負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法檢驗(yàn)三唑侖

文/姜紅 侯小平 何毅 崔巍

以丙酮、氯仿為萃取劑，采用負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法對(duì)生物檢材中的三唑侖進(jìn)行了分析檢驗(yàn) // 三唑侖分子結(jié)構(gòu)中含有電負(fù)性較大的鹵族元素氯（Cl），應(yīng)用負(fù)離子化學(xué)源進(jìn)行檢驗(yàn)可以極大地提高檢測(cè)靈敏度，得到了較為滿意的檢驗(yàn)結(jié)果，該方法可用于公安機(jī)關(guān)實(shí)際辦案。

三唑侖（Triazolam，又稱(chēng)海樂(lè)神、酣樂(lè)欣、三唑苯二氮卓），化學(xué)名為8-氯-6-氯苯-1-甲基-4H-三唑侖，[4,3a][1,4]-苯并二氮卓（C17H12Cl2N4），屬三唑苯二氮卓類(lèi)（benzodiazepines）安眠鎮(zhèn)靜藥物，臨床上常用來(lái)治療抗焦慮和失眠。三唑侖純品為白色或淡黃色結(jié)晶粉末，幾乎無(wú)味，溶于氯仿，稍溶于乙醇，微溶于水和乙醚。藥用為藍(lán)色片劑，每片含0.25 mg三唑侖，服用半片就有明顯的催眠作用，血中濃度高于4 ng/mL就會(huì)產(chǎn)生明顯的鎮(zhèn)靜作用。

因?yàn)槿騺鰧儆谛滦透咝О裁摺㈡?zhèn)靜藥，藥效極強(qiáng)（少量使用即產(chǎn)生藥效），在市場(chǎng)上有售，易于獲得。所以，在近年來(lái)的麻醉?yè)尳?、?qiáng)奸案件中，三唑侖是案犯經(jīng)常使用的麻醉藥物之一。三唑侖進(jìn)入體內(nèi)后，在血中以原體形式存在，在尿中原體含量低于1%，而其代謝產(chǎn)物α-羥基三唑侖卻占60-80%。由于三唑侖代謝速度快，體內(nèi)組織及體液中含量極微，這給檢驗(yàn)工作帶來(lái)一定的困難，目前國(guó)內(nèi)外分析三唑侖及其代謝產(chǎn)物α-羥基三唑侖的方法有：GC-NPD法、GC-ECD法、HPLC法、GC/MS和GC/MS/MS法，本文采用負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法（NCI-GC/MS）檢驗(yàn)生物檢材中的三唑侖，該方法操作迅速、簡(jiǎn)便，干擾小、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可直接用于公安基層辦案。

實(shí)驗(yàn)部分

檢測(cè)器溫度：280 ℃；

柱溫（程序升溫）：80 ℃（2 min）30℃ /min 280℃（16.5 min）；

分流比 ：20：1 ；

總流量：2 mL/min；

質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集模式：全掃描;

掃描范圍：40-450 m/z；

電子倍增器電壓：1.0 kV。

實(shí)驗(yàn)方法

首先要對(duì)檢材進(jìn)行前處理：取檢材血5 mL（或尿5 mL、胃內(nèi)容物、肝各 5 g），用丙酮 -水（9：1）20 mL浸泡，超聲萃取20 min。離心分離，上清液在水浴80℃下，濃縮至2 mL。調(diào)pH=10，用氯仿10 mL振蕩、提取5 min，離心分離，分出氯仿。再用10mL氯仿提取一次，合并兩次提取液，在50℃下?lián)]干氯仿，用100μL甲醇溶解，然后經(jīng)GC/MS進(jìn)行分析。

結(jié)果與討論

實(shí)驗(yàn)儀器

GCMS-QP5050A（島津公司）；

離子源：NCI源（負(fù)離子化學(xué)源）；

載氣：CH4、He.

實(shí)驗(yàn)條件

色譜柱：J&W DB-5（30 mX 0.25 mm X 0.25μm）毛細(xì)管柱；

傳輸線溫度：250 ℃；

進(jìn)樣口溫度：280 ℃；

利用負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法檢驗(yàn)三唑侖的理論依據(jù)

因?yàn)槿騺龆鄰哪蛑写x并排出，所以在麻醉?yè)尳?、?qiáng)奸案中，尿液是最好的檢材。但因尿中藥物原體極微，難以檢測(cè)，所以對(duì)尿液中三唑侖的分析多是以檢測(cè)其代謝產(chǎn)物α-羥基三唑侖為主。而三唑侖的代謝物在尿中并非以游離狀態(tài)存在，而是與葡萄糖醛酸結(jié)合，形成共軛化合物，所以檢測(cè)尿中的代謝物必須先水解，使之從結(jié)合態(tài)中游離出來(lái)，才能有效地將其提取出來(lái)。又由于三唑侖的代謝物含有羥基，需要衍生化后才能進(jìn)樣分析，因此前處理過(guò)程比較繁瑣且比較費(fèi)時(shí)。而用負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法檢驗(yàn)三唑侖，大大簡(jiǎn)化了前處理過(guò)程，提取步驟較少，操作簡(jiǎn)便快速。

化學(xué)電離是利用樣品蒸氣分子與甲烷等反應(yīng)氣體的離子相互作用（分子-離子反應(yīng)）而使樣品分子離子化。由于分子-離子反應(yīng)過(guò)程并不給予分子離子過(guò)多的能量，因而減少了分子離子進(jìn)一步裂解的幾率，增加了分子離子峰強(qiáng)度，減少了碎片離子峰，常常生成質(zhì)子化的分子，這些離子稱(chēng)為準(zhǔn)分子離子，因此化學(xué)電離屬于一種軟電離技術(shù)。它的優(yōu)點(diǎn)是，即使對(duì)于不穩(wěn)定的有機(jī)化合物，也可得到相對(duì)豐度較大的分子離子峰，提供了樣品分子量的信息。負(fù)離子化學(xué)源，是高親電化合物的一種極靈敏、選擇性極強(qiáng)的質(zhì)譜分析法，它彌補(bǔ)了正離子CI和EI法靈敏度低的缺陷，對(duì)鹵素類(lèi)化合物靈敏度非常高，其靈敏度可以和電子捕獲檢測(cè)器（ECD）相媲美。

利用負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法檢驗(yàn)三唑侖的優(yōu)勢(shì)

在麻醉?yè)尳佟?qiáng)奸案件中，尿液是最好的檢材，其次是血液。三唑侖在體代謝速度快，體內(nèi)組織及體液中含量極微，在體內(nèi)尿液中含量低達(dá)10-10。三唑侖具有高親酯性，易溶于生物膜的類(lèi)脂質(zhì)中而擴(kuò)散。在胃腸道很快通過(guò)毛細(xì)血管壁而被吸收到血液中，在血漿中與血漿蛋白的結(jié)合率達(dá)90%。但它在血液中存留時(shí)間很短，很快就在肝臟中進(jìn)行代謝并隨尿排出，三唑侖在血漿中最大治療濃度僅為0.02 μg/mL，因此它在血液中濃度也很低,見(jiàn)表1。特別是對(duì)麻醉?yè)尳?、?qiáng)奸案件中的活體檢驗(yàn)用質(zhì)譜法直接定性難度較大，而用其他方法對(duì)體內(nèi)檢材一般也檢不出來(lái)，因?yàn)槿騺龅姆悬c(diǎn)較高，一般在GC（FID、NPD檢測(cè)器）、GC/MS（EI源）等儀器上響應(yīng)很低，所以在實(shí)際辦案中很容易漏檢，因此常常使案件的偵破工作陷入僵局。而采用負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法檢驗(yàn)三唑侖，效果較好，因?yàn)槿騺龇肿咏Y(jié)構(gòu)中含有鹵族元素，（含有二個(gè)氯原子），應(yīng)用負(fù)化學(xué)源可以極大地提高檢測(cè)靈敏度，得到滿意的結(jié)果。

表1 三唑侖在血漿中的有關(guān)濃度（ng/mL）。

案例應(yīng)用

案例1

X年X月X日，41歲的劉某某被3名犯罪嫌疑人殺死并被分尸，尸體分多處埋藏。半年后偵查人員將其尸體挖出三塊，均已高度腐敗。將其送到公安部物證鑒定中心進(jìn)行檢驗(yàn)，理化檢驗(yàn)人員對(duì)送檢的死者的胃及胃內(nèi)容、肝組織分別進(jìn)行了檢驗(yàn)。首先用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，然后用GC/ECD、GC/MSNCI進(jìn)行分析，從送檢的死者的胃及胃內(nèi)容、肝組織中均檢出三唑侖成分，肝組織中三唑侖的含量為1.36 μg/g，進(jìn)而為案件的偵破，提供了科學(xué)的證據(jù)。

案例2

X年X月X日，江西省某地一年輕女子劉某，被一中年男子騙至當(dāng)?shù)匾宦蒙缰?，該男子誘騙劉某喝下1罐飲料，致使劉某昏迷，遂對(duì)劉某進(jìn)行強(qiáng)奸，并搶走現(xiàn)金、首飾及手機(jī)等物品。辦案人員將受害者劉某的尿液，送至公安部物證鑒定中心進(jìn)行檢驗(yàn)，首先將受害者劉某的尿液用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，然后用GC/ECD、GC/MS-NCI進(jìn)行分析，在劉某的尿液中檢出麻醉藥物三唑侖的成分，為確定案件的性質(zhì)提供了有力的證據(jù)。

案例3

X年X月X日晚9時(shí)許，湖南省某地3位看管園林的老人，在喝了他人送的牛奶后昏睡不醒，待第二天醒后3人發(fā)現(xiàn)門(mén)前一棵珍貴的樹(shù)木—羅漢松已被挖走。刑技人員對(duì)受害人李某醒后的第一泡尿液進(jìn)行了提取，并送到公安部物證鑒定中心進(jìn)行分析檢驗(yàn)。經(jīng)對(duì)受害人李某醒來(lái)后的第一泡尿液進(jìn)行GC/ECD、GC/MS-NCI分析，檢出麻醉藥物三唑侖的成分。

圖1 案例1中三唑侖的總離子流圖。

圖2 案例1中三唑侖的質(zhì)譜圖。

圖4 案例3中三唑侖的總離子流圖。

結(jié)語(yǔ)

麻醉?yè)尳?、?qiáng)奸案件的發(fā)生具有很大的社會(huì)危害性，不僅會(huì)給受害者造成財(cái)物損失，同時(shí)也極大地危害了受害人的身心健康。為了更有力地打擊這類(lèi)犯罪案件，為案件的偵破提供線索，指明方向，為證實(shí)犯罪提供科學(xué)的依據(jù)，必須建立一套完整、系統(tǒng)的對(duì)三唑侖及其代謝物在生物體內(nèi)的分析檢驗(yàn)方法，以便及時(shí)、準(zhǔn)確地對(duì)其進(jìn)行定性和定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：對(duì)于麻醉?yè)尳佟?qiáng)奸案件中體內(nèi)組織及體液中的麻醉藥物，可采用負(fù)離子化學(xué)源氣相色譜/質(zhì)譜法進(jìn)行檢驗(yàn)，該方法操作簡(jiǎn)便、快速、干擾小、靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可直接用于公安基層辦案，此方法可作為法庭科學(xué)實(shí)驗(yàn)室中分析檢驗(yàn)麻醉藥物的一種簡(jiǎn)單而快速的方法。