消痰化瘀中藥對NAFLD 大鼠SREBP 1c/FAS/ACCmRNA 表達的影響※

鮑新民 郭建利 劉晨旭 路 帥 韓 雪 婁麗娟 張一昕

（1 河北省定州市人民醫(yī)院感染科，河北 定州 073000；2 石家莊醫(yī)學高等?？茖W校中醫(yī)系，河北 石家莊 050599；3 河北中醫(yī)學院藥學院，河北 石家莊 050200；4 河北省高校中藥組方制劑應用技術(shù)研發(fā)中心，河北 石家莊 050200）

近年來，隨著人們在享受富足物質(zhì)生活條件的同時，肥胖和代謝綜合征已經(jīng)成為臨床的常見疾病，隨之引發(fā)的非酒精性脂肪性肝 （nonalcoholic fatty liverdisease，NAFLD） 已經(jīng)成為我國排位于病毒性肝炎之后的第二位的肝病，其發(fā)病率高居不下，年齡日趨年輕化，可進一步進展為脂肪性肝炎、乃至脂肪性肝硬化。目前臨床治療NAFLD 尚未見特效藥物，而大量臨床資料表明，中醫(yī)藥在防治該疾病中具有較好治療優(yōu)勢。消痰化瘀中藥乃是經(jīng)課題組多年臨床篩選、用于治療NAFLD 具有良好效果的組方［1-2］，但其作用機制未明，為此通過動物實驗觀察了其對NAFLD 大鼠肝組織膽固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（terolregulatory element binding protein-1c，SREBP-1c）、脂肪酸合成酶（fatty acid synthetase，F(xiàn)AS） 和乙酰輔酶A 羧化酶 （acetyl CoA carboxylase，ACC） 表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級SD 雄性大鼠60 只，8 周齡，體質(zhì)量（180 ± 20） g，由河北省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（冀） 2013-1-003 ，飼養(yǎng)條件為：清潔級實驗室，溫度為 （23±2） ℃，濕度為50%±10%，12 h 明/暗交替，動物自由飲水進食。

1.2 實驗儀器Humalyzer2000 型半自動生化分析儀（德國毫邁克公司）；PE9600 型PCR 擴增儀（美國PE 公司）；DYCZ-24DN 型電泳儀、DYCP-31CN 型電泳槽（北京六一生物科技有限公司）；GDS-8000 System 型UVP 凝膠成像系統(tǒng)（美國Thermo 公司）；UV-254 型紫外透射儀（北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）；MDF-382E 超低溫保存箱（日本SANYO 公司） 等。

1.3 藥品與試劑 消痰化瘀中藥由清半夏（批號：7080863）、丹參 （批號：7111113）、澤瀉 （批號：7126343）、海藻 （批號：5102213）、郁金 （批號：7121973）、柴胡 （批號：7112393）、生大黃 （批號：7090523）、生黃芪（批號：7110743）、炒白術(shù)（批號：8010023） 組成，均為廣東一方制藥有限公司生產(chǎn)的配方顆粒。用100 ℃蒸餾水充分溶解后備用。東寶肝泰片（通化東寶藥業(yè)股份有限公司，批號為20140613），制成混懸液備用。三酰甘油（TG，批號170824）、總膽固醇（TC，批號170616）、游離脂肪酸（FFA，批號170721）試劑盒（北京中生生物工程高技術(shù)公司）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT，批號170611）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST，批號170621）試劑盒（貝克曼庫爾特實驗系統(tǒng)有限公司）；Trizol（Invitrogen 公司）；DEPC（Sigma 公司）；RT Reagents、PCR Reagents、DNA Marker（TaKaRa 公司）。

1.4 模型制備 參照相關(guān)文獻［3］方法制備高脂飼料，高脂飼料由豬油、膽固醇、基礎(chǔ)飼料組成，用量比例分別為10%、2%、88%，造模大鼠每天給予高脂飼料喂養(yǎng)，自由飲水，共計8 周。

1.5 分組與給藥 按隨機數(shù)字表法將60 只實驗大鼠隨機分為6 組，每組10 只，分別是正常組、模型組、陽性藥（東寶肝泰） 對照組和消痰化瘀中藥高、中、低劑量組。除正常組給予大鼠普通飼料維持飼養(yǎng)以外，其余各組均喂飼高脂飼料，同時即予相應的藥物灌胃，陽性藥組和消痰化瘀中藥高、中、低劑量組的給藥劑量標準分別為：0.9 g/kg、43.34 g/kg、32.50 g/kg、21.67 g/kg，動物給藥劑量換算參照陳奇主編的《中藥藥理研究方法學》之中關(guān)于人和動物間體表面積折算比值計算，非用藥組大鼠均灌服蒸餾水，每天1 次，用藥體積均為1 mL/100 g，連續(xù)8 周。

1.6 血清指標檢測 實驗最后一天給藥后所有大鼠隔夜禁食，麻醉后股動脈采血，常規(guī)分離血清。用半自動生化分析儀，檢測血清TG、TC、FFA、ALT、AST 的含量或活性。

1.7 肝組織指標檢測 實驗大鼠股動脈采血后，迅即剖腹取出肝臟，濾紙吸去表面液體，稱取肝重，計算肝指數(shù)（肝濕重/體質(zhì)量×100%）。取適當大小肝組織，制成10%的勻漿，吸取上清液，用722 型光柵分光光度計檢測TC和TG 的含量。

1.8 病理學觀察 取適宜大小的肝組織，4% 多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE 方法染色，顯微鏡下觀察肝組織病理形態(tài)學變化。

1.9 PCR 檢測 實驗大鼠麻醉狀態(tài)下，股動脈采血后迅即剖腹取出肝臟，濾紙吸去表面液體，取少許肝組織置于冷凍管液氮保存。實驗時將肝組織解凍，肝細胞總RNA 提取采用Trizol 一步法。引物序列由primer 5.0 軟件設(shè)計。SREBP1c：上游引物5'-GCCATGGATTGCACATTTGAAGAC-3'， 下 游 引 物5'- GAGGGAAGCTCGGAGGCAAC-3'，擴增片段為379 bp。ACC：上游引物5'-TGCAAACACATCGAGGACGA-3'；下游引物5'-ATGATGGGGACTGGGCTTTG-3'，擴增片段為431 bp。FAS：上游引物5'-GTGAGCGGGAAAGTGTACCA-3'， 下 游 引 物 5'-TCATCTTCAGCCCTTGCTGG-3'，擴增片段為622 bp。β-Actin：上游引物5'-CCCGCGAGTACAACCTTCTT-3；下游引物5'-AACACAGCCTGGATGGCTAC-3'；擴增片段為481 bp。應用RT-PCR 方法檢測，實驗重復3 次，以β-Actin 作為內(nèi)對照，計算相對含量。

1.10 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用SPSS 19.0 軟件處理，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD 檢驗，結(jié)果采用均數(shù)±標準差（x±s）表示。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肝組織病理形態(tài)學的變化 正常組大鼠細胞結(jié)構(gòu)正常，細胞核清晰可見，胞漿均勻。模型組大鼠細胞可見氣球樣變，胞漿疏松，呈現(xiàn)有大小不一的較多脂滴空泡，表現(xiàn)為明顯肝脂變特征。各給藥組肝細胞脂滴空泡明顯減少，氣球改樣變減輕，肝臟脂肪變性程度明顯改觀。見圖1~6。

圖1 正常組

圖2 模型組

圖3 高劑量組

圖4 中劑量組

圖5 低劑量組

圖6 陽性藥組

2.2 各組大鼠血脂和肝功能的變化 模型組大鼠TC、TG、FFA、ALT、AST 的含量或活性明顯高于正常組（P＜0.05）。陽性藥組和高、中、低劑量組上述指標的含量或活性均低于模型組（P＜0.05）；其中高、中、低3 個劑量組TC、TG和FFA 的含量均低于陽性藥組（P＜0.05）；高劑量組ALT和AST 的活性均低于陽性藥組（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血脂和肝功能組間比較 （x±s）

2.3 各組大鼠肝臟指數(shù)和肝勻漿脂質(zhì)的含量變化 模型組大鼠肝勻漿TC、TG、FFA 的含量和肝臟指數(shù)明顯高于正常組（P＜0.05）；陽性藥組和高、中、低劑量組TC、TG、FFA 的含量和肝臟指數(shù)均低于模型組（P＜0.05）；其中，高、中、低3 個劑量組肝組織TC、TG、FFA 的含量和肝臟指數(shù)均低于陽性藥組（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠肝臟指數(shù)和肝勻漿脂質(zhì)的組間比較 （x±s）

2.4 各組大鼠肝組織SREBP 1c、FAS 和ACC mRNA 的表達變化 模型組大鼠肝臟SREBP 1c、FAS 和ACCmRNA 的表達明顯低于正常組（P＜0.05）；陽性藥組和高、中、低劑量組SREBP 1c、FAS 和ACCmRNA 的表達水平均明顯高于模型組（P＜0.05）。高劑量組ACCmRNA 的表達低于陽性藥組（P＜0.05）。低劑量組中FAS 和ACCm－RNA 的表達低于高劑量組（P＜0.05）。見表3、圖7。

表3 各組大鼠SREBP 1c、FAS 和ACC mRNA 表達的組間比較（x±s）

圖7 各組大鼠肝組織SREBP 1c、FAS 和ACCmRNA 表達的凝膠電泳圖

3 討論

中醫(yī)學中無NAFLD 的病名，根據(jù)表現(xiàn)特征可歸屬于中醫(yī)的“脅痛”“痰濁”“肝著”等范疇，其發(fā)病原因較多。課題組結(jié)合多年臨床研究分析，認為食物精肥甘美、情志郁悶不遂、身體怠惰懶動為其主要病因，日久累積于肝脾，致脾運失常、肝失疏泄，漸至氣血失和，濕聚痰生，絡脈瘀阻，痰濁、瘀血互結(jié)于肝而發(fā)為本病。故而痰瘀結(jié)聚、肝脾失調(diào)為其發(fā)生機制，祛除痰瘀、悅肝運脾為其有效治法。故潛心篩選化痰祛瘀諸藥聯(lián)合組方，以清半夏、建澤瀉、海藻消痰祛濁，丹參、郁金、山楂活血化瘀降脂，柴胡、郁金解郁疏肝暢氣，生黃芪、炒白術(shù)健脾和胃祛濕，生大黃通腑祛脂降濁，眾藥合用，痰瘀并治、脾肝同調(diào)，切合病機，故能收效。SREBPs 家族蛋白是一類能與固醇調(diào)節(jié)元件發(fā)生特異性結(jié)合的蛋白，屬于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜連接蛋白，截止目前，發(fā)現(xiàn)有SREBP-1a、SREBP-1c 和SREBP2 共計3 種SREBPs。其中，與脂質(zhì)代謝密切相關(guān)的為SREBP-1c。它具有調(diào)控脂肪細胞的分化和脂肪在細胞內(nèi)異位積聚的作用，是一個重要的脂質(zhì)合成的調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控脂肪酸和三酰甘油合成中發(fā)揮著較為重要的作用。當動物體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂，游離脂肪酸產(chǎn)生過多在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高度聚集時，會影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，并激活C-Jun 氨基端激酶信號通路，導致胰島素抵抗和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，從而激活SREBP-1c，使脂質(zhì)合成加速、肝臟脂質(zhì)沉積，導致肝臟脂肪變性［4-6］。資料表明，SREBP1c的過表達可導致脂質(zhì)在肝臟和血管、胰島等非脂肪組織的異常積聚，在NAFLD 的發(fā)病中起關(guān)鍵性作用［7］。

研究表明，脂代謝通路中某些關(guān)鍵的酶及相關(guān)基因的表達異常，致使脂質(zhì)代謝紊亂，是引起肥胖、NAFLD的重要原因。其相關(guān)基因較多，而FAS 和ACC 是其中發(fā)揮作用不容忽視的兩種酶，F(xiàn)AS 作為內(nèi)源性脂肪酸合成的關(guān)鍵酶，通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)合成、促進能量消耗等方式維持機體能量的平衡［8］；ACC 則是脂肪合成的限速酶，與脂肪合成的速率密切相關(guān)。FAS 和ACC 是SREBP-1c 的下游因子，SREEP-1c 活化后可促進ACC、FAS、ACS 等成脂基因的轉(zhuǎn)錄，從而參與脂肪細胞分化、增殖及機體脂質(zhì)代謝的病理生理調(diào)節(jié)［9］，也是研究NAFLD 形成過程中被關(guān)注的基礎(chǔ)因素。

在本實驗中，模型組大鼠SREBP-1c、FAS 和ACCm RNA 的表達水平較正常組異常增加，提示高脂飼料誘導了肝組織中SREBP-1c 的表達增多，高表達的SREBP-1c進而引起受其調(diào)控的下游參與脂肪合成的相關(guān)基因ACC、FAS 的活性增強，脂肪酸合成遂異常增多，血清TG、TC、FFA 含量明顯增多。給予消痰化瘀中藥干預后，高、中、低劑量組中，SREBP-1c、FAS 和ACCm RNA 的表達明顯減少，血清和肝組織中TG、TC、FFA水平明顯降低。說明消痰化瘀中藥能夠抑制SREBP-1c的表達、下調(diào)其靶基因FAS 和ACC，減少脂質(zhì)合成和攝取、促進脂肪酸氧化，減輕肝細胞脂質(zhì)沉積、改善肝臟脂肪變性，這可能是防治NAFLD 的分子機制之一。