代謝組學(xué)技術(shù)在茶學(xué)中的應(yīng)用研究進展

戴宇樵 呂才有

摘要：代謝組學(xué)是通過考察生物體在受到外界干擾或者刺激后，其代謝產(chǎn)物變化情況或隨時間的變化情況來研究生物體系的一門學(xué)科。代謝組學(xué)作為組學(xué)技術(shù)中一門新興發(fā)展的學(xué)科，已經(jīng)成為揭示生物體系變化規(guī)律的重要手段，在微生物學(xué)、植物學(xué)和營養(yǎng)學(xué)及醫(yī)學(xué)等多個方面得到廣泛運用。對代謝組學(xué)這門學(xué)科的基本概念、技術(shù)分析手段組成等進行簡要概述，介紹代謝組學(xué)中的檢測技術(shù)在茶學(xué)中栽培、加工、功效及品質(zhì)控制等領(lǐng)域的應(yīng)用研究進展，并對代謝組學(xué)技術(shù)在未來茶產(chǎn)業(yè)中的運用展開討論。

關(guān)鍵詞：代謝組學(xué);質(zhì)譜;色譜;核磁共振;GC-MS;茶學(xué)研究;茶葉鑒定

中圖分類號： TS272 ?文獻標(biāo)志碼： A ?文章編號：1002-1302（2019）02-0024-05

組學(xué)（omics）定義為組的組成、結(jié)構(gòu)、功能及各組分之間相互作用和聯(lián)系的一門學(xué)科，主要包括基因組學(xué)（genomics）、轉(zhuǎn)錄組學(xué)（transcriptomics）、蛋白質(zhì)組學(xué)（protemics）和代謝組學(xué)（metabolomics）。組學(xué)技術(shù)（omics technology）是整合基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究思路和方法，動態(tài)地揭示系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能相互作用和運行規(guī)律的技術(shù)[1]。組學(xué)技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)在營養(yǎng)學(xué)、藥學(xué)、植物學(xué)等研究中得到廣泛應(yīng)用。

1 代謝組學(xué)概述

隨著生命科學(xué)的發(fā)展，代謝組學(xué)成為繼轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)后興起的一種組學(xué)技術(shù)。與其他組學(xué)技術(shù)不同，代謝組學(xué)是通過考察生物體在受到外界干擾或者刺激后，其代謝產(chǎn)物變化情況或隨時間的變化情況來研究生物體系的一門學(xué)科[2]。將組群指標(biāo)作為分析變化的基礎(chǔ)，用高通量檢測方法和多元數(shù)據(jù)處理將信息建模與系統(tǒng)結(jié)合起來，從而對生物體的代謝產(chǎn)物進行定性定量分析[3]。與蛋白質(zhì)或DNA等生物高分子相比，代謝組學(xué)的研究對象一般是小分子，分子質(zhì)量通常在1 000以下。代謝組學(xué)具有關(guān)注內(nèi)源性化合物的特點，能夠?qū)ι矬w系中的小分子化合物進行良好的定性定量研究，化合物的微量變化都指示了與疾病、毒性、基因修飾或環(huán)境因子有關(guān)，內(nèi)源性化合物的變化結(jié)論還具有可運用到藥物開發(fā)研究等領(lǐng)域的特點[4]?；蚝偷鞍踪|(zhì)具有相對嚴(yán)格的細(xì)胞特異性，而同一代謝物在任何物種中都具有相同的理化性質(zhì)。

在20世紀(jì)70年代初，貝勒醫(yī)學(xué)院（Baylor College of Medicine）就開展了代謝輪廓分析，主要是指用氣象色譜-質(zhì)譜（GC-MS）方法對有機酸、固醇及尿中藥物代謝物進行分析，之后代謝輪廓分析方法被廣泛應(yīng)用于尿、血等生物樣本中代謝物的定性與定量分析，此種對疾病進行篩選和診斷的方法延用至今[4]。進入20世紀(jì)80年代后，人們開始使用核磁共振和高效液相色譜技術(shù)來進行代謝輪廓的分析[5-6]。1997年，Oliver研究小組通過對酵母基因的遺傳功能分析，運用對代謝產(chǎn)物的數(shù)量來定性評估的方法，率先提出了代謝組學(xué)的概念[7]。1999年，Nicholson等提出了代謝組學(xué)的概念[8]。2000年，F(xiàn)iehn等提出了另一種代謝組學(xué)的概念，將生物體的代謝產(chǎn)物和生物基因功能聯(lián)系起來，全面、定量分析生物體系中所有代謝物，并將其應(yīng)用于植物學(xué)研究，指出每種基因型都具有一種獨特的代謝輪廓[9]。正在高速發(fā)展的代謝組學(xué)，已經(jīng)成為人類揭示生命現(xiàn)象變化規(guī)律的重要手段。

2 代謝組學(xué)研究技術(shù)

代謝組學(xué)研究需要高通量、高靈敏度且穩(wěn)定性好的分析方法。目前，主要分析手段包括核磁共振（NMR）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）、毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用（CE-MS）以及氣象色譜-質(zhì)譜等技術(shù)。

2.1 氣象色譜-質(zhì)譜技術(shù)

氣象色譜是自1952年問世以后運用較為廣泛的一種分離分析技術(shù)[10]。相對于其他代謝組學(xué)分析技術(shù)來說，GC-MS是代謝組學(xué)研究中最早應(yīng)用的分析技術(shù)之一[11]。GC-MS適合分析低沸點、低極性的揮發(fā)性代謝物或者非揮發(fā)性代謝物，如氨基酸等衍生后成為具有揮發(fā)性的物質(zhì)。由于重現(xiàn)性好、分辨率高、靈敏度高，具有大量標(biāo)準(zhǔn)代謝物譜圖庫，且儀器購置價格相對其他方法較低等特點，GC-MS是目前代謝組學(xué)的主要分析平臺之一。GC-MS的主要不足是不符合要求的樣品須要進行衍生化處理后才能夠進行分析，比如難揮發(fā)或極性較大的代謝產(chǎn)物[4]。氣象色譜能有效地分離復(fù)雜混合物，質(zhì)譜能對這些化合物進行檢測，兩者的結(jié)合使 GC-MS 聯(lián)用儀重現(xiàn)性好，性能穩(wěn)定。

2.2 液相色譜及液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

由于液相色譜的高分辨能力、質(zhì)譜的高靈敏度及其聯(lián)用后所帶來的信息量提高，液相色譜及LC-MS技術(shù)在代謝組學(xué)分析手段中占據(jù)較大比例。高效液相色譜具有分析速度快、檢測靈敏度高、分離效能高和應(yīng)用范圍廣的特點，與氣相色譜相比，更適用于大分子、高沸點和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析。目前，只有少部分樣品可以不經(jīng)過預(yù)處理就能夠很好地進行氣相色譜分離[12]。近年來，LC-MS技術(shù)也得到了高速的發(fā)展，采用這種方法，可以簡化樣品的預(yù)處理，縮短對靶標(biāo)化合物進行檢測的時間，能夠同時分析復(fù)雜基質(zhì)中結(jié)構(gòu)相似的化合物，同時還可以對生物樣品中已知或未知的化合物進行測定。

2.3 超高效液相色譜-質(zhì)譜技術(shù)

隨著液相色譜分析對象的復(fù)雜化，高效液相色譜（HPLC）也須要做出更多的改進。超高效液相色譜與液相色譜相比，首先在分離性上有一定優(yōu)勢，分離度、分離速度、靈敏度、高背壓明顯提高;同時超高效液相色譜（UPLC）有更好的峰容量、靈敏度及分離效率，提供與質(zhì)譜聯(lián)用更適合的接口，使更多的代謝物更容易被檢出，方法通量、靈敏度提高，能改善與質(zhì)譜聯(lián)用定性定量的分析結(jié)果。超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用能為代謝組學(xué)研究提供更靈敏、更高效的平臺。

2.4 毛細(xì)管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

毛細(xì)管電泳技術(shù)誕生于20世紀(jì)80年代的液相分離分析技術(shù)，以高壓直流電場為驅(qū)動力、以毛細(xì)管為分離通道，并且將現(xiàn)代微柱分離技術(shù)與經(jīng)典電泳技術(shù)高效結(jié)合。在代謝組學(xué)分析樣品中含有許多離子性代謝物，如核苷酸、羧酸等，這些離子性代謝物不容易在反相色譜柱上停留，因技術(shù)原因不適合與質(zhì)譜聯(lián)用，因此HPLC-MS不適合離子性代謝物的分析。而毛細(xì)管電泳利用離子化合物質(zhì)荷比不同來形成不同的遷移速率從而實現(xiàn)分離，因此CE-MS特別適合分析離子性代謝物[4]。1978年，CE-MS技術(shù)被首次報道[13]。之后又分別建立了陽離子代謝物、陰離子代謝物及多價陰離子代謝物的CE-MS分析方法[14-16]。

2.5 核磁共振技術(shù)

核磁共振技術(shù)是一種基于具有自旋性質(zhì)的原子核在核外磁場作用下，吸收射頻輻射而產(chǎn)生能級躍遷的譜學(xué)技術(shù)。生命科學(xué)領(lǐng)域中常用的是氫譜（1H NMR）、碳譜（13C NMR）及磷譜（31P NMR）3種，可用于體液或組織提取液和活體分析兩大類，其中以1H NMR應(yīng)用最為廣泛[3]。從1924年開始，有研究團隊預(yù)測到某些原子核具有自旋角動量和磁矩，由此產(chǎn)生了關(guān)于NMR早期的理論基礎(chǔ)，到了20世紀(jì)90年代初，高場核磁共振波譜儀相繼問世，直到現(xiàn)在高場核磁共振、超低溫探頭及色譜和核磁共振聯(lián)用等技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用[11]。這種相對較新的組學(xué)技術(shù)利用生物體液核磁共振譜圖所提供的生物體內(nèi)全部小分子代謝物的豐富信息，然后對這些信息進行多元統(tǒng)計分析和模式識別處理，發(fā)現(xiàn)相關(guān)生物體在藥理毒理學(xué)、功能基因組學(xué)等方面的狀況及動態(tài)變化和它們所要揭示的生物學(xué)意義，并從分子水平來認(rèn)識生命運動的規(guī)律。

3 代謝組學(xué)在茶學(xué)研究中的應(yīng)用

隨著人們?nèi)粘Ｉ顚Σ枞~需求量的增加，對茶葉品質(zhì)要求以及安全性的要求也越來越高，科學(xué)研究技術(shù)的快速發(fā)展使檢測改善茶各方面品質(zhì)的手段越來越多，檢測范圍也越來越全面，在茶葉的內(nèi)含物質(zhì)、香氣、色澤以及農(nóng)殘等方面都有了較為成熟的檢測方法。植物代謝組學(xué)是代謝組學(xué)的一個重要分支，是對植物的某一組織或細(xì)胞在特定生理時期內(nèi)所有低分子量代謝產(chǎn)物同時進行定性和定量分析[17]。目前，代謝組學(xué)技術(shù)也已被大量運用到茶產(chǎn)業(yè)的各個環(huán)節(jié)中，利用代謝組學(xué)可以更全面地了解茶葉從栽培到加工再到品飲過程中內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律，揭示茶葉風(fēng)味形成的原因，健全茶葉安全性保障。

3.1 代謝組學(xué)在茶樹栽培生長中的應(yīng)用

茶樹栽培從最根本上決定了茶葉品質(zhì)的好壞，在茶樹栽培和生長過程中利用代謝組學(xué)能更好地解決茶樹生長發(fā)育過程中的品質(zhì)及安全性問題。在了解優(yōu)化茶樹客觀生長環(huán)境方面，郝亞利用不同的光質(zhì)對茶鮮葉進行處理，并用GC-MS、HPLC進行檢測，主成分分析（PCA）、偏最小二乘（PLS）方法進行數(shù)據(jù)處理，最后發(fā)現(xiàn)，不同葉齡的茶鮮葉有機相成分差異較大，并且用不同的光質(zhì)進行處理結(jié)果也會不同[18]。在茶樹農(nóng)殘與微量元素等控制檢測中，代謝組學(xué)也發(fā)揮了很大的作用。田艷玲等用高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測了茶葉中多菌靈的殘留量[19]。王凱研究了茶樹栽培中不同形態(tài)的氮素對茶葉氮代謝中有效內(nèi)含物質(zhì)的多方面影響，從茶樹生長過程中元素的變化角度來探究茶葉品質(zhì)的形成原因，為之后茶園的施肥管理提供了理論依據(jù)[20]。運用GC-MS檢測技術(shù)和PCA數(shù)據(jù)分析，為茶樹的合理施肥以及茶葉的品質(zhì)調(diào)控奠定了一定基礎(chǔ)。王敏等用GC-MS與 LC-MS技術(shù)檢測了茶葉中的農(nóng)殘含量[21-22]。賈瑋等利用LC-MS技術(shù)建立了鑒定茶葉中290種農(nóng)藥的多殘留分析方法[23]。王麗霞等研究了不同氟濃度處理對茶葉內(nèi)含物質(zhì)和香氣成分的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氟處理對兒茶素類、咖啡堿含量有消極影響，GC-MS分析得出不同濃度的氟處理對香氣成分影響變化也會不同[24]。韓璐等采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對茶葉中的農(nóng)殘進行了快速篩查[25]。代謝組學(xué)在茶樹栽培生長中內(nèi)含物質(zhì)與特殊有毒物質(zhì)的檢測方面也有較多運用。李春芳在研究茶樹中次生代謝產(chǎn)物的合成及基因表達中運用GC-MS技術(shù)檢測分析不同時期茶樹中葉綠素的含量[26]。羅學(xué)平等運用固相微萃取結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（SPME-GC/MS）聯(lián)用技術(shù)來檢測不同茶樹品種中的茶葉香氣以及茶花的香氣[27-28]。馮德建等針對茶葉中出現(xiàn)的高氯酸鹽污染問題，建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀測定方法，更高效、準(zhǔn)確地測定了高氯酸鹽含量[29]。何正和等運用GC-MS技術(shù)快速測定了茶葉中的蒽醌[30]。米雨荷運用UPLC技術(shù)檢測了茶葉中的生物胺含量，為解決茶樹栽培過程中遇到的問題提供了一定的技術(shù)支撐[31]。賴國銀等采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間質(zhì)譜（Q-TOF/MS）技術(shù)定性分析了茶葉籽中的酚類化合物，發(fā)現(xiàn)此種方法快速、準(zhǔn)確、可靠;從栽培環(huán)節(jié)對內(nèi)含物質(zhì)含量實施全面檢測，使接下來茶葉品質(zhì)的形成得到了最根本的保障[32]。在其他方面，代謝組學(xué)也能夠探索茶樹栽培中的更多新品種、新方法。龔雪等為更好地開發(fā)和利用黔茶新品種，采用頂空固相微萃取氣-質(zhì)聯(lián)用法（HS-SPME/GC-MS）分析不同黔茶品種與福鼎大白茶綠茶的揮發(fā)性成分，為更好地開發(fā)和利用黔茶新品種奠定了理論基礎(chǔ)[33]。

3.2 代謝組學(xué)在茶葉品種分類鑒別中的應(yīng)用

運用代謝組技術(shù)可以更準(zhǔn)確地鑒定茶樹、茶葉品種，為茶產(chǎn)業(yè)的各個環(huán)節(jié)提供更精準(zhǔn)的理論基礎(chǔ)，并且在綠茶、紅茶、烏龍茶、白茶及普洱茶中都得到了良好的運用。王麗鴛等運用代謝組學(xué)中建立化學(xué)指紋模式圖譜分析方法對浙江杭州、麗水等多個地區(qū)的不同品種綠茶和武夷巖茶等茶類進行代謝組學(xué)分析得出，采用化學(xué)指紋圖譜方法結(jié)合判別技術(shù)對茶葉的品種與產(chǎn)地進行合理鑒別或驗證分析多種茶類品種是可行的[34-38]。李萬春用衍生化GC-MS方法對綠茶、白茶、烏龍茶及紅茶進行代謝組學(xué)研究，分析結(jié)果表明，4種不同的茶葉在不同發(fā)酵程度下代謝組學(xué)分析結(jié)果有明顯差異[39]。呂海鵬等運用GC-MS檢測揮發(fā)性成分來比較不同等級普洱茶的化學(xué)成分及抗氧化活性[40]。徐歡歡等通過高效液相色譜法測定不同紅茶中γ-氨基丁酸（GABA）、L-茶氨酸和L-谷氨酸含量，為后期的試驗提供了精準(zhǔn)的理論基礎(chǔ)[41]。賀群等采用GC-MS來測定茶鮮葉中的香氣成分與含量，研究結(jié)果為不同香型的適制綠茶品種和其他特殊要求品種的選育提供了理論依據(jù)[42]。

3.3 代謝組學(xué)在茶葉加工工藝優(yōu)化中的應(yīng)用

加工工藝是影響茶葉品質(zhì)的重要環(huán)節(jié)，目前簡單的常規(guī)檢測還不能夠在加工線上或線下全面探索工藝與品質(zhì)的關(guān)系，代謝組學(xué)分析方法可以更深入地了解茶葉在加工過程中所發(fā)生的變化。王秀梅為解釋祁門紅茶品質(zhì)形成的機制，用代謝組學(xué)對每一步加工環(huán)節(jié)的樣品進行全面檢測，清楚了解了揮發(fā)性成分、糖類物質(zhì)、氨基酸和多酚類物質(zhì)的變化規(guī)律[43]。趙峰等通過試驗證實近紅外光譜分析方法在武夷巖茶生產(chǎn)過程中實際在線檢測應(yīng)用的可行性[44]。解東超等運用LC-MS進行紫娟烘青綠茶加工過程中花青素變化規(guī)律研究，為紫娟綠茶加工工藝的優(yōu)化奠定了理論基礎(chǔ)[45]。米雨荷用同種原料不同加工工藝的茶葉中生物胺含量來進行加工工藝優(yōu)化[31]。伍崗等運用SPME-GC-MS測定4種云南茶的香氣成分，并對加工工藝進行評價[46]。邸太妹等同樣運用HS-SPME/GC-MS探索了茶鮮葉、殺青葉、烘干葉中香氣成分的變化規(guī)律[47]。秦俊哲等利用HPLC研究人工接種條件下茯磚茶中咖啡堿和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）的檢測條件及含量，以此來進行加工工藝評價[48]。代謝組學(xué)技術(shù)在加工環(huán)節(jié)中對內(nèi)含物質(zhì)變化的快速檢測與對不同工藝制作茶樣的內(nèi)含物質(zhì)進行全面準(zhǔn)確檢測，這都為茶葉加工過程中的工藝優(yōu)化、改良茶葉品質(zhì)奠定了堅實的理論依據(jù)。

3.4 代謝組學(xué)在茶葉品質(zhì)控制中的應(yīng)用

茶葉品質(zhì)由茶葉內(nèi)含物質(zhì)所決定，準(zhǔn)確、全面地測定茶葉內(nèi)含物質(zhì)的變化及含量，探索茶葉品質(zhì)形成的原因，是優(yōu)化茶葉品質(zhì)的關(guān)鍵。夏文娟研究了毛細(xì)管電泳分析茶黃素類和茶多酚的方法與應(yīng)用，為茶葉品質(zhì)檢測和深加工研究奠定了理論基礎(chǔ)[49]。譚和平等探索分析了在茶葉生化成分研究中，核磁共振技術(shù)所具有的優(yōu)勢與局限性[50]。裴亭用HPLC測定了茶葉中的煙酸含量，為茶葉的營養(yǎng)價值評定提供了依據(jù)[51]。譚超等運用魔角旋轉(zhuǎn)交叉極化固體核磁共振儀（CP-MAS NMR）來進行普洱茶茶褐素類主要組分特征及光譜學(xué)性質(zhì)研究，為普洱茶功能性研究奠定了理論基礎(chǔ)[52]。馬曉年等運用毛細(xì)管電泳法測定茶葉中兒茶素、表兒茶素、原兒茶酸、原兒茶醛、楊梅素和槲皮素等化合物含量[53-54]。劉曉莎等利用核磁共振波譜技術(shù)檢測茶湯的水浸出物，發(fā)現(xiàn)水浸出物與沖泡次數(shù)之間的變化規(guī)律;與多變量統(tǒng)計方法相結(jié)合，研究不同香型鐵觀音茶葉的水浸出物在內(nèi)含物組成上的差異，可精準(zhǔn)了解酚類物質(zhì)與糖類物質(zhì)的變化規(guī)律[55]。胡燕等應(yīng)用高效液相色譜法研究四川黑茶的指紋圖譜，通過試驗進一步建立四川黑茶的HPLC指紋圖譜，可更精準(zhǔn)地鑒定和評價除方包茶之外的四川黑茶[56]。鄭起帆通過對不同茶山普洱生茶的代謝物差異研究發(fā)現(xiàn)，運用1H-NMR結(jié)合偏最小二乘法-判別分析（sPLS-DA）的方法具有良好的效果，為普洱茶品質(zhì)評價找到新方向[57]。在測定內(nèi)含物質(zhì)時，HPLC、NMR等方法都能進行快速準(zhǔn)確且具有深度的測定，而在對茶葉香氣進行評價時，GC-MS對于揮發(fā)性物質(zhì)的檢測更為精準(zhǔn)。劉盼盼等總結(jié)發(fā)現(xiàn)，GC-MS是目前對茶葉香氣檢測最為準(zhǔn)確、全面的方法[58]。劉洪林等在測定茶葉內(nèi)含物質(zhì)時均采用HPLC或LC-MS技術(shù)[59-61]。湯莎莎等運用HS-SPME/GC-MS技術(shù)測定了烏牛早茶的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)[62]。

3.5 代謝組學(xué)在茶葉產(chǎn)地、年份鑒別中的應(yīng)用

代謝組學(xué)在幫助人們準(zhǔn)確全面了解茶葉的同時，為茶葉產(chǎn)地與年份的鑒別提供了技術(shù)支撐。周黎等通過運用GC-MS分析普洱茶揮發(fā)性物質(zhì)來區(qū)別不同貯藏年份的普洱茶，為普洱茶年份的鑒定奠定了理論基礎(chǔ)[63]。寧井銘等分別采用傅里葉變換紅外光譜技術(shù)對普洱茶、六堡茶、信陽毛尖及恩施玉露茶進行年份鑒別，表明此種技術(shù)的可行性[64-68]。劉順航等運用HPLC對不同年份的茶珍進行了鑒別[69]。

4 展望

生活水平的不斷提高，為茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了積極影響，伴隨著科技研究技術(shù)的進步，人們對于茶這種多元化產(chǎn)品的認(rèn)知手段也越來越多，代謝組學(xué)作為一門同樣覆蓋多方面領(lǐng)域的學(xué)科，對茶葉從栽培到加工再到最后的品飲及多元化深加工環(huán)節(jié)中都可以進行相對較全面、準(zhǔn)確、快速測定，使人們了解每一環(huán)節(jié)中茶葉所發(fā)現(xiàn)的內(nèi)含物質(zhì)變化規(guī)律，從最基礎(chǔ)的物質(zhì)代謝層面去認(rèn)識茶葉。在將代謝組學(xué)技術(shù)運用到茶科學(xué)領(lǐng)域時，除了探索代謝組學(xué)技術(shù)更多范圍的運用外，還可加強與其他組學(xué)技術(shù)（基因組學(xué)、蛋白組學(xué)）的聯(lián)合運用，從基因、RNA、代謝物變化等多方面掌握茶葉的變化規(guī)律，結(jié)合更多的研究技術(shù)分析手段為茶產(chǎn)業(yè)的深入快速發(fā)展找到新的方向。

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