硬葉兜蘭菌根結(jié)構(gòu)及菌根真菌空間分布特征

田凡 廖小鋒 顏鳳霞

摘要：為了解瀕危植物硬葉兜蘭菌根真菌在結(jié)構(gòu)及分布方面的特征，采用切片法觀察其菌根結(jié)構(gòu)，分離培養(yǎng)不同根齡菌根真菌、根不同部位的菌根真菌，并進(jìn)行觀察、鑒定。結(jié)果表明，硬葉兜蘭菌絲團大多數(shù)分布于根部皮層細(xì)胞，菌絲團數(shù)量由外皮層向皮層細(xì)胞逐漸增加，皮層細(xì)胞向內(nèi)皮層逐漸減少，內(nèi)皮層和中柱細(xì)胞內(nèi)沒有菌絲和菌絲團;皮層中間部位菌根真菌菌絲團數(shù)量最多，高于靠近表皮和靠近中柱部位的菌絲團數(shù)量;根基部、中部和根尖部位都有菌根真菌，但根中部的菌根真菌數(shù)量最多;菌根真菌的種類和數(shù)量隨著根齡的變化而變化，隨著根齡的增加，菌根真菌種類和數(shù)量也相應(yīng)地增加。

關(guān)鍵詞：硬葉兜蘭;菌根真菌;菌根結(jié)構(gòu);分布;特征

中圖分類號： Q934 ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0105-04

蘭科（Orchidaceae Juss.）植物大多數(shù)依賴菌根真菌所提供的營養(yǎng)物質(zhì)來促進(jìn)種子萌發(fā)和幼苗生長[1]。部分具有綠色葉子和無葉綠素的蘭科植物，整個生長周期都須要與菌根真菌共生[2]。自20世紀(jì)初由Bernard和Burgeff揭示蘭科植物菌根之謎后，國內(nèi)外相繼開展了大量的蘭科植物菌根真菌的研究。近年來也有一些學(xué)者對兜蘭屬（Paphiopedilum Pfitz.）植物菌根真菌進(jìn)行了報道，李明等對杏黃兜蘭（Paphiopedilum armeniacum S. C. Chen & F. Y. Liu）菌根真菌進(jìn)行了研究[3];Yuan等利用分子系統(tǒng)學(xué)方法，對比了野外與移栽到溫室2種不同生境的硬葉兜蘭（Paphiopedilum micranthum Tang & F. T. Wang）和杏黃兜蘭的菌根真菌多樣性[4];Nontachaiyapoom等收集了不同生境的兜蘭屬植物進(jìn)行菌株分離，通過形態(tài)和分子鑒定出了Epulorhiza repens和Epulorhiza calendulina（均暫無中文名）類真菌[5]。

原產(chǎn)于我國兜蘭屬的硬葉兜蘭，花奇色美，具有非常高的觀賞價值[6]。由于采集過度、走私出境猖獗以及生境破壞等原因，近十幾年來野生硬葉兜蘭的數(shù)量急劇減少，分布區(qū)逐漸萎縮，已經(jīng)到了滅絕的邊緣。硬葉兜蘭野生資源的保護(hù)和人工繁育問題亟待引起社會各界的重視。由于硬葉兜蘭的種子無胚乳，發(fā)芽率極低，雖然目前人工無菌播種已經(jīng)獲得成功，但是出瓶率低、移栽難的問題還沒得到解決。將菌根真菌應(yīng)用于種子萌發(fā)及幼苗的生長，可解決硬葉兜蘭人工有性繁殖難題。本研究對硬葉兜蘭菌根進(jìn)行切片觀察并對其菌根真菌進(jìn)行分離培養(yǎng)，分析硬葉兜蘭菌根結(jié)構(gòu)及菌根真菌空間分布特點，以期為蘭科植物內(nèi)生菌根真菌的特征增添素材，為硬葉兜蘭的人工繁殖及其保育工作提供理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為硬葉兜蘭成年植株根部，其植株采集于貴州省銅仁地區(qū)德江縣青龍鎮(zhèn)潮水河一帶。

1.2 試驗方法

1.2.1 徒手切片法 將硬葉兜蘭根在流水下沖洗干凈，選取具有菌絲團的根段，徒手切片，用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色液染色，在OLYTMPUS DP70光學(xué)顯微鏡下觀察菌根結(jié)構(gòu)特點并拍照。

1.2.2 菌株的分離培養(yǎng) 菌株分離培養(yǎng)參考Zhu等的單菌絲團分離法[7-8]，具體如下：

（1）根處理和含菌絲團根段的選擇。截取硬葉兜蘭新鮮根段分裝于盛有無菌水的培養(yǎng)皿中，無菌狀態(tài)下用解剖刀輕輕刮掉根被，顯微鏡檢，選出具有菌絲團的根段，用0.1%氯化汞溶液消毒2～3 min，無菌水沖洗 4～5次，然后用解剖針和鑷子刮菌絲團根段，使單菌絲團從皮層細(xì)胞中游離出來，24 ℃ 恒溫箱培養(yǎng)12 h后顯微鏡觀察。

（2）菌絲團的刮制方法。在顯微鏡下觀察，根據(jù)第1層（靠近表皮的2～3層細(xì)胞）、第2層（中間3～4層皮層細(xì)胞）和第3層（靠近中柱2～3層細(xì)胞）3個層次分別刮制于盛有無菌水的直徑為60 cm培養(yǎng)皿中。

（3）菌絲團的選擇及分離培養(yǎng)。在顯微鏡暗視野中找到生長出菌絲的菌絲團或菌絲結(jié)，利用1 000 μL的移液槍吸取菌絲團，轉(zhuǎn)接到1 cm2雙抗馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）培養(yǎng)基塊上，24 ℃恒溫箱培養(yǎng)。

（4）菌絲團的純化。顯微鏡下鏡檢小塊培養(yǎng)基，將開始生長的菌絲團從小塊培養(yǎng)基上切下，然后轉(zhuǎn)接至PDA培養(yǎng)基，24 ℃恒溫培養(yǎng)。

1.2.3 菌株鑒定 菌種鑒定依據(jù)菌株菌落的培養(yǎng)特征及菌株顯微形態(tài)觀察的結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)資料，綜合分析對比相關(guān)特征的異同，最后確定鑒定菌株的分類地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 硬葉兜蘭菌根結(jié)構(gòu)

顯微鏡下觀察硬葉兜蘭根的縱切面和橫切面，從外至內(nèi)依次為根毛（RH）、根被（velamen）、外皮層（exodermis）、皮層（cortex）、內(nèi)皮層（endodermin）和維管柱（vascular cyhinder）。根被組織由4～5層厚壁、多角死細(xì)胞組成，細(xì)胞扁長，排列較松散。外皮層緊貼根被內(nèi)側(cè)，由1層細(xì)胞組成，細(xì)胞體積較大，排列也較規(guī)則，其中大部分細(xì)胞為胞壁增厚的死細(xì)胞。皮層由15～17層薄壁細(xì)胞組成，其中靠近外皮層與內(nèi)皮層的 1～2層細(xì)胞體積相對較小，中部的皮層細(xì)胞體積較大，皮層細(xì)胞中含有針狀結(jié)晶和菌根真菌形成的菌絲團。Rasmussen用苯胺藍(lán)對蘭科植物原球莖中的針狀結(jié)晶研究表明，針狀結(jié)晶是植物酸鈣，硬葉兜蘭菌根中的針狀結(jié)晶可能也是這類物質(zhì)[9]。內(nèi)側(cè)靠中柱（VB）的一層是內(nèi)皮層，具有明顯的凱氏帶（casparian strip）。內(nèi)層是維管柱，中柱鞘（pericycle）由1層細(xì)胞構(gòu)成，木質(zhì)部（xylem）與韌皮部（phloem）交替分布（圖1-a至圖1-f）。

在皮層薄壁組織中清晰地觀察到大量的菌絲團（pelotons）和少量松散的菌絲，菌絲團近橢圓形，皮層細(xì)胞中的菌絲團還通過菌絲穿越細(xì)胞壁（CW）形成菌絲連接（PC）而侵染另一細(xì)胞（圖1-a）;菌絲團中或附近也觀察到了念珠狀細(xì)胞（B）（圖1-b）;在圖1-c中可以看出菌絲順著根毛進(jìn)入根被。菌絲團中或附近也觀察到了大量的念珠狀細(xì)胞，在皮層細(xì)胞中，菌絲團常常分布在靠近細(xì)胞核（N）的部位，這與范黎等在其他蘭科植物中觀察到的現(xiàn)象[10-11]類似。菌根真菌在皮層細(xì)胞內(nèi)形成菌絲結(jié)，可看到皮層細(xì)胞內(nèi)分布著著色棕色或深棕色形態(tài)形狀不規(guī)則的菌絲結(jié)等結(jié)構(gòu)，這與丁暉等對蘭花菌根結(jié)構(gòu)研究的結(jié)果[12-13]類似。菌絲團主要分布于皮層細(xì)胞的3～5層中，且非均勻分布于整個橫截面（圖1-e）。皮層細(xì)胞中的菌絲團還通過菌絲穿越細(xì)胞壁而侵染另一細(xì)胞，并再次形成菌絲結(jié)（圖1-a）。而在中柱（微管柱）中既沒有菌絲團，也沒有菌絲。蘭科植物在真菌感染后形成菌絲團等結(jié)構(gòu)是形成共生關(guān)系最直觀、最可靠的證據(jù)。在硬葉兜蘭根的皮層細(xì)胞中明顯觀察到菌絲團、菌絲團之間的菌絲連接、松散的菌絲團以及消解中的菌絲團（DP）（圖1-e），強有力地證明了在自然界硬葉兜蘭與真菌形成典型菌根結(jié)構(gòu)，二者為共生關(guān)系。

2.2 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌縱向分布特征

由表1可知，由根尖向根基部，菌根真菌分離的數(shù)量和種類都有一定的變化特點。首先，從分離數(shù)量的變化上看，由根尖至根基逐漸減少;其次，菌絲團的萌發(fā)活力則是由根尖中菌絲團的分離率13.5%逐漸降至向根基部中菌絲團分離率的8.3%;最后，從分離種類的變化上看，根尖和根中部的種類最多，都為3種，根基部只分布1種菌根真菌。硬葉兜蘭的根基部、中部和根尖部位都有菌根真菌，但其分布由根尖向根基部逐漸減少。

2.3 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌橫向分布特征

由表2可知，從菌絲團分布上來看，菌絲團大多數(shù)分布于皮層細(xì)胞（皮層中間3～4層細(xì)胞）;菌絲團活力上來看，由外皮層向內(nèi)皮層，菌絲團活力逐漸降低，分離率由外皮層及其臨近的1～2層皮層細(xì)胞中菌絲團的分離率20.5%降至內(nèi)皮層及其臨近的1～2層皮層細(xì)胞中菌絲團的分離率0;從種類分布上來看，硬葉兜蘭3年生根皮層中間3～4層細(xì)胞中菌根真菌的種類最多，而第3層（靠近中柱2～3層細(xì)胞）沒有分離到菌根真菌。

2.4 硬葉兜蘭不同根齡中菌根真菌種類及數(shù)量

由表3可知，從菌絲團數(shù)量上來看，2年生根菌絲團數(shù)量最多，其次是3年生根，1年生根菌絲團的數(shù)量明顯最少;萌發(fā)生長率與菌絲團的數(shù)量關(guān)系不大，1年生根菌絲團的萌發(fā)率略大于2年生根，3年生其次，但表3的比率差值不大。從菌根真菌種類上來看，2年生根分離的種類最多，1年生根中的菌根真菌種類最少。硬葉兜蘭菌根真菌的種類和數(shù)量隨著根齡的變化而變化，隨著根齡的增加，菌根真菌種類和數(shù)量也相應(yīng)地增加，反之，菌絲團的活力則減少。

3 討論

3.1 硬葉兜蘭菌根真菌入侵方式

顯微結(jié)構(gòu)觀察表明，硬葉兜蘭具有典型的蘭科菌根結(jié)構(gòu)。在皮層細(xì)胞內(nèi)形成菌絲結(jié)，菌絲通過穿透細(xì)胞壁侵染鄰近細(xì)胞，并再次形成菌絲結(jié)，皮層細(xì)胞中分布著大量的菌絲和菌絲團狀，前者逐漸被植物的根細(xì)胞消解、吸收，而后者會在前者消解之后形成新的菌絲團。這種菌絲被消化又重新定殖的現(xiàn)象在整個植株發(fā)育過程中不斷重復(fù)，再次驗證了菌絲團和蘭科植物之間的相互作用，進(jìn)一步肯定了蘭科植物與菌根真菌生長主要營養(yǎng)方式的理論。

丁暉等曾觀察到，在具有通道細(xì)胞的蘭科植物中，菌絲侵入時常不破壞根被，通過根毛或表皮細(xì)胞及外皮層薄壁通道細(xì)胞直徑侵入[12，14]。在對硬葉兜蘭菌根的觀察中目前只在根毛或表皮細(xì)胞中觀察到菌絲，由此可以認(rèn)為真菌是通過根毛進(jìn)入根被細(xì)胞，進(jìn)一步向通道細(xì)胞和皮層細(xì)胞入侵，但其侵入機制還須要進(jìn)一步深入研究。

3.2 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌縱向分布變化特征

據(jù)文獻(xiàn)記載，蘭科植物根尖的分生組織有蘭酚類物質(zhì)抵制真菌的侵入[15]。硬葉兜蘭菌根中部的菌根真菌數(shù)量最多，這與春蘭菌根的定植特點相同[16]，由此可以看出土壤微生物是先從根中部入侵，隨后向其兩端逐漸蔓延。硬葉兜蘭菌根中部分離到氣生菌絲發(fā)達(dá)的mycorrhizal basidiomycete菌根真菌和氣生菌絲不發(fā)達(dá)的Epulorhiza sp.、Psathyrella candolleana真菌。說明氣生菌絲發(fā)達(dá)和氣生菌絲不發(fā)達(dá)的菌株種類間不具有競爭性，是相互協(xié)同的共生作用。然而，是氣生發(fā)達(dá)菌絲先定殖根皮層細(xì)胞，還是氣生不發(fā)達(dá)菌絲先定殖根皮層細(xì)胞能更好地促進(jìn)蘭科植物的生長，維持長效的共生關(guān)系，這有待下一步的研究。

3.3 硬葉兜蘭同一根中菌根真菌橫向分布變化特征

由硬葉兜蘭3年生根菌根真菌的橫向分布的種類和數(shù)量可知，菌根真菌的分離率由外皮層向皮層細(xì)胞逐漸增加，由皮層細(xì)胞向內(nèi)皮層逐漸減少，內(nèi)皮層和中柱細(xì)胞內(nèi)沒有菌絲和菌絲團。經(jīng)過分離培養(yǎng)得出，3個層次的皮層細(xì)胞都以氣生菌絲不發(fā)達(dá)的菌株種類為主，這有助于維持菌根共生關(guān)系，不會因內(nèi)生菌生長過快而導(dǎo)致蘭科植物枯萎。

3.4 硬葉兜蘭不同根齡中菌根真菌動態(tài)變化特征

1年生和2年生分離到的5種菌株的氣生菌絲都不明顯，生長較慢，其中Psathyrella candolleana菌株為優(yōu)勢菌，此菌株在雙抗PDA培養(yǎng)基上不形成氣生菌絲且生長較慢，而3年生根分離到的Psathyrella sp.菌株在雙抗PDA培養(yǎng)基上，氣生菌絲發(fā)達(dá)，生長速度較快。硬葉兜蘭早期以生長較慢的菌根真菌為主，后期以生長較快的菌根真菌為主;早期以產(chǎn)生少量氣生菌絲為主，后期以產(chǎn)生大量氣生菌絲或氣生菌絲不明顯為主。生長慢的內(nèi)生菌侵入為生長快的內(nèi)生菌創(chuàng)造了較為適宜的生長條件，促進(jìn)生長快的內(nèi)生菌定殖。這樣的定殖方式有助于菌根真菌的協(xié)同作用，促進(jìn)和維持菌根的共生關(guān)系。

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