基于代謝組學(xué)研究新生兒黃疸患者及對(duì)藍(lán)光治療的反應(yīng)

池敏珊 柯美容 張曉敏

【摘要】 目的：探討新生兒黃疸患者光照前后血清代謝譜學(xué)變化，為進(jìn)一步研究新生兒黃疸和光療反應(yīng)代謝譜學(xué)提高依據(jù)。方法：選取本院30例新生兒黃疸患者為新生兒黃疸組，25例健康新生兒為正常對(duì)照組。運(yùn)用核磁共振（NMR）的代謝組學(xué)方法來(lái)研究生兒黃疸組光療前后與正常對(duì)照組的血清代謝譜差異。數(shù)據(jù)通過(guò)多因素的主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）進(jìn)行處理。結(jié)果：依據(jù)PCA和OPLS-DA模型鑒別，新生兒黃疸組與正常對(duì)照組比較有纈氨酸、肌醇、賴(lài)氨酸、亮氨酸等10種代謝物存在差異;新生兒黃疸組治療前后有β-葡萄糖、α-葡萄糖、纈氨酸、酪氨酸等28種代謝物存在差異。結(jié)論：新生兒黃疸患者的代謝紊亂，且光療對(duì)脂質(zhì)、氨基酸和能量代謝的影響具有重要的作用。

【關(guān)鍵詞】 新生兒黃疸; 光療法; 代謝組學(xué); 核磁共振波譜

【Abstract】 Objective：To explore the changes of serum metabolic spectrum in neonatal jaundice patients before and after illumination，and to improve the basis for further study of neonatal jaundice and phototherapy response metabolic spectrum.Method：A total of 30 neonatal jaundice patients were selected as neonatal jaundice group and 25 healthy neonates as normal control group.The metabolomics method of nuclear magnetic resonance（NMR）was used to study the difference of serum metabolic spectrum between Jaundice group and normal control group before and after phototherapy.Data were processed by principal component analysis（PCA）and orthogonal partial least squares discriminant analysis（OPLS-DA）.Result：According to the identification of PCA and OPLS-DA models，there were 10 metabolites such as valine，inositol，lysine and leucine in the neonatal jaundice group compared with the normal control group，there were 28 metabolites such as β-glucose，α-glucose，valine and tyrosine in the neonatal jaundice group before and after treatment.Conclusion：Metabolic disorders in neonatal jaundice patients，and the effects of phototherapy on lipid，amino acid and energy metabolism play an important role.

【Key words】 Neonatal jaundice; Phototherapy; Metabonomics; Nuclear magnetic resonance spectroscopy

First-authors address：Nanshan Peoples Hospital，Shenzhen 518052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.16.003

黃疸是一種新生兒最常見(jiàn)的疾病。據(jù)估計(jì)，大約60%的足月嬰兒和80%的早產(chǎn)兒在出生后的第1周出現(xiàn)黃疸[1-2]。光療通常被認(rèn)為是一種安全和耐受性良好的治療新生兒黃疸的方法，可以將膽紅素轉(zhuǎn)化為水溶性的異構(gòu)體，很容易通過(guò)胃腸道或尿液丟失消除[3-4]。膽紅素在460 nm波長(zhǎng)附近的藍(lán)色區(qū)域吸收最強(qiáng)烈的光，氮化鎵光致發(fā)光二極管（LED）可提供高強(qiáng)度的窄波長(zhǎng)光譜光，已被越來(lái)越多地用于治療新生兒黃疸[5-6]。雖然光療可有效治療新生兒黃疸，但很少有評(píng)估光療有效性的生物標(biāo)志物，2004年美國(guó)兒科學(xué)會(huì)發(fā)布的光療指南，主要是參考血清總膽紅素（TSB）水平的高低[7]。標(biāo)準(zhǔn)治療新生兒黃疸是測(cè)量TSB水平，常用的化學(xué)方法對(duì)膽紅素的測(cè)量是基于一個(gè)偶氮化合物或?qū)δ懠t素-膽紅素氧化酶氧化為膽綠素分子氧膽紅素的耦合，但其均受溶血干擾[8]。因此，筆者通過(guò)分析新生兒黃疸患者光療前、后的血清的整個(gè)代謝譜的變化，進(jìn)一步闡明光療的作用機(jī)理。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2011年3月-2012年11月本院收治的30例新生兒黃疸患者為新生兒黃疸組，25例健康新生兒為正常對(duì)照組。（1）納入標(biāo)準(zhǔn)：胎齡>35周;新生兒黃疸患兒均表現(xiàn)出全身皮膚黏膜黃染和不同程度面目黃染，入院時(shí)血清總膽紅素均>15 mg/dL，均以血清未結(jié)合膽紅素明顯升高為主。（2）排除標(biāo)準(zhǔn)：新生兒臨床表現(xiàn)為重度黃疸（血清總膽紅素均>25 mg/dL）;新生兒伴有溶血，需要換血（出生時(shí)臍血總膽紅素>4 mg/dL）;新生兒血紅蛋白<120 g/L;新生兒伴有水腫、肝脾大和心力衰竭等疾病?；純罕O(jiān)護(hù)人均同意參加此項(xiàng)研究，且經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，在整個(gè)研究過(guò)程中，遵守赫爾辛基主體醫(yī)學(xué)研究的倫理原則宣言。

1.2 方法 （1）新生兒黃疸組接受光療標(biāo)準(zhǔn)：依據(jù)新生兒出生天數(shù)和由中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)會(huì)制定的TSB水平[9]。運(yùn)用頭頂?shù)腖ED光療系統(tǒng)[Tende Electronics & Software Ltd.Company，Ankara，強(qiáng)度：30～120 μW/（cm2·nm），光譜400～470 nm]進(jìn)行光療。采集靜脈血，3 000 g離心5 min，收集血清，于-80 °C，用以實(shí)驗(yàn)分析。（2）樣品的核磁共振（NMR）分析：在NMR實(shí)驗(yàn)前，冷凍血清室溫下解凍20 min，離心后取上層血清400 μL并加至5 mm的核磁管中，加入100 μL的生理鹽水（0.9% NaCl 10%/90% H2O和D2O），12 000 g離心5 min，取400 μL等分溶液放入另一個(gè)5 mm的核磁共振管用以核磁共振實(shí)驗(yàn)。1H NMR實(shí)驗(yàn)所用儀器是Varian 600譜儀，其1H共振頻率是599.93 Hz。橫向弛豫加權(quán)實(shí)驗(yàn)是用水峰抑制的Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）序列，弛豫延遲2.1 s，采集時(shí)間1.000 0 s，譜寬8 000.0 Hz，溫度25 ℃，總回波時(shí)間100 ms，累加次數(shù)128次。

1.3 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn) （1）分析新生兒黃疸藍(lán)光治療前后及正常對(duì)照組的血清代謝物，血清代謝物的分析運(yùn)用主成分分析方法（PCA），降低數(shù)據(jù)的維數(shù)和通過(guò)主成分分析圖譜，概括核磁共振光譜使用分?jǐn)?shù)間的相似點(diǎn)和不同點(diǎn)。（2）分析新生兒黃疸藍(lán)光治療前后及正常對(duì)照組代謝物的差異性，對(duì)偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）模型進(jìn)行正交矯正處理，使用SIMCA-P+軟件（V11.0，Umetrics AB，Umea，Sweden）進(jìn)行正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA），最大化地凸顯模型內(nèi)部不同組別之間的差異，即判定黃疸藍(lán)光治療前后及正常對(duì)照的差異[10-11]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用TopSpin軟件（V3.0，Bruker Biospin，Germany）對(duì)血清核磁共振譜圖進(jìn)行傅立葉變換;數(shù)據(jù)分析使用SIMCA-P 11.0軟件（Umetrics，Umea，Sweden）進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)檢測(cè)獲得的1H NMR譜進(jìn)行分段積分，并去除水峰及因交叉弛豫引起峰型變寬后，將所產(chǎn)生的所有積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化后，對(duì)余下的血清譜圖積分譜圖積分分別進(jìn)行PCA分析;通過(guò)OPLS-DA分析各代謝物相應(yīng)的相關(guān)系數(shù)（r），對(duì)有統(tǒng)計(jì)意義的代謝物進(jìn)行進(jìn)一步歸納，將每一個(gè)變量的系數(shù)加載值與其標(biāo)準(zhǔn)偏差的平方根值相乘后進(jìn)行數(shù)據(jù)的回溯轉(zhuǎn)換，然后與相應(yīng)的r臨界值表進(jìn)行比對(duì)，得到組間差異的代謝物;使用SPSS 11.5軟件（SPSS公司，芝加哥，伊利諾斯州，美國(guó)）對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正態(tài)分布計(jì)量資料用（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，非正態(tài)分布計(jì)量資料用[M（P25，P75）]表示，比較采用秩和檢驗(yàn);計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較采用字2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床和實(shí)驗(yàn)室資料比較 兩組出生體重、孕齡、性別、治療前年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），具有可比性;新生兒黃疸組治療前總膽紅素濃度高于正常對(duì)照組，且治療后總膽紅素濃度低于治療前，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），見(jiàn)表1。

2.2 主成分分析 新生兒黃疸藍(lán)光治療前后及正常對(duì)照組2D的PCA分析圖顯示，盡管組間存在一些交叉部分，并用交叉驗(yàn)證后得到的R2X和Q2Y（分別代表模型可解釋的變量和模型的可預(yù)測(cè)度）對(duì)模型有效性進(jìn)行評(píng)判，即R2X=0.824，Q2Y=0.895;Q2Y的預(yù)測(cè)值為0.807，見(jiàn)圖1。

2.2 正交偏最小二乘判別分析 OPLS-DA圖顯示，對(duì)照組和藍(lán)光治療前的新生兒黃疸組代謝物質(zhì)存在差異，其中R2X=0.287，Q2Y=0.843;Q2Y的預(yù)測(cè)值為0.698，見(jiàn)圖2;新生兒黃疸組藍(lán)光治療前后的代謝物質(zhì)存在差異，其中R2X=0.2238，Q2Y=0.809，Q2Y的預(yù)測(cè)值為0.753，見(jiàn)圖3;依據(jù)r臨界值（|r|>0.330），新生兒黃疸組治療前后有28種代謝物存在差異，新生兒黃疸組治療后β-葡萄糖、α-葡萄糖、纈氨酸、酪氨酸、三甲胺、丙酮酸、磷酸膽堿、肌醇、賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘油磷酸膽堿、谷氨酸鹽、丙氨酸、1-甲基組氨酸均低于治療前，乳酸、脂類(lèi)、低密度脂蛋白、極低密度脂蛋白、甘氨酸、谷氨酰胺、丙酮、乙酰乙酸乙酯、3-羥基丁酸酯均高于治療前，見(jiàn)表2;新生兒黃疸組與正常對(duì)照組比較有10種代謝物存在差異，新生兒黃疸組治療前纈氨酸、肌醇、賴(lài)氨酸、亮氨酸、乳酸、異亮氨酸、甘氨酸、肌酸、丙氨酸高于正常對(duì)照組，低密度脂蛋白低于正常對(duì)照組，見(jiàn)表2。

3 討論

總膽紅素作為診斷新生兒黃疸的標(biāo)準(zhǔn)和評(píng)價(jià)藍(lán)光治療的效果的一項(xiàng)重要指標(biāo)[12]，本研究基于NMR實(shí)驗(yàn)的代謝組學(xué)研究方法，對(duì)藍(lán)光治療前后的新生兒黃疸患者的血清進(jìn)行了分析，并發(fā)現(xiàn)了一些新的低分子量的生物標(biāo)記物。

本研究結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，新生兒黃疸組治療前纈氨酸、肌醇、賴(lài)氨酸、亮氨酸、乳酸、異亮氨酸、甘氨酸、肌酸、丙氨酸增加，低密度脂蛋白減少，表明在新生兒黃疸患者血清中的纈氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和甘氨酸的升高，反映了其氨基酸代謝是紊亂的。眾所周知，乳酸是糖酵解中的終產(chǎn)物，且最近有許多科學(xué)家發(fā)現(xiàn)在新生兒高黃疸癥患者的乳酸的改變[13]。而肌酸是一種含氮的化合物，其主要在人體的肝臟中合成，作為一個(gè)能量調(diào)節(jié)線(xiàn)粒體和細(xì)胞質(zhì)之間的ATP產(chǎn)量[14]，因此，筆者推測(cè)高濃度的肌酸可肝臟細(xì)胞功能紊亂。另外，新生兒黃疸患者的血清中的低密度脂蛋白的含量是減少的，早期研究證實(shí)，膽紅素具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的特性和與血清中的脂質(zhì)成分呈負(fù)相關(guān)[15]。因此，以上提及的代謝組學(xué)的發(fā)現(xiàn)可以作為診斷新生兒黃疸重要生物標(biāo)記物。

本研究結(jié)果顯示，新生兒黃疸患者接受藍(lán)光治療前后共有28種代謝物質(zhì)發(fā)現(xiàn)差異性的改變，13種代謝物質(zhì)變化是增加的，其中乳酸和脂質(zhì)變化顯著，另有15種代謝物質(zhì)是變化是減少的，其中糖和氨基酸的變化顯著，大多數(shù)的代謝物質(zhì)主要與氨基酸和糖代謝相關(guān)，藍(lán)光治療后的新生兒黃疸患者血清中，β-葡萄糖和α-葡萄糖的含量均是明顯減少的（r=-0.666、-0.658），這一結(jié)果充分說(shuō)明了藍(lán)光治療會(huì)直接影響新生兒黃疸患者的能量代謝，而健康嬰兒的代謝變化沒(méi)有發(fā)生改變，此研究的結(jié)果是一定的探索性。因此，藍(lán)光治療組的代謝變化可能與后天成熟或喂養(yǎng)的結(jié)果有關(guān)。

一項(xiàng)早期研究發(fā)現(xiàn)，新生兒黃疸患者接受藍(lán)光治療后，其血流會(huì)增加，這可能與消耗能量和葡萄糖的水平下降有關(guān)[16]。這就更好地解釋了新生兒黃疸患者在接受藍(lán)光治療后，其血清中β-葡萄糖和α-葡萄糖的水平下降的原因。本研究結(jié)果顯示，丙酮酸水平減少（r=-0.346）、乳酸水平增加（r=0.599），乳酸是糖酵解的終產(chǎn)物，而丙酮酸是在糖酵解階段產(chǎn)生乳酸前的一個(gè)中間產(chǎn)物，當(dāng)機(jī)體急需要能量時(shí)，丙酮酸可以通過(guò)糖酵解途徑產(chǎn)生更多的ATP能量，這樣導(dǎo)致產(chǎn)生了更多的乳酸。另一方面，在嬰幼兒時(shí)期，機(jī)體具有維持糖自穩(wěn)的重要能力[17-18]，以上提及的代謝組學(xué)特性顯示藍(lán)光治療新生兒黃疸患者可以導(dǎo)致其β-葡萄糖和α-葡萄糖的水平下降，從而引起新生兒機(jī)體增加糖異生來(lái)維持血糖水平。本研究中，生糖氨基酸包括纈氨酸、賴(lài)氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和丙氨酸的降低，筆者推測(cè)這些氨基酸為轉(zhuǎn)化葡萄糖來(lái)維持血糖平衡。此外，作為葡萄糖的異構(gòu)體，肌醇的含量保持一個(gè)較低的水平。因此，筆者認(rèn)為光療不僅能加速膽紅素的代謝，而且能導(dǎo)致糖代謝的改變。

本研究還顯示，患兒治療后的血脂水平（如低密度脂蛋白）在光療后顯著升高，與Yoshino等[19]研究一致，說(shuō)明總膽紅素與低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白呈負(fù)關(guān)聯(lián)的。在本研究中，顯著降低的血脂如低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白，考慮為新生兒黃疸光療后的患者可能通過(guò)光動(dòng)力應(yīng)激可引起脂質(zhì)過(guò)氧化作用。然而，謝輝等[20]觀察膽紅素水平與HDL-C水平呈正相關(guān)，但筆者沒(méi)有觀察到在藍(lán)光治療后的高密度脂蛋白的顯著性變化，這可能是由于本研究中的樣本數(shù)少有關(guān)。

膽紅素暴露在光下，可以轉(zhuǎn)化為水溶性異構(gòu)體。然而，異構(gòu)體的代謝具體機(jī)制目前沿不清楚。在本研究中，筆者采用基于NMR的代謝組學(xué)方法研究新生兒黃疸患者血清代謝譜分析，顯著性差異的代謝物可能對(duì)闡明的光療作用的詳細(xì)機(jī)制和用以診斷和監(jiān)測(cè)治療新生兒黃疸患者提供了重要的生物標(biāo)志物，而關(guān)于健康嬰兒后續(xù)檢測(cè)需要更多的相關(guān)研究。

綜上所述，新生兒黃疸患者的代謝紊亂，且光療對(duì)脂質(zhì)、氨基酸和能量代謝的影響具有重要的作用。

參考文獻(xiàn)

[1] Sun H L，Lue K H，Ku M S，et al.Neonatal jaundice is a risk factor for childhood allergic rhinitis：a retrospective cohort study[J].Am J Rhinol Allergy，2013，27（3）：192-196.

[2] Riskin A，Cohen K，Kugelman A，et al.Influence of Changes in the Evaluation of Neonatal Jaundice[J].Am J Perinatol，2014，31（3）：203-208.

[3]方衡，張愛(ài)華，周小航，等.基于代謝調(diào)控通路的京尼平苷干預(yù)陽(yáng)黃證的作用靶標(biāo)研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2016，18（10）：1697-1708.

[4] Stokowski L A.Fundamentals of Phototherapy for Neonatal Jaundice[J].Adv Neonatal Care，2011，11（5 Suppl）：S10-21.

[5] Kale Y，Aydemir O，Celik ?，et al.Effects of phototherapy using different light sources on oxidant and antioxidant status of neonates with jaundice[J].Early Hum Dev，2013，89（12）：957-960.

[6] Sivanandan S，Chawla D，Misra S，et al.Effect of sling application on efficacy of phototherapy in healthy term neonates with nonhemolytic jaundice：a randomized conrolled trial[J].Indian Pediatr，2009，46（1）：23-28.

[7]史秀云.基于LC-MS的胰腺癌血清代謝組學(xué)研究[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2015.

[8] Romagnoli C，Barone G，Pratesi S，et al.Italian guidelines for management and treatment of hyperbilirubinaemia of newborn infants ≥ 35 weeks gestational age[J].Ital J Pediatr，2014，40（1）：11.

[9] Duchnowski P，Hryniewiecki T，Kusmierczyk M，et al.Red Cell Distribution Width as a Prognostic Marker in Patients Undergoing Valve Surgery[J].Interact Cardiovasc Thorac Surg，2017，25（6）：925-929.

[10] Izumi S I，Muano T，Mori A，et al.Common carotid artery stiffness，cardiovascular function and lipid metabolism after menopause[J].Life Sci，2006，78（15）：1696-1701.

[11]蔡小蓉，楊建云，肖炳坤，等.茵陳五苓散對(duì)α-萘異硫氰酸酯致大鼠黃疸型肝損傷的血清代謝組學(xué)研究[J].中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2018，34（7）：848-851.

[12] Ichinomiya K，Inoue F，Koizumi A，et al.Problems with using total serum bilirubin as a criterion for phototherapy in extremely low-birthweight infants[J].Pediatr Int，2014，56（5）：731-734.

[13]高源.希特林蛋白缺陷癥致嬰兒膽汁淤積性肝炎四例臨床分析[J].中國(guó)綜合臨床，2016，32（5）：467-470.

[14] Pazourek J.Fast separation and determination of free myo-inositol by hydrophilic liquid chromatography[J].Carbohydr Res，2014，9（1）：55-60.

[15] Franchini M，Targher G，Lippi G.Serum bilirubin levels and cardiovascular disease risk：a Janus Bifrons？[J].Adv Clin Chem，2010，50：47-63.

[16]浦仕彪.基于代謝組學(xué)的自身免疫性肝炎生物標(biāo)志物篩查及中醫(yī)藥干預(yù)研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[17] Adamkin D H.Late preterm infants：severe hyperbilirubinemia and postnatal glucose homeostasis[J].J Perinatol，2009，29（Suppl 2）：S12-17.

[18]朱潔.基于代謝組學(xué)的慢加急（亞急）性乙肝肝衰竭濕熱證的證候研究[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2013.

[19] Yoshino S，Hamasaki S，Ishida S，et al.Characterization of the effect of serum bilirubin concentrations on coronary endothelial function via measurement of high-sensitivity C-reactive protein and high-density lipoprotein cholesterol[J].Heart Vessels，2013，28（2）：157-165.

[20]謝輝，謝艷，張若蒙，等.茵梔黃口服液對(duì)新生兒黃疸特征標(biāo)記物影響的研究分析[J].吉林醫(yī)學(xué)，2017，38（6）：1052-1054.

（收稿日期：2018-05-18） （本文編輯：董悅）