米根霉復(fù)合誘變篩選高產(chǎn)L-乳酸的形態(tài)突變菌株及碳代謝流分析

孫小龍 付永前

摘要：以米根霉（Rhizopus oryzae）NRRL 395為出發(fā)菌株，通過(guò)紫外線與亞硝基胍（nitroso-guanidin，簡(jiǎn)稱NTG）復(fù)合誘變，篩選出幾株形態(tài)突變株，其L-乳酸產(chǎn)量較高，在此基礎(chǔ)上，對(duì)得到的3株形態(tài)突變菌株LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3和出發(fā)菌株NRRL 395進(jìn)行代謝流分析。結(jié)果表明，在發(fā)酵初期，不同菌種的碳代謝流整體變化差別并不明顯，尤其是流向有機(jī)酸合成的碳源所占的比例基本相同，此時(shí)細(xì)胞更多地合成生物量以及代謝所需的蛋白，對(duì)于球狀菌體，其流向生物合成所需的碳相對(duì)較多;當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入后期，碳流更多地用于有機(jī)酸的合成，而此時(shí)，不同菌體形態(tài)的碳代謝流明顯發(fā)生變化，均勻球狀菌體更有利于碳代謝流的流動(dòng)，尤其是LA-UN-1球狀菌體碳代謝流更易于流向L-乳酸合成途徑，而原始菌株流向L-乳酸合成途徑的碳流最小。

關(guān)鍵詞：米根霉;L-乳酸;碳代謝流;形態(tài)突變菌株;誘變選育

中圖分類號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2019）01-0294-05

乳酸是世界上公認(rèn)的三大有機(jī)酸之一，用途極為廣泛。乳酸作為一種古老而重要的有機(jī)酸，自1780年首次被發(fā)現(xiàn)至今，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、化工等方面[1-3]。按其構(gòu)型及旋光性可分為L(zhǎng)-乳酸、D-乳酸、DL-乳酸等3類。L-乳酸是一種重要的天然有機(jī)酸[4]，世界上對(duì)L-乳酸的需求量在逐年上升，增長(zhǎng)率高達(dá)15%，尤其近幾年，人們利用L-乳酸聚合生成聚乳酸（polylactic acid，簡(jiǎn)稱PLA），用以解決日益嚴(yán)重的環(huán)境污染問(wèn)題，具有重大意義[5-6]。當(dāng)前，L-乳酸生產(chǎn)方法分為發(fā)酵法、合成法和酶法，發(fā)酵法一般是以玉米、大米、甘薯等淀粉質(zhì)為原料，經(jīng)微生物綜合利用代謝而成[7]。米根霉（Rhizopus oryzae）由于合成L-乳酸光學(xué)純度高，而被越來(lái)越多地應(yīng)用于L-乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)中，但米根霉發(fā)酵由于其菌體形態(tài)不穩(wěn)定而影響其應(yīng)用。球狀菌體作為米根霉合成L-乳酸的潛在形態(tài)而越來(lái)越引起人們的關(guān)注，針對(duì)菌球形態(tài)控制的研究也越來(lái)越廣泛[8-9]。目前，大量文獻(xiàn)報(bào)道，絲狀真菌的菌體形態(tài)受遺傳因素控制[10-12]。在此基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)嘗試?yán)米贤饩€和亞硝基胍（nitroso-guanidin，簡(jiǎn)稱NTG）復(fù)合誘變，篩選有利于L-乳酸高產(chǎn)的形態(tài)突變株，并深層次探討L-乳酸高產(chǎn)形態(tài)突變菌株、出發(fā)菌株在不同階段的代謝流變化，以期為米根霉形態(tài)的基因調(diào)控研究提供經(jīng)驗(yàn)和借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種 米根霉（Rhizopus oryzae）出發(fā)菌株NRRL 395，由臺(tái)州學(xué)院生物質(zhì)資源研究所保藏。

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，簡(jiǎn)稱PDA）培養(yǎng)基：稱取200 g去皮馬鈴薯，切塊煮沸30 min，用雙層紗布過(guò)濾，向?yàn)V液中添加20 g葡萄糖和20 g瓊脂，補(bǔ)水至1 000 mL，于121 ℃滅菌30 min。種子培養(yǎng)基：30 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.2 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O。發(fā)酵培養(yǎng)基：100 g/L葡萄糖，4 g/L蛋白胨，0.2 g/L KH2PO4，0.2 g/L MgSO4·7H2O。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)條件與方法 將米根霉NRRL 395接種于PDA斜面培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，取培養(yǎng)好的斜面菌種，用無(wú)菌生理鹽水洗脫孢子，接入三角瓶中，30 ℃、200 r/min振蕩30 min，打碎孢子團(tuán)塊與孢子囊，使孢子充分散開(kāi)，經(jīng)無(wú)菌脫脂棉過(guò)濾，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整孢子濃度為106個(gè)/mL;取1 mL孢子液接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的 250 mL 三角瓶中，于30 ℃、200 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng)24 h得到種子液;種子液接入5 L發(fā)酵罐（購(gòu)自上海保興生物設(shè)備工程有限公司）進(jìn)行發(fā)酵。發(fā)酵條件：溫度為30 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速為200 r/min，裝液量為3 L，接種量為10%，通氣量為 1.0 L/min，pH值用CaCO3控制在5.5～6.0范圍內(nèi)。

1.2.2 復(fù)合誘變選育 采用紫外線與NTG進(jìn)行復(fù)合誘變選育，具體參考文獻(xiàn)[13]。首先取0.5 mL孢子液，均勻涂布在直徑為90 mm無(wú)菌培養(yǎng)皿上，用無(wú)菌風(fēng)風(fēng)干后，在30 W紫外燈下照射20 min，照射高度為20 cm;然后用0.5 mL生理鹽水洗脫，洗脫的孢子懸濁液用濃度為100 g/mL的磷酸鹽緩沖液（pH值為7.0）在30 ℃條件下處理60 min。最后把反應(yīng)液均勻涂布在配好的PDA培養(yǎng)基平板上，30 ℃培養(yǎng)2～4 d，生長(zhǎng)出的米根霉菌體成熟后洗脫進(jìn)行種子和發(fā)酵培養(yǎng)，進(jìn)而篩選菌體形態(tài)和L-乳酸高產(chǎn)菌種。

1.3 代謝流網(wǎng)絡(luò)模型建立

細(xì)胞大分子物質(zhì)（糖、脂類、蛋白質(zhì)） 涉及的代謝網(wǎng)絡(luò)非常復(fù)雜，要建立一個(gè)完整的網(wǎng)絡(luò)是比較困難的，因此作簡(jiǎn)化處理。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[14-17]、米根霉的生化反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)[18]以及京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，簡(jiǎn)稱KEGG）等數(shù)據(jù)庫(kù)資源，結(jié)合米根霉的生長(zhǎng)代謝特性，建立米根霉利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)乳酸的反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)及其代謝流網(wǎng)絡(luò)模型（圖1），其中包括主要的碳骨架代謝途徑。

構(gòu)建代謝網(wǎng)絡(luò)模型時(shí)作出以下簡(jiǎn)化和假設(shè)：（1）只考慮主要中心碳代謝反應(yīng)的物流平衡;（2）對(duì)于中間代謝物的代謝庫(kù)采用擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)，即瞬間濃度變化速率為0;（3）幾個(gè)連續(xù)且無(wú)分支點(diǎn)的反應(yīng)簡(jiǎn)化成1個(gè)反應(yīng)式，所有反應(yīng)方程包括生物量合成的過(guò)程均按固定比例進(jìn)行;（4）能量供需平衡，即維持生物量與產(chǎn)物生成反應(yīng)途徑中消耗的能量與糖酵解途徑（又稱EMP途徑，embden-meyerhof-parnas pathway，簡(jiǎn)稱EMP途徑）、三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，簡(jiǎn)稱TCA）產(chǎn)生的能量總數(shù)相等，輔酶Ⅰ（nicotinamide adenine dinucleotide，簡(jiǎn)稱NADH）與還原型核素二核苷酸（flavine adenine dinucleotide，簡(jiǎn)稱FADH2）都可以通過(guò)電子傳遞鏈生產(chǎn)腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，簡(jiǎn)稱ATP）;（5）菌體組分，如DNA、RNA、蛋白質(zhì)等大分子的合成途徑使用米曲霉反應(yīng)模型[11]，在磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，簡(jiǎn)稱PPP）的中間代謝產(chǎn)物中亦有流向大分子的流量，但由于與其他標(biāo)出的途徑相比流量甚微，因此忽略不計(jì);（6）葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞時(shí)須消耗ATP;（7）TCA作為主要的能源提供途徑，其中間代謝物的積累可以忽略不計(jì)。模型中包含的反應(yīng)如表1所示。整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)含有53個(gè)反應(yīng)，44個(gè)中間代謝物，此時(shí)自由度為9。該代謝網(wǎng)絡(luò)中有6個(gè)可測(cè)速率，即葡萄糖消耗速率以及乳酸、富馬酸、乙醇和生物量的生成速率，加上二氧化碳的含量變化速率。由于可測(cè)定的速率數(shù)量小于自由度，通過(guò)Matlab 7.5軟件求解代謝分布。在此代謝網(wǎng)絡(luò)中，葡萄糖作為碳源被細(xì)胞吸收，因此在代謝通量的計(jì)算中，將不同時(shí)間段初始葡萄糖利用的比值定義為100。

1.4 分析方法

發(fā)酵液的預(yù)處理：每隔一段時(shí)間對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行取樣，于高速離心機(jī)上3 000 r/min離心10 min，分離得到上清液用于成分的檢測(cè);葡萄糖、L-乳酸、富馬酸、蘋果酸、乙醇、CO2的檢測(cè)方法參考文獻(xiàn)[13]。細(xì)胞干質(zhì)量測(cè)定：對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行過(guò)濾，用蒸餾水洗滌2～3次，置于60 ℃恒溫鼓風(fēng)干燥箱至烘干至恒質(zhì)量，用電子天平稱質(zhì)量。菌體電鏡觀察方法參考文獻(xiàn)[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)合誘變處理米根霉NRRL 395菌株

利用紫外線和NTG復(fù)合誘變處理出發(fā)菌株NRRL 395。誘變處理過(guò)后，經(jīng)過(guò)初篩和復(fù)篩，篩選出高產(chǎn)L-乳酸的形態(tài)突變株，這些菌株與出發(fā)菌株NRRL 395相比，在相同的培養(yǎng)條件下易形成球狀菌體，并且L-乳酸含量比出發(fā)菌株高，進(jìn)一步對(duì)這幾株菌株的菌體形態(tài)進(jìn)行電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，其球狀菌體形態(tài)在微觀環(huán)境下各異（圖2），LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3等3株菌株的菌球形態(tài)較為規(guī)則，近乎圓形;LA-UN-4、LA-UN-5、LA-UN-6等3株菌株的形態(tài)偏向于橢圓形，而且形態(tài)越來(lái)越不規(guī)則;LA-UN-7、LA-UN-8等2株菌株的菌球形態(tài)較為松散，基本呈現(xiàn)放射狀;另外，在菌球周邊菌絲分布上，LA-UN-1菌株形成的菌球較為光滑，菌絲分散較少，其他菌株的菌球周邊菌絲呈不同程度的放射狀，尤以LA-UN-7、LA-UN-8最為明顯。與此同時(shí)，對(duì)以上8株菌株與出發(fā)菌株進(jìn)行乳酸發(fā)酵試驗(yàn)。觀察發(fā)現(xiàn)，其乳酸產(chǎn)量差別較大，其中LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 等3株菌株的乳酸產(chǎn)量相對(duì)較高，最高均達(dá)到 40 g/L 以上，均高于原始菌株，而其他5株菌株，雖然也成球狀菌體，但乳酸產(chǎn)量都偏低。對(duì)LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 等3株菌株在相同條件下培養(yǎng)得到的菌體進(jìn)行乳酸發(fā)酵并進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，LA-UN-1菌株的產(chǎn)酸能力要明顯高于LA-UN-2、LA-UN-3菌株（圖3），且LA-UN-1傳10代后，其乳酸產(chǎn)量以及菌球形態(tài)并未發(fā)生較大變化。

本試驗(yàn)利用紫外輻射和亞硝基胍復(fù)合誘變產(chǎn)乳酸的米根霉野生菌株NRRL 395，得到形態(tài)突變菌株LA-UN-1，該菌株培養(yǎng)易形成直徑在1.0～1.4 mm之間的球形菌體，在該菌株培養(yǎng)形態(tài)下，L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)到59.5 g/L，比野生株產(chǎn)量提高54.5%。雖然，在之前的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，不同的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基、pH值等對(duì)菌體的形態(tài)都有影響，然而在篩選乳酸高產(chǎn)突變株的過(guò)程中，意外地發(fā)現(xiàn)通過(guò)紫外線和NTG誘變，同樣可以得到形態(tài)突變菌株。從而，進(jìn)一步驗(yàn)證了通過(guò)誘變選育手段，同樣可得到形態(tài)誘變菌株。因此，可以進(jìn)一步推測(cè)，生物個(gè)體發(fā)育與基因有序的選擇性表達(dá)有關(guān)，許多變異的產(chǎn)生都是由于基因表達(dá)的變化所致，因此，通過(guò)比較同一類細(xì)胞給予不同刺激而產(chǎn)生的差異表達(dá)基因，可為揭示形態(tài)變化規(guī)律，探索菌體形態(tài)形成機(jī)制提供強(qiáng)有力的依據(jù)。

2.2 誘變菌株與出發(fā)菌株的代謝流分析

以選育所得到3株菌株LA-UN-1、LA-UN-2、LA-UN-3 和出發(fā)菌株NRRL 395進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，并對(duì)發(fā)酵 24 h 后以及發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行代謝流分析。由圖4-A可知，在發(fā)酵初期，碳源的整體變化差別并不是很明顯，尤其是流向有機(jī)酸合成的碳源所占的比例基本相同，而此時(shí)，碳源流向生物大分子物質(zhì)的流量多一些，無(wú)論是氨基酸、核酸，還是碳水化合物或脂類均明顯大于發(fā)酵后期，說(shuō)明在發(fā)酵前期， 細(xì)胞更多地合成生物量以及代謝所需的蛋白， 且此時(shí)細(xì)胞中參與生物量積累反應(yīng)須要消耗大量的能量和小分子物質(zhì)，如氨基酸、核苷酸等。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，對(duì)于球狀菌體，其流向生物合成所需的碳流量相對(duì)較多，也可能是菌球在聚集過(guò)程中，需要更多的物質(zhì)來(lái)參與聚集反應(yīng)。

從圖4-B中可以看出，發(fā)酵后期流向生物大分子的碳流與發(fā)酵前期相比明顯減少，而有機(jī)酸合成的碳流逐漸增加，由此可見(jiàn)，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入指數(shù)期后，碳流更多地用于有機(jī)酸的合成，而此時(shí)，不同菌體形態(tài)的碳流明顯發(fā)生變化，流向乳酸的碳流在球狀菌體下，尤其是LA-UN-1菌株培養(yǎng)的菌球最大，而原始菌株流向乳酸的碳流最小，與最大碳流相比，減少44%以上，而此時(shí)流向生物大分子的碳流相差不大。因此，筆者進(jìn)一步分析認(rèn)為，其原因可能是球狀菌體在發(fā)酵前期，菌體合成了更多有利于乳酸合成的生物大分子或環(huán)境，其具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)利用紫外輻射和亞硝基胍復(fù)合誘變產(chǎn)乳酸的米根霉野生菌株NRRL 395，得到形態(tài)突變菌株LA-UN-1，該菌株培養(yǎng)易形成直徑在1.0～1.4 mm之間的球形菌體，在該菌株培養(yǎng)形態(tài)下，L-乳酸發(fā)酵產(chǎn)量最高達(dá)到59.5 g/L，比野生株產(chǎn)量提高了54.5%;在擬穩(wěn)態(tài)的假設(shè)基礎(chǔ)上，根據(jù)乳酸合成涉及到的生化過(guò)程以及菌體生長(zhǎng)、產(chǎn)物的代謝過(guò)程，構(gòu)建米根霉的乳酸代謝網(wǎng)絡(luò)數(shù)學(xué)模型，并對(duì)誘變菌株和出發(fā)菌株進(jìn)行代謝流對(duì)比分析;菌種在發(fā)酵初期，球狀菌體流向生物合成所需的碳流量相對(duì)較多。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入指數(shù)期后，LA-UN-1流向乳酸的碳流最大，而原始菌株流向乳酸的碳流最小。不同的培養(yǎng)條件如培養(yǎng)基、pH值等對(duì)菌體的形態(tài)都有影響，因此針對(duì)下一步的研究，可以通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基改變菌體形態(tài)，以提高乳酸的產(chǎn)量，培養(yǎng)基的組分可以影響發(fā)酵產(chǎn)物的濃度、轉(zhuǎn)化率、生產(chǎn)強(qiáng)度等。因此，可以采用單因子試驗(yàn)、Placket-Burman設(shè)計(jì)和中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)對(duì)改組后的優(yōu)良菌株進(jìn)行培養(yǎng)基優(yōu)化，以提高L-乳酸的產(chǎn)率和對(duì)糖的轉(zhuǎn)化率并降低發(fā)酵成本，為該菌株的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]齊宏秀. 乳酸的應(yīng)用及生產(chǎn)情況[J]. 遼寧化工，1996（1）：20-21.

[2]曹本昌，徐建林. L-乳酸研究綜述[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè)，1993（3）：56-61.

[3]王博彥，金其榮. 發(fā)酵有機(jī)酸生產(chǎn)與應(yīng)用手冊(cè)[M]. 北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2000：30-36.

[4]Ruengruglikit C，Hang Y D. L（+）-Lactic acid production from corncobs by Rhizopus oryzae NRRL-395[J]. LWT - Food Science and Technology，2003，36（6）：573-575.

[5]李學(xué)梅，林建平，李紹壯. 固定化米根霉電滲析發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的研究[J]. 食品科學(xué)，1996，17（9）：12-16.

[6]喬長(zhǎng)晟，湯鳳霞，蘇建宇，等. L-乳酸高產(chǎn)菌株的誘變選育[J]. 食品工業(yè)科技，2002，23（2）：35-38.

[7]Eiteman M A，Ramalingam S. Microbial production of lactic acid[J]. Biotechnology Letters，2015，37（5）：955-972.

[8]Fu Y Q，Yin L F，Zhu H Y，et al. Effects of pellet characteristics on L-lactic acid fermentation by R. oryzae：pellet morphology，diameter，density，and interior structure[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology，2014，174（6）：2019-2030.

[9]Liao W，Liu Y，F(xiàn)rear C，et al. A new approach of pellet formation of a filamentous fungus -Rhizopus oryzae[J]. Bioresource Technology，2007，98（18）：3415-3423.

[10]Meyer V，Arentshorst M，F(xiàn)litter S J，et al. Reconstruction of signaling networks regulating fungal morphogenesis by transcriptomics[J]. Eukaryotic Cell，2009，8（11）：1677-1691.

[11]Riquelme M. Tip growth in filamentous fungi：a road trip to the apex[J]. Annual Review of Microbiology，2013，67（1）：587-609.

[12]Brody S，Tatum E L. Phosphoglucomutase mutants and morphological changes in Neurospora crassa[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1967，58（3）：923-930.

[13]Bai D M，Zhao X M，Li X G，et al. Strain improvement of Rhizopus oryzae for over-production of L（+）-lactic acid and metabolic flux analysis of mutants[J]. Biochemical Engineering Journal，2004，18（1）：41-48.

[14]Schmidt C G，F(xiàn)urlong E B. Effect of particle size and ammonium sulfate concentration on rice bran fermentation with the fungus Rhizopus oryzae[J]. Bioresource Technology，2012，123：36-41.

[15]Xu Q，Li S，F(xiàn)u Y，et al. Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production[J]. Bioresource Technology，2010，101（15）：6262-6264.

[16]Maas R H W，Springer J，Eggink G，et al. Xylose metabolism in the fungus Rhizopus oryzae：effect of growth and respiration on L（+）-lactic acid production[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology，2008，35（6）：569-578.

[17]Pitknen J P，Aristidou A，Salusjrvi L，et al. Metabolic flux analysis of xylose metabolism in recombinant Saccharomyces cerevisiae using continuous culture[J]. Metabolic Engineering，2003，5（1）：16-31.

[18]Wright B E，Longacre A，Reimers J. Models of metabolism in Rhizopus oryzae[J]. Journal of Theoretical Biology，1996，182（3）：453-457.

[19]Fu Y Q，Li S，Zhu H Y，et al. Removal of cadmium（II） by mycelial pellet of Rhizopus oryzae from aqueous solution[J]. Asian Journal of Chemistry，2012，24（11）：5313-5318.孫莉娟，徐 陽(yáng)， 魯?shù)陆穑? 江蘇省單季稻生育期內(nèi)極端氣候事件的分區(qū)變化[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（1）：299-303.