具有高度多態(tài)性，但其兩端的序列一般都比較保守和專一，因此可憑借兩端的保守序列設(shè)計特異性的SSR引物，通過PCR技術(shù)擴增出SSR，再利用瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)獲得其長度多態(tài)性，即SSR分子標(biāo)記。由此開發(fā)的SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有操作簡單、穩(wěn)定性好、分布豐富、易檢測、共顯性、等位基因變異多、遵循孟德爾遺傳定律、進(jìn)化所受選擇壓力小以及種族特異性強等優(yōu)點。目前，SSR分子標(biāo)記作為重要的遺傳標(biāo)記，已經(jīng)在品種純度鑒定、基因功能定位、分子輔助育種、遺傳圖譜構(gòu)建以及親緣關(guān)系分析等方面有廣泛的應(yīng)用[2-3]。

早期開發(fā)SSR分子標(biāo)記的方法主要是基因組文庫構(gòu)建、克隆測序和通過公共數(shù)據(jù)庫中表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，簡稱EST）進(jìn)行開發(fā)。所需費用高、時間周期長、步驟復(fù)雜、工作量大，且成功獲得SSR陽性克隆和多態(tài)性引物的概率很低[4]。鑒于當(dāng)前新一代高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速，測序成本顯著降低的狀況。利用高通量測序技術(shù)對植物進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，具有快速高效、花費時間合理等優(yōu)點，從基因的結(jié)構(gòu)和功能出發(fā)，通過新一代高通量測序技術(shù)，除了可以全面快速地獲得某一特定組織或器官在特定狀態(tài)下幾乎所有的轉(zhuǎn)錄本信息，能可靠地發(fā)現(xiàn)大量特定組織在特定時間點的基因表達(dá)數(shù)據(jù)之外[5]，還可根據(jù)測序結(jié)果開發(fā)具有基因信息的SSR分子標(biāo)記[6-8]，運用該方法，已在刺梨[9]、黨參[10]、茯苓[11]、魚腥草[12]、杜仲[13]等多種植物上開發(fā)出具有基因信息的SSR標(biāo)記并應(yīng)用于遺傳分析。

青籬柴（Tirpitzia sinensis）為亞麻科青籬柴屬下的一個種，屬灌木或小喬木。其莖、葉能消腫止痛、接骨，在民間有用藥歷史，但尚未見有關(guān)藥學(xué)研究報道，從民族植物學(xué)的角度是值得關(guān)注的物種。青籬柴花具有很好的觀賞價值，可以對其進(jìn)行引種栽培。蔡湘文在黑葉猴的覓食生物學(xué)和營養(yǎng)分析的研究中提到，青籬柴的葉是黑葉猴喜食的種類之一[14]。杜小浪等在重慶市彭水縣進(jìn)行第4次全國中藥資源普查中發(fā)現(xiàn)了青籬柴分布新紀(jì)錄，青籬柴的原分布區(qū)域位于重慶市的南面，重慶市可能是青籬柴分布的最北界，這對于植物譜系地理研究具有重要意義[15]。喻勛林等在湖南省都龐嶺自然保護(hù)區(qū)植物區(qū)系的研究中將青籬柴歸類為石灰?guī)r特有（或適生）植物[16]。蔣水元等在對廣西壯族自治區(qū)石灰?guī)r特有珍惜藥用植物類群的基本特征研究中，在藥用植物的分布區(qū)類型構(gòu)成中，將青籬柴歸為熱帶亞洲（印度-馬來西亞）類[17]。國內(nèi)外暫無單獨對青籬柴的研究報道。針對青籬柴研究的空白，開展青籬柴的遺傳多樣性研究，揭示青籬柴資源的親緣關(guān)系，探究其在不同地理分布區(qū)的遺傳差異，揭示其物種分化過程，能為青籬柴種質(zhì)資源的保護(hù)和合理利用提供理論依據(jù)。本研究首次采用二代測序技術(shù)的方法，獲得大量青籬柴轉(zhuǎn)錄組序列信息，并對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的SSR位點進(jìn)行搜索和檢測，分析其分布及結(jié)構(gòu)特點，并結(jié)合SSR引物設(shè)計綜合評價其可用性，以期為在分子水平上研究青籬柴遺傳多樣性提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 青籬柴材料及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)來源

本試驗轉(zhuǎn)錄組測序樣本來源于貴州省黔東南苗族侗族自治州施秉縣云臺山，采取同一株青籬柴個體上的幼嫩葉片、花和枝干組織各1.5 g，進(jìn)行等量混樣，迅速放入液氮，送北京諾禾致源科技股份有限公司提取mRNA，利用Illumina HiSeqTM 2000高通量測序平臺對其進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，總計產(chǎn)出8.71 GB數(shù)據(jù)，干凈讀序經(jīng)Trinity組裝后最終獲得66 755條unigene，總長度為 89 702 690 bp，平均長度為1 344 bp，過濾后質(zhì)量不低于20的堿基比例（Q20，測序錯誤率<1%）為 97.47%，表明測序結(jié)果良好，可對獲得的數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.2 青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR的篩選

以組裝出來的unigene作為參考序列，使用MicroSAtellite（簡稱MISA）軟件（http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html）對青籬柴轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點進(jìn)行搜索和檢測。對應(yīng)的各個核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)分別為1-10、2-6、3-5、4-5、5-5、6-5（如1-10意思為以單核苷酸為重復(fù)單位時，其重復(fù)數(shù)至少為10才可以被檢測到;2-6意思為以二核苷酸為重復(fù)單位時，其最少重復(fù)數(shù)為6）。并且對不同SSR類型在基因轉(zhuǎn)錄本的密度分布進(jìn)行統(tǒng)計。同時篩選被間隔≤100 bp 堿基打斷的復(fù)合型SSR。

1.3 青籬柴SSR引物設(shè)計

采用Primer 3.0（2.3.5版，默認(rèn)參數(shù)）進(jìn)行SSR引物設(shè)計，并針對預(yù)測到的每一個SSR位點分別設(shè)計3組引物供后期試驗選擇。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

將生成的文本文件導(dǎo)入到Excel中進(jìn)行基本的統(tǒng)計分析。用SSR出現(xiàn)頻率、發(fā)生頻率及其分布的平均距離、重復(fù)類型、基元組成等分析青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR的分布特征，其中出現(xiàn)頻率=搜索到的SSR總數(shù)/總unigene序列數(shù);發(fā)生頻 率= 有SSR分布的序列數(shù)/總unigene序列數(shù);SSR分布的平均距離=序列總長度/搜索到的SSR數(shù)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 青籬柴SSR數(shù)量與分布

由表1可知，利用MISA軟件對青籬柴轉(zhuǎn)錄組測序獲得的66 755條unigene進(jìn)行檢索，共找到符合條件的SSR位點有22 542個，分布于18 972條unigene中。SSR發(fā)生頻率為28.42%，出現(xiàn)頻率為33.77%。其中含單個SSR位點的unigene有14 071條，含2個及2個以上SSR位點的unigene有4 901條。復(fù)合型SSR數(shù)量為1 573個。

由表2可知，青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR位點的種類非常豐富，從單堿基到六堿基重復(fù)均有分布，對1～6 bp的SSR重復(fù)基元類型進(jìn)行統(tǒng)計可以看出，每個重復(fù)類型所含的數(shù)量相差很大。主要重復(fù)類型是單核苷酸，占SSR總數(shù)的47.59%，其次為三核苷酸和二核苷酸，分別占27.95%、23.45%，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)的數(shù)量極少，總計占1.01%，但類型很豐富，其中四核苷酸重復(fù)基序數(shù)量高于五核苷酸、六核苷酸。從分布情況看，相應(yīng)的不同重復(fù)基序長度SSR分布的平均距離差距很大，其中單核苷酸重復(fù)最多，每條SSR分布平均距離為8.36 kb，其次為三核苷酸重復(fù)，每條SSR分布的平均距離為14.23 kb，六核苷酸重復(fù)最少，每條SSR分布的平均距離為6 900.21 kb，整體上青籬柴轉(zhuǎn)錄組中平均每 3 979 bp 就含有1個SSR位點。

2.2 青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR的特性

青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR位點的序列總長高達(dá)330 350 bp，平均每個SSR位點長度為15 bp，其中1～6 bp各核苷酸重復(fù)基元類型的SSR位點平均長度依次分別為13、16、17、21、25、36 bp。青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR位點的重復(fù)次數(shù)分布在5～24次之間，其中重復(fù)次數(shù)以10次最多，有5 013個，占總SSR數(shù)量的22.24%，其后依次是5、6、11、7次，分別占總SSR數(shù)量的16.71%、14.29%、9.54%、7.99%。不同類型SSR重復(fù)單元的重復(fù)次數(shù)分布存在差異，單核苷酸重復(fù)以10次重復(fù)為主;二核苷酸重復(fù)以6次重復(fù)為主;三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)均以5次重復(fù)為主。不同類型SSR重復(fù)單元均隨著重復(fù)次數(shù)的增加，位點數(shù)量呈遞減的趨勢。另外，隨著青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR位點的重復(fù)次數(shù)增多，單核苷酸重復(fù)類型所占比例越大。其中，重復(fù)次數(shù)在10次以上的SSR位點中，單核苷酸重復(fù)類型的SSR位點所占比例高達(dá)96.23%（圖1）。

在青籬柴轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點長度分布于10～144 bp之間，長度為10～24 bp的重復(fù)序列最多，占99.78%;其次是25～42 bp的序列重復(fù)， 占0.19%; 大于43 bp的重復(fù)序列僅占0.03%（圖2）。

青籬柴轉(zhuǎn)錄組中共含有161種不同基序序列類型的SSR位點，從單核苷酸重復(fù)到六核苷酸重復(fù)依次有4、12、60、64、9、12種類型。從SSR位點重復(fù)單元出現(xiàn)頻率（表3）來看，單核苷酸重復(fù)中A/T重復(fù)基序類型占絕對的優(yōu)勢，占總SSR位點數(shù)量的43.002%，二核苷酸重復(fù)中以AG/CT和AT/AT重復(fù)基序為主，分別占總SSR位點數(shù)量的16.605%、5.714%。在三核苷酸重復(fù)單元中以AAG/CTT基序類型最多，占總SSR位點數(shù)量的 10.692%，另外，四核苷酸、五核苷酸、六核苷酸重復(fù)基元類型因分布很少，包含的各重復(fù)基序類型出現(xiàn)頻率較低。

2.3 青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR引物設(shè)計

采用Primer 3.0引物批量設(shè)計程序?qū)?2 542個SSR位點的兩端序列進(jìn)行引物設(shè)計，15 425條序列引物設(shè)計成功，成功率為68.43%。在設(shè)計成功的15 425對引物中，擴增產(chǎn)物為單堿基重復(fù)的最多，有7 482個，占48.51%;其次為三堿基和二堿基重復(fù)，分別占27.36%、17.73%。另外，PCR產(chǎn)物為復(fù)合型重復(fù)（含有一個以上SSR位點重復(fù)基元）的占5.34%（表4）。

2.3 青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR的可用性評價

鑒定分子標(biāo)記可用性能的重要參考指標(biāo)之一是其多態(tài)性，通常SSR長度是影響其多態(tài)性高低的重要因素，Temnykh等研究表明，SSR長度大于20 bp時具有高度多態(tài)性，長度在12～20 bp之間的SSR具有中度多態(tài)性，而長度在12 bp以下時多態(tài)性極低[18]。因此本研究對青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR位點進(jìn)行搜索的篩選標(biāo)準(zhǔn)為單核苷酸重復(fù)至少10次，二核苷酸重復(fù)至少6次，三至六核苷酸重復(fù)至少5次。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR的長度大多集中在12～45 bp之間，其中長度大于20 bp具有高度多態(tài)性的SSR共有1 739個，占總SSR的7.71%;長度在12～20 bp之間具有中度多態(tài)性的SSR共有14 756個，占總SSR的65.46%。另外，根據(jù)Zhang等的研究表明，高級重復(fù)單元類型的SSR多態(tài)性普遍比低級重復(fù)單元類型的低[19]。本試驗獲取的SSR主要是低級重復(fù)單元，如單核苷酸、三核苷酸、二核苷酸重復(fù)所占比例為87.27%，對青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR進(jìn)行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，長度大于20 bp的SSR全部屬于單核苷酸重復(fù)，共包含508個SSR位點，表明這部分青籬柴SSR具有高度多態(tài)性潛能，可以預(yù)計在青籬柴基因功能表達(dá)差異研究方面具有很好的利用價值。

3 討論與結(jié)論

目前高通量測序技術(shù)發(fā)展迅速、測序成本顯著降低，因此產(chǎn)生了大量的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)，尤其是對于未知基因組序列的物種，其在轉(zhuǎn)錄組學(xué)中的研究越來越廣泛?；谵D(zhuǎn)錄組測序的SSR分子標(biāo)記因其具有重復(fù)性好、等位差異多、多態(tài)性十分豐富、覆蓋面廣等優(yōu)點，目前已廣泛應(yīng)用于多種植物的品種選育和遺傳多樣性研究中。SSR廣泛分布于各種真核生物的基因組中，大約每隔10～50 kb就存在1個SSR。在植物中，平均23.3 kb就有1個SSR[20]。

本研究首次通過高通量測序技術(shù)得到青籬柴轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)信息，經(jīng)過組裝與定位得到總計66 755條unigene，搜索到符合條件的SSR位點共計 22 542個，分布于18 972條unigene中，平均分布頻率為 1/3.98 kb，明顯高于云南松、菠菜、南方紅豆杉、燈盞花、洋蔥、藏茵陳、川西獐牙菜等[21-26]，略低于刺梨、藍(lán)靛果忍冬、菜薹等[27-28]。SSR位點出現(xiàn)頻率為33.77%，明顯高于紅松、魚腥草、印度南瓜、黨參、金釵石斛、莕菜、野三七、茄子等，低于杜仲、芙蓉李等[29-35]。造成不同物種SSR位點的出現(xiàn)頻率和平均分布頻率差異的原因可能與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中unigene數(shù)量及長度、SSR篩選的條件以及物種本身基因組差異等有關(guān)[36]。綜上說明青籬柴轉(zhuǎn)錄組中SSR重復(fù)位點數(shù)量相對而言比較豐富，可為SSR的開發(fā)提供重要的資源庫。

不同物種之間SSR主要重復(fù)類型有所差異，很多植物的SSR主要以二核苷酸、三核苷酸重復(fù)單元類型為主。本研究發(fā)現(xiàn)，青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基元類型主要以單核苷酸為主，占全部SSR的47.59%，其次是三核苷酸，占全部SSR的27.95%。這與紅松、菜薹、茄子等相似，但與云南松、魚腥草、洋蔥、藏茵陳、刺梨等物種不同，這些植物中SSR的主要類型是三核苷酸重復(fù)。有研究表明，SSR的多態(tài)性與不同基序序列類型有一定關(guān)聯(lián)，SSR的重復(fù)基序類型中普遍存在A/T優(yōu)勢。G/C重復(fù)基序類型在多數(shù)植物中很難見到，出現(xiàn)頻率都很低。原因可能是打破A/T堿基對之間的氫鍵所需的能量低于G/C堿基對之間的氫鍵，A/T的波動較G/C容易[36]。但也有觀點認(rèn)為，由于甲基化的C殘基轉(zhuǎn)化為T及位于3′末端的polyA序列插入基因組后形成富含A的原始SSR，導(dǎo)致重復(fù)基序中A/T優(yōu)勢的出現(xiàn)[37]，具體原因有待進(jìn)一步研究分析。本研究也發(fā)現(xiàn)，青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR重復(fù)基序類型出現(xiàn)最多的是A/T，所占比例為43.002%。其次，AT/AT和AAT/ATT重復(fù)基序類型出現(xiàn)次數(shù)仍然很高，所占比例分別為5.714%、2.315%，表現(xiàn)出較明顯的A/T優(yōu)勢。而G/C在所有重復(fù)基序類型中的出現(xiàn)頻率極低，C/G和CG/CG在單核苷酸和二核苷酸中所占的比例分別僅為4.845%、0.012%，這很好地驗證了上述觀點?？偟膩碇v，青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR不僅出現(xiàn)頻率高、平均分布頻率廣，且類型豐富，具有較高的多態(tài)性潛能和可用性。本研究明確了青籬柴轉(zhuǎn)錄組SSR位點的基本特征，其結(jié)果可為開發(fā)青籬柴SSR分子標(biāo)記奠定基礎(chǔ)。與此同時，伴隨著青籬柴SSR分子標(biāo)記的開發(fā)和利用，對于豐富青籬柴分子標(biāo)記類型，加快青籬柴功能基因資源的開發(fā)利用，建立青籬柴種質(zhì)資源評價和改良機制，對青籬柴進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳分化、居群動態(tài)和遺傳多樣性分析等具有重要意義。

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