依魯替尼及其磷脂復(fù)合物在比格犬體內(nèi)的藥動學(xué)比較研究Δ

林琳，魯梅，鄧意輝（沈陽藥科大學(xué)藥學(xué)院，沈陽110016）

依魯替尼是一種新型的Bruton酪氨酸激酶（BTK）抑制劑，能夠通過與BTK酶激活區(qū)域內(nèi)的Cys481位點結(jié)合進(jìn)而發(fā)揮抑制該酶活性、阻止腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的作用[1-2]。目前，依魯替尼主要用于治療包括慢性淋巴細(xì)胞白血病、套細(xì)胞淋巴瘤和Waldenstrom巨球蛋白血癥在內(nèi)的多種淋巴瘤[3]。但依魯替尼的水溶性極差，口服制劑的生物利用度極低，導(dǎo)致臨床用藥劑量偏大，患者在治療過程中易出現(xiàn)出血、高血壓等毒副反應(yīng)，導(dǎo)致該藥的臨床應(yīng)用受到了極大限制[4]。磷脂復(fù)合物給藥系統(tǒng)能極大地提高難溶性藥物的水溶性，增加其血藥濃度并延長藥物在體內(nèi)的滯留時間，并顯著改善其生物利用度[5-7]。故本課題組前期制備了依魯替尼磷脂復(fù)合物。本研究在此基礎(chǔ)上，建立了測定比格犬血漿中依魯替尼濃度的高效液相色譜法（HPLC）；并以依魯替尼原料藥為對照，比較了兩者在比格犬體內(nèi)的藥動學(xué)差異，以期為其新劑型的研發(fā)提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

P230型高壓恒流泵、UV200Ⅱ型紫外可變波長檢測器、HW-2000色譜數(shù)據(jù)處理工作站（大連依利特分析儀器有限公司）；AT-130型柱溫箱（天津市金洲科學(xué)儀器有限公司）；S3100型自動進(jìn)樣器、SVC-Ⅱ型高精度全自動交流穩(wěn)壓器（中川電氣科技有限公司）；XS105型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DF-101S型磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器有限責(zé)任公司）；Anke TDL80-2B型離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠）；XH-D型渦旋儀（上海啟前電子科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑

依魯替尼原料藥（南京熙澤生物科技有限公司，批號：20161213，純度：≥99%）；甲苯磺丁脲對照品（內(nèi)標(biāo)，大連美侖生物技術(shù)有限公司，批號：J1010AS，純度：≥99%）；蛋黃磷脂酰甘油（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司，批號：B40643，純度：≥97%）；乙腈、冰醋酸均為色譜純，乙醇、三乙胺等試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 動物

清潔級健康比格犬6只，雄性，8月齡，體質(zhì)量10～15 kg，由沈陽藥科大學(xué)實驗動物中心提供，動物使用許可證號：SYXK（遼）2014-0004。

2 方法與結(jié)果

2.1 依魯替尼磷脂復(fù)合物的制備

參照本課題組前期研究方法制備依魯替尼磷脂復(fù)合物：稱取依魯替尼原料藥10.0 mg和蛋黃磷脂酰甘油18.0 mg，以乙醇為反應(yīng)溶劑，于40℃反應(yīng)0.5 h后，減壓蒸發(fā)除去乙醇，加入適量二氯甲烷洗滌以除去游離藥物，抽濾，收集沉淀，常溫減壓干燥24 h，即得依魯替尼磷脂復(fù)合物（每克磷脂復(fù)合物約含依魯替尼0.35 g）。

2.2 溶液的制備

2.2.1 依魯替尼系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 精密稱取依魯替尼原料藥5.00 mg，用甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度為10 μg/mL的貯備液。精密量取上述貯備液適量，用甲醇稀釋至相應(yīng)質(zhì)量濃度，制得依魯替尼系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，密封，于4℃保存，備用。

2.2.2 內(nèi)標(biāo)溶液 精密稱取內(nèi)標(biāo)對照品10.00 mg，用甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液。精密量取上述內(nèi)標(biāo)貯備液適量，用甲醇稀釋，制得質(zhì)量濃度為50 ng/mL的內(nèi)標(biāo)溶液，密封，于4℃保存，備用。

2.2.3 依魯替尼混懸液 精密稱取依魯替尼原料藥適量，用0.5%交聯(lián)羧甲基纖維素鈉溶液稀釋，充分?jǐn)嚢?，制得質(zhì)量濃度為5 mg/mL的依魯替尼混懸液，備用。

2.2.4 依魯替尼磷脂復(fù)合物混懸液 精密稱取“2.1”項下依魯替尼磷脂復(fù)合物適量，加入預(yù)熱至40℃的水中，充分?jǐn)嚢?，制得質(zhì)量濃度為5 mg/mL的依魯替尼磷脂復(fù)合物混懸液，備用。

2.3 分組與給藥

將比格犬隨機分為兩組，即依魯替尼混懸液組和依魯替尼磷脂復(fù)合物組，每組3只。所有比格犬均禁食、不禁水12 h后，分別單次灌胃“2.2.3”“2.2.4”項下相應(yīng)藥物混懸液，給藥劑量均為15 mg/kg（根據(jù)臨床使用劑量按等效劑量系數(shù)折算法[8]換算而得）。

2.4 血漿樣品處理

精密量取血漿樣品300μL，置于1.5 mL離心管中，加入50 ng/mL內(nèi)標(biāo)溶液100μL，加入甲醇600μL，渦旋混勻10 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液于室溫下以氮氣流揮干，殘渣用流動相100μL復(fù)溶，渦旋混勻5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液適量，進(jìn)樣分析。

2.5 色譜條件

色譜柱：Betasil C18（200 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-水（含0.5%三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.2）（45∶55，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：256 nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL。

2.6 方法學(xué)考察

2.6.1 專屬性 分別取空白血漿、空白血漿+依魯替尼（250 ng/mL）、依魯替尼磷脂復(fù)合物組比格犬給藥后12 h時的血漿樣品各適量，按“2.4”項下方法處理后（空白血漿不加內(nèi)標(biāo)），再按“2.5”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。由圖1可見，內(nèi)標(biāo)和依魯替尼的保留時間分別為7.37、11.66 min，且血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)對待測物的定量分析無明顯干擾，表明本法的專屬性良好。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與定量下限、最低檢測限的考察 精密量取空白血漿270 μL，置于1.5 mL離心管中，分別加入“2.2.1”項下不同質(zhì)量濃度的依魯替尼系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各30 μL，制得質(zhì)量濃度分別為5、10、50、100、500、1 000、5 000 ng/mL的系列含藥血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.5”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以待測物質(zhì)量濃度（x，ng/mL）為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y＝0.007 86x－0.003 91（r＝0.999 8）。結(jié)果，依魯替尼檢測血藥濃度的線性范圍為5～5 000 ng/mL，定量下限為5 ng/mL（信噪比為10）；以信噪比為3測得最低檢測限為1.3 ng/mL。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.6.3 精密度與準(zhǔn)確度試驗 按“2.6.2”項下方法配制同一分析批的依魯替尼定量下限以及低、中、高質(zhì)量濃度（10、100、4 000 ng/mL，下同）血漿樣品各5份，按“2.4”項下方法處理后，進(jìn)樣分析，考察批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度；同法配制3個分析批的定量下限以及低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品，連續(xù)測定3 d，每質(zhì)量濃度平行測定5次，考察批間精密度和準(zhǔn)確度。結(jié)果，批內(nèi)、批間RSD均小于10%，準(zhǔn)確度（檢測值，下同）為98.81%～106.20%，詳見表1。

表1 精密度與準(zhǔn)確度試驗結(jié)果Tab 1 Results of precision and accuracy tests

2.6.4 提取回收率試驗 按“2.6.2”項下方法配制依魯替尼低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.5”項下色譜條件進(jìn)樣分析，得依魯替尼峰面積（A提?。?；另取空白血漿適量，按“2.4”項下方法處理至“揮干”，殘渣加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的依魯替尼標(biāo)準(zhǔn)溶液，混勻，使最終質(zhì)量濃度與前者對應(yīng)，再按“2.5”項下色譜條件進(jìn)樣分析，得依魯替尼峰面積（A未提?。?，提取回收率＝（A提取/A未提?。?00%。每質(zhì)量濃度平行5樣本分析。結(jié)果，低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品的提取回收率分別為（84.36±2.43）%、（79.17±2.39）%、（87.50±2.33）%，RSD分別為2.89%、3.02%、2.67%（n＝5）；內(nèi)標(biāo)的提取回收率為（86.17±1.36）%，RSD為1.82%（n＝5）。

2.6.5 穩(wěn)定性試驗 按“2.6.2”項下方法配制依魯替尼低、中、高質(zhì)量濃度血漿樣品，考察室溫放置3 h、反復(fù)凍融（－20℃至室溫）3次、－20℃冷凍放置3周后再處理以及處理后室溫放置24 h的穩(wěn)定性。每質(zhì)量濃度平行3樣本分析。結(jié)果，在上述條件下，各樣品實測血藥濃度的RSD均小于10%（n＝3），表明其穩(wěn)定性良好，詳見表2。

表2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of stability tests（n＝3）

2.7 藥動學(xué)研究

6只比格犬按“2.3”項下方法分組并給藥，分別于給藥前及給藥后0.017、0.083、0.25、0.5、1、2、4、8、12 h于左前肢靜脈取血2 mL，置于肝素化管中，4 500 r/min離心10 min，分離血漿，并置于－20 ℃保存，待檢。取上述血漿樣品適量，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.5”項下色譜條件進(jìn)樣分析，代入隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算依魯替尼的血藥濃度，并使用DAS 2.1.1軟件繪制平均藥-時曲線，結(jié)果見圖2。

采用DAS 2.1.1軟件處理上述平均藥-時曲線數(shù)據(jù)，計算主要藥動學(xué)參數(shù)和相對生物利用度{F，F(xiàn)＝[（AUC0-12h）依魯替尼磷脂復(fù)合物組/（AUC0-12h）依魯替尼混懸液組]×100%}，結(jié)果見表3。采用SPSS 20.0軟件對兩組比格犬的藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)均以±s表示，組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

由圖2可見，比格犬灌胃依魯替尼磷脂復(fù)合物混懸液后，藥物在體內(nèi)吸收迅速，給藥后約0.25 h即可達(dá)最高血藥濃度，且1 h內(nèi)均維持在較高水平；而灌胃依魯替尼混懸液后，藥物在體內(nèi)吸收較緩慢，給藥后約2 h才達(dá)到峰值。由表3可見，依魯替尼磷脂復(fù)合物組比格犬的cmax、AUC0-12h、AUC0-∞分別為依魯替尼混懸液組的 3.78、2.08、1.74倍，其F為207.99%。與依魯替尼混懸液組比較，依魯替尼磷脂復(fù)合物組比格犬體內(nèi)藥物的cmax、AUC0-12h、AUC0-∞均顯著增加，tmax顯著縮短，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖2 比格犬單次灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復(fù)合物混懸液的平均藥-時曲線（n＝3）Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of ibrutinib in Beagle dogs after single intragastric administration of Ibrutinib suspension and Ibrutinib phospholipid complex（n＝3）

表3 比格犬單次灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復(fù)合物混懸液的主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝3）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of ibrutinib in Beagle dogs after single intragastric administration of Ibrutinib suspension and Ibrutinib phospholipid complex（±s，n＝3）

表3 比格犬單次灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復(fù)合物混懸液的主要藥動學(xué)參數(shù)（±s，n＝3）Tab 3 Main pharmacokinetic parameters of ibrutinib in Beagle dogs after single intragastric administration of Ibrutinib suspension and Ibrutinib phospholipid complex（±s，n＝3）

注：與依魯替尼混懸液組比較，＊P＜0.05Note；vs.Ibrutinib suspension group，＊P＜0.05

組別依魯替尼混懸液組依魯替尼磷脂復(fù)合物組AUC0-∞，ng·h/mL 6 174.32±525.27 10 717.33±897.62＊tmax，h 2.00±0.09 0.25±0.03＊cmax，ng/mL 610.67±21.36 2 308.72±100.41＊AUC0-12 h，ng·h/mL 4 516.67±383.43 9 394.16±874.21＊

3 討論

筆者查閱相關(guān)文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，測定依魯替尼在大鼠血漿中濃度的方法已有相關(guān)報道[9-10]，但尚未見其在比格犬體內(nèi)藥動學(xué)研究的相關(guān)文獻(xiàn)。本研究參考上述報道，對血漿處理方法進(jìn)行了改進(jìn)，最終選擇了操作簡便、重復(fù)性較好的直接蛋白沉淀法。在沉淀試劑的篩選過程中，筆者發(fā)現(xiàn)甲醇的提取回收率最為穩(wěn)定，且處理后內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾較小，故最終選擇甲醇作為蛋白沉淀試劑。同時，本研究采用乙腈-水（含0.5%三乙胺，用冰醋酸調(diào)節(jié)pH至3.2）作為流動相，并通過預(yù)試驗將其等度洗脫的比例確定為45∶55（V/V）。方法學(xué)考察結(jié)果顯示，依魯替尼和內(nèi)標(biāo)可基線分離，且兩者色譜峰的峰形均較好；依魯替尼檢測血藥濃度的線性范圍為5～5 000 ng/mL，批間、批內(nèi)RSD均小于10%，穩(wěn)定性良好，其提取回收率穩(wěn)定（RSD＜5%），表明本研究建立的HPLC法可用于比格犬體內(nèi)依魯替尼血藥濃度的測定。

磷脂復(fù)合物是指在合適溶劑中將藥物和磷脂按一定化學(xué)計量比混合而成的復(fù)合物，可顯著提高藥物的水溶性，并改善其穩(wěn)定性和透膜性，從而提高藥物的生物利用度[11]。依魯替尼在pH 4.5～8.0的水中幾乎不溶（溶解度僅為3 μg/mL），嚴(yán)重影響其在胃腸道中的吸收，故在臨床治療中必須使用大劑量才能保證藥效的充分發(fā)揮[12]。但大劑量的使用可能會增加患者發(fā)生出血、高血壓等多種毒副反應(yīng)的風(fēng)險[4]。將依魯替尼制成磷脂復(fù)合物后，由于磷脂與生物膜的親和性更高，可“帶領(lǐng)”藥物順利穿過胃腸道而被吸收入血，因此顯著增加了依魯替尼的口服吸收程度[13]。藥動學(xué)研究結(jié)果顯示，在分別灌胃依魯替尼混懸液和依魯替尼磷脂復(fù)合物后，藥物在比格犬體內(nèi)的藥動學(xué)行為發(fā)生了明顯變化。其中，依魯替尼磷脂復(fù)合物的吸收速度更快，體內(nèi)血藥濃度在給藥后約0.25 h即達(dá)到了峰值，且其cmax、AUC0-12h、AUC0-∞均顯著高于依魯替尼混懸液組，tmax顯著短于依魯替尼混懸液組，F(xiàn)為207.99%。這提示將依魯替尼制備成磷脂復(fù)合物可加快藥物在體內(nèi)的吸收，并提高其生物利用度。但本研究僅選用了6只比格犬，樣本量偏小，且藥動學(xué)指標(biāo)有限，后續(xù)研究將進(jìn)一步擴大樣本量以減小個體差異，并深入研究依魯替尼磷脂復(fù)合物在比格犬體內(nèi)的代謝過程。

綜上所述，本研究建立的HPLC法操作簡便、專屬性強、靈敏度高，可用于比格犬血漿中依魯替尼質(zhì)量濃度的測定和藥動學(xué)的研究。將依魯替尼制成磷脂復(fù)合物后，其藥動學(xué)參數(shù)變化明顯，藥物吸收明顯加快，生物利用度明顯提高。